人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、鑒定方法及其治療難治性免疫性血小板減少癥的有效性及安全性研究

黃斯勇，白喜龍 ，伍艷蘭，胡 彬，王剛鋒，王 穎，張 蓉，羅紅香，徐 靜，梁英民

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是從人臍帶華通膠中分離出來的一種基質(zhì)細(xì)胞，在疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為國內(nèi)外研究熱點之一。免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是一種自身免疫系統(tǒng)疾病，其主要發(fā)病機(jī)制是機(jī)體對自身抗原的免疫失耐受，導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的血小板破壞增多及巨核細(xì)胞生成血小板減少，是臨床常見的出血性疾病之一。目前，臨床治療ITP以皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及脾切除為主，但復(fù)發(fā)率較高，且長期使用皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)較多，尤其是難治性ITP，尚缺乏有效的治療手段[1-2]。近年有研究顯示，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)性，為ITP的治療提供了新思路[3]。本研究旨在探討hUC-MSCs分離、鑒定方法及其治療難治性ITP的有效性及安全性，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年12月—2017年7月西安高新醫(yī)院收治的難治性ITP患者6例，均符合ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[2],且經(jīng)糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白、免疫抑制劑或促血小板生成素等治療無效、復(fù)發(fā)，或不能耐受免疫抑制劑維持治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重心、肺、腎等重要臟器疾病者；(2)合并3級及以上心肺功能不全者；(3)對間充質(zhì)干細(xì)胞或制備試劑過敏者；(4)合并腫瘤或腫瘤高危風(fēng)險者。本研究經(jīng)西安高新醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者及其家屬自愿參加并在充分了解治療方案前提下簽署知情同意書。

1.2 hUC-MSCs分離、鑒定方法

1.2.1 主要試劑 DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國Thermo Fisher Scientific公司)、胎牛血清(美國Gemini公司)、胰蛋白酶消化液、左旋谷氨酰胺、β-巰基乙醇(β-ME)、二甲基亞砜(DMSO)、青鏈霉素混合液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、丁基羥基茴香醚(BHA)、Forskolin腺苷酸環(huán)化酶激活劑(美國Aladdin公司)、全反式維甲酸(美國Sigma公司)、氫化可的松、胰島素、氯化鉀、氯化鈉、HEPES、氯化鎂、氯化鈣、Glucose、Glycine(北京索萊寶科技有限公司)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、B-27添加劑(美國Gibco公司)。

1.2.2 hUC-MSCs組織來源 臍帶取自足月剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦，且產(chǎn)婦乙型肝炎病毒(HBV)抗原、抗丙型肝炎病毒(HCV)抗體、抗人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體、抗梅毒螺旋體抗體、支原體、抗EB病毒抗體、抗巨細(xì)胞病毒抗體等檢測均為陰性。經(jīng)產(chǎn)婦或其親屬授權(quán)同意并簽署知情同意書，留取新鮮臍帶，并立即放入盛有DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基的容器中密封。在容器外貼上標(biāo)簽，注明產(chǎn)婦姓名、住院號和新生兒出生時間、性別、體質(zhì)量。

1.2.3 hUC-MSCs分離和培養(yǎng) 由陜西圓夢生命科學(xué)研究院干細(xì)胞與轉(zhuǎn)化研究中心依據(jù)《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則(試行)》《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》《細(xì)胞移植治療技術(shù)規(guī)范》(征求意見稿)等相關(guān)法律法規(guī)要求，參照文獻(xiàn)[4]，采用酶消化法在無菌條件下于超凈臺內(nèi)用含100 U青鏈霉素混合液的PBS充分沖洗臍帶，盡量清除殘留積血。用無菌組織剪將臍帶剪成1～2 mm3大小的組織塊，隨后將組織塊懸液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，加入終濃度為0.1%的膠原酶Ⅱ，37 ℃條件下消化1 h。將組織塊懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，室溫條件下2 000 r/min離心30 min，棄去上清液，采用PBS重懸組織塊，加入終濃度為0.125%胰蛋白酶消化液，37 ℃條件下消化30 min，隨后加入10%胎牛血清，終止消化。消化混合物經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，濾去未完全消化組織，將濾液收集至離心管中，室溫下2 000 r/min離心20 min，棄去上清液，收集細(xì)胞。采用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基重懸分離細(xì)胞，反復(fù)吹打混勻，計數(shù)細(xì)胞。將細(xì)胞濃度調(diào)整為106/cm2，接種于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后棄去舊培養(yǎng)基，用無菌PBS輕柔、緩慢沖洗細(xì)胞生長表面，去除未貼壁細(xì)胞，更換新鮮DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基。之后每3 d更換1次培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡下觀察各階段細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照記錄。待貼壁細(xì)胞生長達(dá)80～90%融合度時用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代，獲得原代細(xì)胞。

1.2.4 hUC-MSCs免疫表型鑒定 收集第3代hUC-MSCs，采用含0.1%胎牛血清的PBS洗滌1次，室溫條件下1 000 r/min離心5 min，棄去上清。用含0.1%胎牛血清的PBS重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為106/ml，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管，每個流式管加入100 μl細(xì)胞懸液。分別加入PE標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體CD73、CD90、CD105及APC標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體CD3、CD11b、CD19，同時設(shè)抗PE小鼠IgG1和抗APC小鼠IgG1為同型對照。加入抗體濃度為100∶5，充分振蕩細(xì)胞懸液，避光4 ℃孵育30 min。經(jīng)BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測，采用Cellquest Pro軟件分析結(jié)果。

1.2.5 成骨誘導(dǎo)分化實驗 將生長狀態(tài)良好的第3代hUC-MSCs以5×104/孔接種于6孔板中，應(yīng)用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)12～18 h。待細(xì)胞完全貼壁后更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、10%FBS、100 U青霉素/鏈霉素、1 mM丙酮酸鈉、2 mM左旋谷氨酰胺、1 μM地塞米松、10 mM β-磷酸甘油和50 μg/ml抗壞血磷酸鹽)。每隔3 d更換1次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)18 d，對細(xì)胞行茜素紅染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞，并拍照記錄。以茜素紅染色呈紅色為陽性。

1.2.6 成脂誘導(dǎo)分化實驗 將生長狀態(tài)良好的第3代hUC-MSCs以5×104/孔接種于6孔板中，應(yīng)用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)12～18 h。待細(xì)胞完全貼壁后更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 U青霉素/鏈霉素、1 mM丙酮酸鈉、2 mM左旋谷氨酰胺、1 μM地塞米松、0.5 mM IBMX、0.5 mM消炎痛和10 μM膜島素)。每3 d更換1次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)21 d，行油紅O染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞，并拍照記錄。以油紅O染色后觀察到脂滴為陽性。

1.3 治療方法 6例患者均輸注hUC-MSCs(1×106/kg)，輸注后1個月如患者血小板計數(shù)(PLT)≤50×109/L可重復(fù)輸注1次。輸注途徑為通過輸血器靜脈輸注，輸注前給予異丙嗪、葡萄糖酸鈣預(yù)防過敏，輸液速度約為60滴/min，輸注24 h內(nèi)嚴(yán)密觀察患者生命體征變化。

1.4 觀察指標(biāo) 所有患者至少隨訪3個月，隨訪截至2017-11-01，觀察臨床療效、復(fù)發(fā)情況及治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況。完全反應(yīng)：治療后PLT≥100×109/L且無出血；有效：治療后PLT≥30×109/L且較基礎(chǔ)PLT增加≥2倍，無出血；無效：治療后PLT<30×109/L或較基礎(chǔ)PLT增加<2倍或有出血；復(fù)發(fā)：治療有效后，PLT降至30×109/L以下或是基礎(chǔ)PLT的2倍以下或出現(xiàn)出血癥狀[2]。需要注意的是評價臨床療效時需至少檢測2次PLT，且兩次檢測時間至少間隔7 d；評價病情是否復(fù)發(fā)時需至少檢測2次PLT，且兩次檢測時間至少間隔1 d?？傆行?(完全反應(yīng)+有效)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs形態(tài)學(xué)鑒定 采用酶消化法分離、培養(yǎng)hUC-MSCs，可見原代細(xì)胞貼壁生長并逐漸融合成片狀，形態(tài)均一，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞類似于成纖維細(xì)胞，成長梭形流水狀貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)良好，并隨著細(xì)胞傳代，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化(見圖1)。

2.2 hUC-MSCs免疫表型 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，hUC-MSCs高表達(dá)CD73、CD90、CD105，表達(dá)量均>98.0%；不表達(dá)或低表達(dá)CD3、CD11b、CD19(見圖2)。

2.3 hUC-MSCs分化能力 正常hUC-MSCs呈長橢圓形(見圖3A)；第3代hUC-MSCs成骨誘導(dǎo)18 d，細(xì)胞聚集匯合且呈多層重疊生長，形成圓形鈣化結(jié)節(jié)沉積，周圍折光性增強(qiáng)，茜素紅染色著色呈紅色(見圖3B)；第3代成脂誘導(dǎo)21 d，油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察hUC-MSCs形成較大的脂滴(見圖3C)。

注：A為放大40倍，B為放大100倍

圖1 倒置相差顯微鏡下hUC-MSCs形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

Figure1 Morphological features of hUC-MSCs under inverted phase contrast microscope

圖2 hUC-MSCs免疫表型表達(dá)情況

注：A為正常人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)(倒置相差顯微鏡，×100)；B為hUC-MSCs成骨分化(茜素紅染色，×100)；C為hUC-MSCs成脂分化(油紅O染色，×100)

圖3 hUC-MSCs分化能力

Figure3 Differentiation ability of hUC-MSCs

2.4 臨床特征及臨床療效 本組患者中男2例，女4例；年齡42～73歲，中位年齡63歲；前期治療包括潑尼松(Pred)、靜脈注射丙種球蛋白(IVIg)、重組人促血小板生成素(rhTPO)、環(huán)孢素(CyA)、地塞米松(Dex)，詳見表1。輸注hUC-MSCs后，完全反應(yīng)3例，有效2例，無效1例，總有效率為5/6；中位隨訪時間為5個月，隨訪期間復(fù)發(fā)1例，再次輸注hUC-MSCs后仍有效。

表1 6例患者臨床特征

注：hUC-MSCs=人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，PLT=血小板計數(shù)，Pred=潑尼松，IVIg=靜脈注射丙種球蛋白，rhTPO=重組人促血小板生成素，CyA=環(huán)孢素，Dex=地塞米松

表2 難治性ITP患者h(yuǎn)UC-MSCs輸注前后外周淋巴細(xì)胞亞群比較Table 2 Comparison of peripheral lymphocyte subsets before and after intravenous infusion of hUC-MSCs in refractory ITP patients

注：NK細(xì)胞=自然殺傷細(xì)胞，Treg細(xì)胞=輔助性T細(xì)胞

2.6 不良反應(yīng) 本組患者治療期間2例出現(xiàn)輕度發(fā)熱，對癥處理后1～4 h完全緩解，無其他不適感；1例患者輸注前出現(xiàn)激素依賴，Pred(50 mg/d)維持治療過程中出現(xiàn)腹瀉、肺部感染，輸注后第10天原有肺部感染加重伴氣喘，后經(jīng)支氣管鏡肺泡灌洗和病毒DNA定量檢測證實為巨細(xì)胞病毒性肺炎，經(jīng)抗病毒治療后痊愈，停用激素治療后PLT維持正常至隨訪結(jié)束；其余患者h(yuǎn)UC-MSCs輸注后一般狀況良好，生命體征平穩(wěn)，血生化檢查等均未發(fā)生明顯異常。

3 討論

1968年，F(xiàn)RIEDENSTEIN等[5]首次報道骨髓標(biāo)本中小部分貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)過程中能分化成類似骨、軟骨集落，并將之稱為骨髓多能間充質(zhì)干細(xì)胞。1997年，PROCKOP等[6]成功分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)其具有多向分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞和成肌細(xì)胞等。間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層，可從脂肪、臍血、羊水、牙體等組織中分離出來。足月產(chǎn)胎兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞含量豐富，羊膜、華通膠、臍血和臍血管內(nèi)皮下內(nèi)膜均可分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，而臍帶華通膠中富含的基質(zhì)細(xì)胞即hUC-MSCs[7]。既往研究結(jié)果顯示，顯微鏡下hUC-MSCs呈成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞質(zhì)豐富，具有貼壁生長特性，增殖率較高，表面均表達(dá)CD44、CD73、CD90和CD105，不表達(dá)CD34和CD45[8]，具有分泌血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子1和肝細(xì)胞生長因子等能力[9]，在不同誘導(dǎo)條件下可分化為骨、軟骨和脂肪細(xì)胞，在體外或體內(nèi)均具有低免疫原性，異體移植后不易引起免疫排斥反應(yīng)。

近年來，隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞研究的不斷深入及臨床治療需要，國際間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會對人來源間充質(zhì)干細(xì)胞提出最低鑒定標(biāo)準(zhǔn)：(1)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞必須具備對塑料底物的貼附特性；(2)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測間充質(zhì)干細(xì)胞CD105、CD73、CD90陽性表達(dá)率≥95%，且CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、人類白細(xì)胞抗原-DR(HLA-DR)陰性表達(dá)率≥98%；(3)在體外通過標(biāo)準(zhǔn)方法誘導(dǎo)，間充質(zhì)干細(xì)胞必須能分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞[10]。筆者所在醫(yī)院經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，并經(jīng)產(chǎn)婦或其親屬授權(quán)同意，留取足月剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦的臍帶，依據(jù)《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則(試行)》《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》《細(xì)胞移植治療技術(shù)規(guī)范》(征求意見稿)等相關(guān)法律法規(guī)要求，在無菌條件下采用組織塊法分離培養(yǎng)，得到類似于成纖維細(xì)胞、成長梭形流水狀貼壁生長的原代細(xì)胞，并隨著細(xì)胞傳代，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，hUC-MSCs高表達(dá)CD73、CD90、CD105，表達(dá)量均>98%；不表達(dá)或低表達(dá)CD3、CD11b、CD19，符合國際間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會制定的間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。本研究成骨、成脂誘導(dǎo)分化實驗結(jié)果顯示，第3代hUC-MSCs成骨誘導(dǎo)18 d，細(xì)胞聚集匯合且呈多層重疊生長，形成圓形鈣化結(jié)節(jié)沉積，周圍折光性增強(qiáng)，茜素紅染色呈紅色，提示hUC-MSCs可向成骨細(xì)胞分化；第3代成脂誘導(dǎo)21 d，油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察hUC-MSCs形成較大脂滴，提示hUC-MSCs可向脂肪細(xì)胞分化。本研究結(jié)果提示，陜西圓夢生命科學(xué)研究院干細(xì)胞與轉(zhuǎn)化研究中心分離的細(xì)胞是hUC-MSCs，為下一步臨床試驗奠定了堅實基礎(chǔ)。

大量臨床研究和動物實驗證實，hUC-MSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病、肌肉變性疾病、肝臟疾病及慢性疼痛等的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[11]。hUC-MSCs具有獨特的免疫調(diào)節(jié)能力、較強(qiáng)的免疫抑制性及低免疫原性，對適應(yīng)性免疫的抑制作用主要表現(xiàn)為對T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的免疫抑制，對固有免疫的抑制作用主要表現(xiàn)為對單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞的免疫抑制[12]。

ITP的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制與體液免疫異常和細(xì)胞免疫異常均密切相關(guān)。既往研究結(jié)果顯示，50%～70%的ITP患者可檢測到血小板自身抗體，大多數(shù)ITP患者的血小板相關(guān)抗體 IgG(PAIgG)水平升高，且其水平與血小板壽命呈負(fù)相關(guān)。CHANG等[13]研究表明，ITP患者血小板自身抗體產(chǎn)生受T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子調(diào)控。SEMPLE等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Th1輔助細(xì)胞可增強(qiáng)抗血小板自身免疫反應(yīng)，而ITP患者Th1/Th2細(xì)胞明顯升高，下調(diào)Th1/Th2細(xì)胞可預(yù)防ITP的發(fā)生，并有助于控制ITP病情。另有研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者T淋巴細(xì)胞凋亡受限，可減少自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞清除率，從而產(chǎn)生持續(xù)的免疫效應(yīng)，且T細(xì)胞可抑制巨核細(xì)胞凋亡，減少血小板釋放[15-16]。目前，NK細(xì)胞對ITP發(fā)生、發(fā)展的影響尚未明確，可能既有保護(hù)作用，也有破壞作用。MA等[17]通過hUC-MSCs與ITP患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和骨髓單個核細(xì)胞(BM-MNC)共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs可抑制ITP患者T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖，減少自體血小板破壞，促進(jìn)血小板生成，并逆轉(zhuǎn)巨核細(xì)胞功能障礙。徐淑芬等[18]對12例難治性ITP患者輸注hUC-MSCs，每次輸注(3～5)×107個細(xì)胞，1次/周，共治療2～3個療程，4例患者完全反應(yīng)，4例患者有效，總有效率為8/12。FANG等[19]應(yīng)用脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，AMSC)治療7例成年ITP患者，移植細(xì)胞2.0×106/kg，未見明顯不良反應(yīng)，治療后所有患者PLT有所升高，4例完全反應(yīng)，且移植后Thl/Th2細(xì)胞趨向平衡。

綜上所述，采用酶消化法能有效分離、培養(yǎng)hUC-MSCs，流式細(xì)胞術(shù)及成骨、成脂誘導(dǎo)分化實驗?zāi)苡行цb定hUC-MSCs分化能力，且hUC-MSCs治療難治性ITP近期療效較好，不良反應(yīng)輕微；但本研究樣本量較小且未進(jìn)行隨機(jī)對照試驗，因此hUC-MSCs最佳輸注途徑、用量、療程等問題還需進(jìn)一步深入探討。

作者貢獻(xiàn)：梁英民進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；黃斯勇、白喜龍進(jìn)行研究的實施與可行性分析；伍艷蘭、胡彬、王穎、徐靜進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；黃斯勇、王剛鋒進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；黃斯勇、伍艷蘭負(fù)責(zé)撰寫論文；王穎進(jìn)行論文的修訂；張蓉、羅紅香負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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