法舒地爾對鹽敏感性高血壓大鼠心室重構(gòu)及心肌細胞凋亡的影響研究

漆 秦，王顯利，吳 朝，李 陽，褚 超，廉秋芳

原發(fā)性高血壓是遺傳與環(huán)境因素相互作用的疾病，鹽作為重要的環(huán)境因素之一，一直是人們關(guān)注的熱點。鹽敏感性高血壓是指高鹽攝入引起血壓明顯升高，而限制鹽攝入可使升高的血壓下降。據(jù)統(tǒng)計，高血壓患者約占我國總?cè)丝诘?0%，其中鹽敏感性高血壓約占50%[1-4]。鹽敏感性可能導(dǎo)致血壓波動幅度增大，易對心臟、腦等重要器官造成損傷[4-8]。長期高血壓不僅導(dǎo)致心臟負荷加重，部分心肌丟失或瘢痕形成引起心室重構(gòu)，同時還可能對神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)造成不良影響。因此，有學(xué)者提出利用細胞重塑改善心室重構(gòu)的治療理念[8-10]。RhoA激酶是心腦血管疾病新的治療靶點，而法舒地爾是RhoA激酶抑制劑。XU等[11]研究結(jié)果顯示，法舒地爾可有效緩解心肌梗死，保護心肌組織。王麗君等[12]研究結(jié)果顯示，法舒地爾聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞治療心肌梗死的臨床療效優(yōu)于單純采用干細胞移植和法舒地爾。本研究旨在探討法舒地爾對鹽敏感性高血壓大鼠心室重構(gòu)及心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗于2016年2月—2017年6月在陜西省醫(yī)學(xué)實驗動物中心實驗室完成。選取健康雄性Dahl鹽敏感大鼠69只，平均體質(zhì)量(160±4)g，6周齡，動物合格證號：SCXK(京)：2014 -0004。所有大鼠自北京華阜康生物科技股份有限公司引進后飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中。實驗過程中對動物的處置方式符合動物倫理學(xué)要求。

1.2 主要儀器及試劑 Vev0770TM高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)和RMV707B型高頻超聲探頭購自加拿大VisualSonies公司，MRBP大小鼠無創(chuàng)血壓計/動物無創(chuàng)血壓計購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司，液氮容器購自樂山市東亞機電工貿(mào)有限公司，電泳儀、電泳槽、凝膠玻璃板、固定夾購自北京六一儀器廠，UVP凝膠圖像掃描儀購自美國BIO-RAD公司，Western blot蛋白檢測試劑盒購自美國KPL公司，100 bp DNA ladder購自華美生物工程有限公司，水合氯醛購自中天實驗儀器有限公司，耐熱性Taq DNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司，Masson trichrome staining試劑購自美國Sigma公司，兔抗鼠RhoA基因抗體和兔抗鼠GAPDH多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，VG染色試劑盒購自西安潤德生物技術(shù)有限公司，實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)兩步法試劑盒購自TaKaRa公司，AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自杭州博日科技有限公司。

1.3 分組和建模 采用隨機數(shù)字表法將69只Dahl鹽敏感大鼠分為生理鹽組、高鹽組及法舒地爾組，每組23只。生理鹽組大鼠給予含鹽量為0.3%的正常飼料飼養(yǎng)；高鹽組大鼠給予含鹽量為8%的特制飼料喂養(yǎng)，自由飲水；法舒地爾組大鼠給予含鹽量為8%的特制飼料喂養(yǎng)，自由飲水，建模成功后6 h腹腔注射法舒地爾10 mg/kg，2次/d，連續(xù)治療1周。3組大鼠均飼養(yǎng)6周。采用尾套法測量大鼠收縮壓，儀器為大小鼠無創(chuàng)血壓計/動物無創(chuàng)血壓計，以收縮壓>160 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)定義為鹽敏感性高血壓建模成功。

1.4 方法

1.4.1 超聲檢查 藥物治療結(jié)束后1周，每組隨機選取5只大鼠，采用2%異氟烷麻醉大鼠并將其固定在操作臺上，維持體溫36～38 ℃，待大鼠呼吸、心率平穩(wěn)后定位心臟位置，移動高頻超聲探頭使圖像清晰地呈現(xiàn)在屏幕上。采用高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)檢測大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic cliameter，LVEDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left venticular end systolic diameter，LVESd)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)、左心室射血分數(shù)(left vantiular ejection fraction，LVEF)，并測量前壁厚度、后壁厚度。

1.4.2 HE染色 藥物治療結(jié)束后1周，每組隨機選取5只大鼠，麻醉后處死，取心肌組織浸蠟包埋，通過切片機切片，二甲苯脫蠟后梯度乙醇水合；2 min水洗后加入蘇木素充分染色，15 min后通過乙醇分化5 s，隨后給予氨水反藍10 min，水洗后再將伊紅染液進行切片染色15 min；再次通過梯度乙醇脫水處理，加入二甲苯使其透明，封片后放于光鏡下觀察大鼠心肌細胞形態(tài)。

1.4.3 VG染色法 藥物治療結(jié)束后1周，每組隨機選取5只大鼠，麻醉后處死，取心肌組織，切片后行常規(guī)脫蠟至水，嚴格按照VG染色試劑盒說明書進行操作。每張切片隨機選10個高倍視野(×200)，通過計算機圖像分析系統(tǒng)(XSJ-HS XTJ-30，上海碩光電子科技有限公司)選出(膠原)紅色區(qū)域，計算各張切片膠原容積積分，膠原容積積分=膠原總面積/圖像總面積，每個標本選6張切片計算膠原容積積分并取平均值。

1.4.4 TUNEL法 藥物治療結(jié)束后1周，每組隨機選取5只大鼠，麻醉后處死，取心肌組織，每只大鼠心肌組織切片5個，石蠟切片、常規(guī)脫蠟至水；滴加1滴復(fù)合消化液(蛋白酶K與胃蛋白酶)，25 ℃孵化20 min，洗滌后滴加TUNEL標記反應(yīng)混合液50 μl，在濕盒中37 ℃孵育1 h，滴加POD2轉(zhuǎn)化液50 μl，濕盒37 ℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；蘇木精-伊紅復(fù)染，顯微鏡下可見棕黃色細胞核的細胞為凋亡細胞，計數(shù)凋亡細胞數(shù)量并計算細胞凋亡率。

1.4.5 RT-PCR 藥物治療結(jié)束后1周，每組隨機選取5只大鼠，麻醉后處死，每只大鼠分別取心臟組織100 mg，在液氮中研磨至粉末狀，在每份樣本中加入Trizol裂解液1 ml，常溫下放置10 min，5 000 r/min離心20 min，提取總RNA。提取完成后測定RNA純度，立刻對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，之后放入儀器中行PCR擴增。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物行電泳試驗，采用UVP凝膠進行成像，并檢測灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶GAPDH灰度值的比值作為RhoA激酶mRNA相對表達量。RhoA上游引物為5 ′- AATGTGCCCATCATCCTAGTT -3′，下游引物為5 ′- TGTTTGCCATATCTCTGCCTT -3 ′，擴增片段長度為128 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGA-3′，下游引物為5′-CACAGTCTTCTGAGTGGCA-3′，擴增片段長度為121 bp。

1.4.6 Western blot法 將RT-PCR提取后的剩余物以5 000 r/min離心20 min，提取蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度，對變性后的蛋白進行電泳試驗，然后采用濕轉(zhuǎn)法(14 V恒壓)進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜所需時間為40 min，轉(zhuǎn)膜后采用TBST緩沖液反復(fù)沖洗，然后置于4 ℃條件下封閉，封閉過夜后加入兔抗鼠RhoA基因抗體1∶800，37 ℃搖床孵育2 h，然后用TBST洗膜10 min×3次，再將膜浸入山羊抗兔抗體1∶700里孵育，繼續(xù)在37 ℃搖床孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次。加入DAB顯色，采用Image J軟件定量測定灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶GAPDH灰度值的比值作為RhoA激酶相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 心臟結(jié)構(gòu)及心功能指標 藥物治療結(jié)束后1周，3組大鼠LVEDd、LVESd、LVFS、LVEF、前壁厚度及后壁厚度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。生理鹽組和法舒地爾組大鼠LVEDd、LVESd小于高鹽組，LVFS和LVEF高于高鹽組，前壁厚度和后壁厚度大于高鹽組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；法舒地爾組大鼠LVEDd、LVESd、前壁厚度及后壁厚度小于生理鹽組，LVFS和LVEF高于生理鹽組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2 心肌細胞形態(tài) 生理鹽組大鼠心肌細胞排列有序，心肌間質(zhì)無炎性細胞浸潤及纖維化瘢痕形成；高鹽組大鼠心肌細胞排列紊亂，巨噬細胞浸潤明顯增多同時伴有明顯纖維化重構(gòu)。與高鹽組相比，法舒地爾組大鼠盡管有炎性細胞浸潤，但心肌細胞排列有序且無纖維化瘢痕組織形成，心肌纖維化重構(gòu)程度較輕，見圖1。

2.3 膠原容積積分 藥物治療結(jié)束后1周，生理鹽組大鼠膠原容積積分為(0.17±0.06)%，高鹽組為(0.32±0.07)%，法舒地爾組為(0.23±0.05)%。3組大鼠膠原容積積分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.451，P=0.027)。生理鹽組和法舒地爾組大鼠膠原容積積分低于高鹽組，法舒地爾組大鼠膠原容積積分高于生理鹽組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 細胞凋亡率 藥物治療結(jié)束后1周，生理鹽組大鼠細胞凋亡率為(0.33±0.06)%，高鹽組為(17.03±4.27)%，法舒地爾組為(7.35±1.43)%。3組大鼠心肌細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.455，P=0.019)。生理鹽組和法舒地爾組大鼠心肌細胞凋亡率低于高鹽組，法舒地爾組大鼠心肌細胞凋亡率高于生理鹽組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

2.5 RhoA激酶表達情況 藥物治療結(jié)束后1周，3組大鼠RhoA激酶mRNA和RhoA激酶相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。生理鹽組和法舒地爾組大鼠RhoA激酶mRNA和RhoA激酶相對表達量低于高鹽組，法舒地爾組大鼠RhoA激酶mRNA和RhoA激酶相對表達量高于生理鹽組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2，見圖3、4)。

Table2 Comparison of relative expression quantity of RhoA kinase mRNA and RhoA kinase among the three groups

組別例數(shù)RhoA激酶mRNARhoA激酶生理鹽組50.28±0.04a0.61±0.09a高鹽組50.87±0.091.64±0.18法舒地爾組50.52±0.08ab1.14±0.13abF值22.58718.785P值0.0240.028

注：與高鹽組比較，aP<0.05；與生理鹽組比較，bP<0.05

表1 3組大鼠心臟結(jié)構(gòu)及心功能指標比較

注：LVEDd=左心室舒張末期內(nèi)徑，LVESd=左心室收縮末期內(nèi)徑，LVFS=左心室短軸縮短率，LVEF=左心室射血分數(shù)；與高鹽組比較，aP<0.05；與生理鹽組比較，bP<0.05

注：A為生理鹽組，B為高鹽組，C為法舒地爾組

圖1 3組大鼠心肌細胞形態(tài)(HE染色，×40)

Figure1 Myocardial cellular morphology in the three groups

注：A為生理鹽組，B為高鹽組，C為法舒地爾組

圖2 3組大鼠心肌細胞凋亡情況(HE染色，×200)

Figure2 Apoptosis of myocardial cells in the three groups

圖3 RhoA激酶mRNA電泳結(jié)果

圖4 RhoA激酶電泳結(jié)果

3 討論

近年來，隨著人們生活水平提高及生活方式改變，我國高血壓發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡趨于年輕化。高血壓可導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生風(fēng)險升高，尤其是鹽敏感性高血壓，是患者繼發(fā)心腦血管疾病的重要原因之一。既往研究結(jié)果顯示，與鹽不敏感性高血壓相比，鹽敏感性高血壓患者并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險更高[13-14]。目前，鹽敏感性高血壓與心腦血管疾病的關(guān)系一直是研究重點，但其關(guān)系并未完全闡明。越來越多的研究證實，鹽敏感性高血壓會導(dǎo)致心臟功能障礙，且隨著病情惡化心肌部分功能喪失，心肌發(fā)生纖維化，可嚴重威脅患者的生命安全[15]。

心室重構(gòu)是多種心血管疾病的重要病理改變，主要組織學(xué)表現(xiàn)是心室腔擴大、進行性心功能減低、心肌細胞外膠原沉積、炎性細胞浸潤等，可引起心力衰竭，進而嚴重威脅患者的生命安全。既往研究結(jié)果顯示，鹽敏感性高血壓誘發(fā)的心肌纖維化常伴有心肌組織炎性反應(yīng)，而炎性反應(yīng)是心肌纖維化的始發(fā)環(huán)節(jié)和加劇因素[16]。本研究結(jié)果顯示，藥物治療結(jié)束后1周，生理鹽組和法舒地爾組大鼠LVEDd、LVESd小于高鹽組，LVFS和LVEF高于高鹽組，前壁厚度和后壁厚度大于高鹽組，膠原容積積分和心肌細胞凋亡率低于高鹽組；法舒地爾組大鼠LVEDd、LVESd、前壁厚度及后壁厚度小于生理鹽組，LVFS、LVEF、膠原容積積分及心肌細胞凋亡率高于生理鹽組；高鹽組大鼠心肌細胞排列紊亂，巨噬細胞浸潤明顯增多同時伴有明顯纖維化重構(gòu)，與高鹽組相比，法舒地爾組大鼠盡管有炎性細胞浸潤，但心肌細胞排列有序且無纖維化瘢痕組織形成，心室重構(gòu)程度較輕；提示鹽敏感性高血壓大鼠表現(xiàn)為心室腔擴大、心功能減低、心肌細胞外膠原沉積等，存在心室重構(gòu)且心肌細胞凋亡率較高，而法舒地爾可有效抑制鹽敏感性高血壓大鼠心室重構(gòu)及心肌細胞凋亡。

RhoA激酶是一種與心臟功能損傷相關(guān)的蛋白質(zhì)，其與心肌損傷后重構(gòu)關(guān)系密切，可參與心臟功能衰竭等過程[16-17]。病理生理學(xué)研究顯示，RhoA激酶可參與心肌損傷過程，而抑制RhoA激酶可導(dǎo)致心肌生成一氧化氮減少，進而有效抑制心肌損傷[18]。法舒地爾是一種具有廣泛藥理作用的新型藥物，其分子結(jié)構(gòu)為5-異喹啉磺酰胺衍生物，是一種RhoA激酶抑制劑，可通過增加肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性而擴張血管，降低內(nèi)皮細胞張力，改善腦組織微循環(huán)；同時還可拮抗炎性因子，促進神經(jīng)再生，進而緩解心肌損傷[19-20]。本研究結(jié)果顯示，生理鹽組和法舒地爾組大鼠RhoA激酶mRNA和RhoA 激酶相對表達量低于高鹽組，法舒地爾組大鼠RhoA激酶mRNA和RhoA激酶相對表達量高于生理鹽組，提示鹽敏感性高血壓大鼠RhoA激酶表達水平升高，而法舒地爾可抑制鹽敏感性高血壓大鼠RhoA激酶表達。

綜上所述，法舒地爾能有效抑制鹽敏感性高血壓大鼠心室重構(gòu)及心肌細胞凋亡，分析其機制可能與降低RhoA激酶表達有關(guān)。

作者貢獻：廉秋芳進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理；褚超進行研究的實施與可行性分析；吳朝、李陽進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；漆秦進行結(jié)果分析與解釋，撰寫論文；吳朝進行論文的修訂； 王顯利負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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