丹皮酚對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)骨髓來源巨噬細(xì)胞功能的影響

陳筑 宿凌愷

1.貴陽市口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，遵義醫(yī)學(xué)院附屬貴陽口腔醫(yī)院，貴陽 550002；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，杭州 310000

丹皮酚對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)骨髓來源巨噬細(xì)胞功能的影響

陳筑1宿凌愷2

1.貴陽市口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，遵義醫(yī)學(xué)院附屬貴陽口腔醫(yī)院，貴陽 550002；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，杭州 310000

目的 觀察丹皮酚對(duì)牙齦卟啉單胞菌作用下對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMM）炎性因子分泌及向破骨細(xì)胞分化能力的影響，并探討其作用機(jī)制。方法體外分離獲得小鼠生長(zhǎng)良好的BMM，加入不同濃度丹皮酚溶液處理1 h，再加入牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行24 h誘導(dǎo)刺激。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白程序性死亡分子配體1（PD-L1）的表達(dá)量，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）及白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平；在核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）刺激后的BMM中加入不同濃度的丹皮酚溶液處理1 h后，加入牙齦卟啉單胞菌刺激，采用抗酒石酸性磷酸酶（TRAP）染色觀察破骨細(xì)胞形成情況，Western blot檢測(cè)破骨細(xì)胞形成相關(guān)蛋白TRAP和核因子κB受體活化因子（RANK）的表達(dá)。結(jié)果丹皮酚在10～50 μmol·L-1的范圍內(nèi)，對(duì)BMM無毒性作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示丹皮酚可以抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá)，并存在劑量依賴效應(yīng)。ELISA實(shí)驗(yàn)證明丹皮酚能以劑量依賴性方式抑制BMM釋放TNF-α、IL-1β及IL-6（P＜0.01）。牙齦卟啉單胞菌可以明顯誘導(dǎo)BMM分化形成破骨細(xì)胞；TRAP染色顯示丹皮酚各濃度組能抑制BMM向破骨細(xì)胞分化；Western blot結(jié)果顯示丹皮酚抑制TRAP和RANK表達(dá)且存在劑量依賴效應(yīng)。結(jié)論丹皮酚可以劑量依賴方式抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的BMM炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌及其向破骨細(xì)胞分化的能力。

丹皮酚； 牙齦卟啉單胞菌； 骨髓來源巨噬細(xì)胞； 破骨細(xì)胞； 炎癥； 分化

慢性牙周炎是導(dǎo)致成人失牙的最常見的慢性感染性炎癥疾病[1]。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是牙周炎的主要致病菌，被認(rèn)為是牙周毒力最強(qiáng)的致病菌之一。牙齦卟啉單胞菌能產(chǎn)生大量毒力因子，參與牙周炎發(fā)生、發(fā)展及牙周組織的破壞過程[2-3]。在慢性牙周炎組織中，巨噬細(xì)胞在宿主免疫反應(yīng)中擔(dān)當(dāng)重要作用，具有趨化作用，并能集中在炎癥部位，發(fā)揮強(qiáng)大的抗原呈遞和吞噬作用。有報(bào)道顯示牙齦卟啉單胞菌可以激活宿主免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生促炎癥因子分泌，如腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1及IL-6等，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性和組織損傷性；并在殺死病原體同時(shí)，也導(dǎo)致牙周結(jié)締組織損傷和牙槽骨吸收[4]。正常生理狀態(tài)下，牙槽骨的骨改建是一終身動(dòng)態(tài)且和諧的重塑過程，由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的骨形成和骨吸收完成。其中破骨細(xì)胞是人體內(nèi)唯一具有吸收骨質(zhì)功能的細(xì)胞，是一種多核的巨核細(xì)胞，來源破骨前體細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞。慢性牙周炎主要臨床特征為牙槽骨吸收，即有過量的破骨細(xì)胞形成，骨吸收多于骨形成，最終導(dǎo)致牙槽骨吸收，牙齒脫落。因此，如何控制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及其過度向破骨細(xì)胞分化，是減少牙周組織破壞的關(guān)鍵。

丹皮酚（paeonol）是從牡丹根皮及蘿摩科徐長(zhǎng)卿提取的主要活性成分，具有抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜解痙、退熱止痛等藥理作用[5]。抗炎方面，丹皮酚能夠下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)；丹皮酚還可抑制脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎性因子分泌。此外，丹皮酚能抑制由核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成[6]。然而，目前其在抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的牙周炎癥反應(yīng)的作用報(bào)道較少。因此，本研究通過觀察丹皮酚作用下骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMM）分泌和表達(dá)細(xì)胞炎性因子及向破骨細(xì)胞形成的影響，為丹皮酚在牙周炎治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)），丹皮酚、淋巴細(xì)胞分離液Ficoll、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma公司，美國(guó)），抗小鼠程序性死亡分子配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）流式抗體（Santa公司，美國(guó)），小鼠TNF-α、IL-1β及IL-6酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（Bioscience公司，美國(guó)）。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌株（由美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)牙學(xué)院張平教授惠贈(zèng)）接種于富胰酪胨瓊脂平板（含有5%去纖維蛋白綿羊血、1%含酵母提取物、5 μg·mL-1氯化血紅素、1 μg·mL-1甲萘醌），37 ℃厭氧（10%H2、2%CO2和85%N2）培養(yǎng)5～7 d，生化鑒定、傳代。細(xì)菌收獲，離心，洗滌。利用分光光度計(jì)在580 nm波長(zhǎng)檢測(cè)細(xì)菌光密度值（optiacl density，OD），以確定細(xì)菌總數(shù)。

1.3 細(xì)胞獲取

本實(shí)驗(yàn)選用8～10周齡雌性C57BL/6小鼠（獲得美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)），斷頸處死。無菌條件下去除鼠股骨和脛骨游離附著軟組織。切斷長(zhǎng)骨兩端，使用裝有α-10的25號(hào)注射針反復(fù)沖洗骨髓。通過機(jī)械分散法將骨髓細(xì)胞充分打散，培養(yǎng)在加濕7.5%CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃過夜。次日，收獲非貼壁細(xì)胞，利用Ficoll提取試劑盒（分離淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞），獲得破骨細(xì)胞前體細(xì)胞。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMM中PD-L1的表達(dá)

將收獲的前體細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中，按照相應(yīng)處理進(jìn)行分組，對(duì)照組：不加刺激；陽性刺激組：直接加牙齦卟啉單胞菌刺激，其感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=10；模型組：不同濃度（10、30和50 μmol·L-1）的丹皮酚預(yù)處理1 h，加入牙齦卟啉單胞菌（MOI=10）。

將各組細(xì)胞分別用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）緩沖液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為每100 μL FACS緩沖液中含1× 106個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行抗體孵育。每組細(xì)胞中分別加入0.5 μL PE標(biāo)記抗小鼠PD-L1單克隆抗體，避光條件下37 ℃孵育0.5 h。再用FACS緩沖液洗滌2次，重懸于300 μL FACS緩沖液中，上流式細(xì)胞儀BDcaliber檢測(cè)BMMs細(xì)胞中PD-L1陽性表達(dá)百分率。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定細(xì)胞上清液

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，以濃度為每毫升8×103個(gè)接種96孔板，待生長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)按1.4中的分組給藥刺激后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。按ELISA試劑盒說明，分別測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度。

1.6 破骨細(xì)胞培養(yǎng)及染色

細(xì)胞模型處理?xiàng)l件和藥物濃度依據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]。按濃度為每毫升5×104個(gè)將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在RANKL和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）刺激后的BMM中，按1.4分組情況，加入不同濃度的丹皮酚溶液處理1 h后，加入MOI=50的牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行刺激，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成。4 d后，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)組以前操作步驟進(jìn)行TRAP染色。

1.7 Western blot檢測(cè)

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，利用蛋白酶抑制劑和RIPA裂解混合液（1︰100）提取蛋白質(zhì)，BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，將各組蛋白按相同濃度進(jìn)行變性處理，條件為95 ℃下煮沸5 min。配膠上樣后，凝膠電泳。半干法轉(zhuǎn)膜，將樣本轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h PVDF膜，分別孵育于抗小鼠核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）和TRAP的兔抗小鼠單克隆一抗中，4 ℃搖床過夜。再在室溫條件下孵育在羊抗兔IgG二抗中1 h，TBST洗膜5次，每次5 min。電化學(xué)發(fā)光（electrochemilu minescence，ECL）液發(fā)光后，暗室曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料參數(shù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩樣本t檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)BMM表達(dá)PD-L1的影響

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，牙齦卟啉單胞菌作用BMM細(xì)胞24 h后，細(xì)胞PD-L1蛋白顯著上升；同陽性刺激組相比，濃度為10、30和50 μmol·L-1的丹皮酚溶液呈濃度依賴性抑制牙齦卟啉單胞菌上調(diào)PD-L1蛋白的水平，表明丹皮酚可能通過抑制PD-L1激活來減輕牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的BMM細(xì)胞炎癥反應(yīng)。而不同濃度的丹皮酚單獨(dú)處理后，對(duì)PD-L1的表達(dá)影響較小（圖1）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMM表面PD-L1的陽性表達(dá)率Fig1 The expression of PD-L1 in the BMM by flow cytometry

2.2 丹皮酚對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)BMM細(xì)胞炎性因子分泌的影響

在陽性刺激組中，牙齦卟啉單胞菌作用BMM 24 h后，細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高（P＜0.01）。而在模型組中，分別加入10、30和50 μmol·L-1丹皮酚后，各濃度組呈濃度依賴性抑制BMM分泌細(xì)胞炎性因子，IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），表明丹皮酚對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的BMM細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用。為確定丹皮酚單獨(dú)作用BMM是否會(huì)產(chǎn)生炎性刺激，在BMM中加入不同濃度丹皮酚溶液后，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α水平較空白對(duì)照組無明顯差異（P＜0.05），表明丹皮酚在該濃度范圍作用24 h對(duì)BMM無顯著炎癥反應(yīng)（表1）。

表1 各組細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較Tab1 Expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α in different groups cells supernatant ng·L-1,±s

表1 各組細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較Tab1 Expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α in different groups cells supernatant ng·L-1,±s

注：**與陽性刺激組比較，P＜0.01；***與陽性刺激組比較，P＜0.001。

組別IL-1βIL-6TNF-α對(duì)照組41.86±10.010556.7±27.85027.03±13.050 10 μmol·L-1丹皮酚對(duì)照組36.51±9.590526.0±2.96016.88±6.095 30 μmol·L-1丹皮酚對(duì)照組54.41±8.326481.2±4.4626.55±0.608 50 μmol·L-1丹皮酚對(duì)照組189.80±56.230447.2±3.25614.93±1.994陽性刺激組906.20±22.9307 172.0±25.0001 319.00±27.370牙齦卟啉單胞菌+10 μmol·L-1丹皮酚組34.48±26.310***4 977.0±72.160**621.10±85.850***牙齦卟啉單胞菌+30 μmol·L-1丹皮酚組48.09±12.380***2 637.0±138.200***267.10±10.670***牙齦卟啉單胞菌+50 μmol·L-1丹皮酚組53.61±3.067***872.8±26.610***277.90±53.680***

2.3 丹皮酚對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)BMM分化破骨細(xì)胞能力的影響

對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色及計(jì)數(shù)。用RANKL預(yù)處理細(xì)胞24 h后，在培養(yǎng)基中去除，加入牙齦卟啉單胞菌刺激4 d后，大量破骨細(xì)胞形成。同陽性刺激組相比，10、30和50 μmol·L-1丹皮酚能顯著抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成（P＜0.05），抑制能力呈濃度依賴性遞增。而用RANKL預(yù)處理細(xì)胞24 h后，加入不同濃度的丹皮酚，對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨形成無明顯影響（P＞0.05）（圖2、3）。

圖2 破骨細(xì)胞TRAP染色結(jié)果 TRAP × 10Fig2 TRAP staining of positive multinucleated osteoclasts TRAP × 10

2.4 Western blot檢測(cè)RANK和TRAP蛋白水平

各組細(xì)胞RANK和TRAP蛋白表達(dá)情況見圖4、5。與陽性刺激組相比，隨著丹皮酚濃度增高，RANK和TRAP蛋白表達(dá)明顯減弱（P＜0.05）。上述結(jié)果說明，丹皮酚可抑制破骨細(xì)胞RANK和TRAP蛋白水平表達(dá)。

圖3 破骨細(xì)胞TRAP陽性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)Fig3 Quantification of TRAP positive multinucleated osteoclasts

圖4 Western blot檢測(cè)RANK和TRAP蛋白的表達(dá)Fig4 The expression of RANK and TRAP using Western blot

圖5 RANK和TRAP蛋白的表達(dá)Fig5 Quantification of RANK and TRAP

3 討論

在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中，BMM參與的特異性免疫應(yīng)答起著重要作用，過度免疫反應(yīng)會(huì)破壞牙周組織，導(dǎo)致附著喪失和牙槽骨吸收。牙齦卟啉單胞菌能夠有效刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，BMM受到刺激后產(chǎn)生一系列炎性因子，參與牙周炎的病變發(fā)展。有研究[8]發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌能刺激BMM產(chǎn)生大量的IL-1β、IL-6、TNF-α和前列腺素2，這些因子與牙周炎的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。此外，牙齦卟啉單胞菌可直接或間接刺激BMM分化成破骨細(xì)胞造成牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙脫落[9]。因此，抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的BMM分泌過量炎性因子和破骨細(xì)胞形成對(duì)于改善和治療牙周炎起到至關(guān)重要的作用。

丹皮酚的抗炎作用已經(jīng)得到證實(shí)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠BMM和小角質(zhì)細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α和IL-1炎性因子[10]。對(duì)細(xì)胞因子的測(cè)定中，采用ELISA法，結(jié)果顯示牙齦卟啉單胞菌可顯著增加BMM細(xì)胞的IL-1β、IL-6和TNF-α分泌，丹皮酚可顯著抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)BMM炎性因子的釋放，在此結(jié)果基礎(chǔ)上，筆者用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白PD-L1。PD-L1蛋白是程序性死亡因子（programmed death-1，PD-1）的配體，與自身免疫疾病、慢性炎癥及腫瘤密切相關(guān)[11]。在膿毒血癥小鼠動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，PD-L1在單核細(xì)胞的表達(dá)量與IL-6和TNF-α的分泌成正比。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，較對(duì)照組，隨丹皮酚濃度增高，丹皮酚干預(yù)細(xì)胞組的PD-L1表達(dá)降低。提示丹皮酚可通過抑制PD-L1降低牙齦卟啉單胞菌介導(dǎo)的BMM炎癥因子的釋放。

破骨細(xì)胞是人體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的多核巨噬細(xì)胞，來源于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，可以通過消化酶和酸來溶解骨組織完成骨吸收，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)骨修復(fù)重建。M-CSF和RANKL是破骨細(xì)胞分化成熟必不可少的兩個(gè)重要因子，它們通過調(diào)節(jié)破骨前體細(xì)胞的增殖、融合、分化等功能來實(shí)現(xiàn)破骨細(xì)胞分化[12]。本實(shí)驗(yàn)中用BMM原代誘導(dǎo)的方法，該法比較接近體內(nèi)破骨細(xì)胞分化的微環(huán)境，被廣泛用于藥物干預(yù)和調(diào)控方面的研究。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在M-CSF存在的前提下，牙齦卟啉單胞菌直接作用BMM不能誘導(dǎo)其分化為破骨細(xì)胞，只有在RANKL預(yù)處理后才能誘導(dǎo)BMM分化為破骨細(xì)胞，結(jié)果與其他研究[13]結(jié)果一致。故本實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)體系中加入M-CSF濃度為44 ng·mL-1，RANKL濃度為100 ng·mL-1，預(yù)處理24 h去除RANKL后，加入牙齦卟啉單胞菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過4 d誘導(dǎo)各濃度丹皮酚組破骨細(xì)胞的形成數(shù)量均明顯減少，較對(duì)照組有顯著性差異，且抑制能力呈濃度依賴性增強(qiáng)，此外，TRAP染色結(jié)果顯示，對(duì)照組誘導(dǎo)較丹皮酚各組的破骨細(xì)胞細(xì)胞核多，體型大，提示丹皮酚可以抑制BMM向成熟破骨細(xì)胞的分化。RANK和TRAP是破骨細(xì)胞形成的重要標(biāo)志蛋白，在免疫應(yīng)答、淋巴結(jié)形成及炎癥中起著不可或缺的作用[14]。TRAP是破骨細(xì)胞的特征性酶，參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化底物的降解。RNAK蛋白是位于破骨細(xì)胞以及前體細(xì)胞表面的Ⅰ型跨膜受體，是RANKL發(fā)揮破骨細(xì)胞分化作用唯一靶信號(hào)受體。只有當(dāng)RANKL與RANK結(jié)合后，才能激活核因子κB等信號(hào)通絡(luò)，進(jìn)而啟動(dòng)破骨細(xì)胞的分化。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，丹皮酚各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的TRAP和RANK蛋白量均減少，丹皮酚低濃度組與高濃度組相差也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明丹皮酚可能通過下調(diào)RANK及TRAP抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化成熟。

已有報(bào)道丹皮酚可抑制實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠體內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌及骨喪失[15]，本研究亦證實(shí)丹皮酚能明顯抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的BMM炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，PD-L1可能參與了丹皮酚對(duì)BMM炎癥反應(yīng)的抑制作用。同時(shí)，丹皮酚能明顯抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的BMM破骨細(xì)胞分化能力。初步揭示了丹皮酚抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)BMM炎癥及破骨反應(yīng)的分子作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究丹皮酚防治牙周炎提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Moore WE, Moore LV. The bacteria of periodontal diseases [J]. Periodontol 2000, 1994, 5(1):66-77.

[2] Holt SC, Kesavalu L, Walker S, et al. Virulence factors ofPorphyromonas gingivalis[J]. Periodontol 2000, 1999, 20 (1):168-238.

[3] Bostanci N, Belibasakis GN.Porphyromonas gingivalis: an invasive and evasive opportunistic oral pathogen[J]. FEMS Microbiol Lett, 2012, 333(1):1-9.

[4] Mysak J, Podzimek S, Sommerova P, et al.Porphyromonas gingivalis: major periodontopathic pathogen overview[J]. J Immunol Res, 2014, 2014:636893.

[5] 郭齊, 李貽奎, 王志國(guó), 等. 丹皮酚藥理研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥信息, 2009, 26(1):20-22.

Guo Q, Li YK, Wang ZG, et al. Research progress on paeonol pharmacological[J]. Information Traditional Chin Med, 2009, 26(1):20-22.

[6] Tsai HY, Lin HY, Fong YC, et al. Paeonol inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis by inhibiting ERK, p38 and NF-kappaB pathway[J]. Eur J Pharmacol, 2008, 588(1):124-133.

[7] Jules J, Feng X.In vitroinvestigation of the roles of the proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-α and interleukin-1 in murine osteoclastogenesis[J]. Methods Mol Biol, 2014, 1155:109-123.

[8] Shaik-Dasthagirisaheb YB, Kantarci A, Gibson FC 3rd. Immune response of macrophages from young and aged mice to the oral pathogenic bacteriumPorphyromonas gingivalis[J]. Immun Ageing, 2010, 7:15.

[9] Zhang W, Ju J, Rigney T, et al.Porphyromonas gingivalisinfection increases osteoclastic bone resorption and osteoblastic bone formation in a periodontitis mouse model[J]. BMC Oral Health, 2014, 14:89.

[10] Chen N, Liu D, Soromou LW, et al. Paeonol suppresses lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokines in macrophage cells and protects mice from lethal endotoxin shock [J]. Fundam Clin Pharmacol, 2014, 28(3):268-276.

[11] Qu QX, Huang Q, Shen Y, et al. The increase of circulating PD-L1-expressing CD68(+) macrophage in ovarian cancer [J]. Tumour Biol, 2016, 37(4):5031-5037.

[12] Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation[J]. Nature, 2003, 423(6937):337-342.

[13] Zhang P, Liu J, Xu Q, et al. TLR2-dependent modulation of osteoclastogenesis byPorphyromonas gingivalisthrough differential induction of NFATc1 and NF-kappaB[J]. J Biol Chem, 2011, 286(27):24159-24169.

[14] Kim JH, Kim N. Signaling pathways in osteoclast differentiation[J]. Chonnam Med J, 2016, 52(1):12-17.

[15] Chang CY, Fu E, Chiang CY, et al. Effect of paeonol on tissue destruction in experimental periodontitis of rats[J]. Am J Chin Med, 2014, 42(2):361-374.

（本文編輯 杜冰）

Effects of paeonol on the function of bone marrow-derived macrophage from Porphyromonas gingivalis-induced mice

Chen Zhu1, Su Lingkai2. (1. Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Guiyang Hospital of Stomatology, Affiliated Guiyang Hospital of Stomatology, Zunyi Medical University, Guiyang 550002, China; 2. Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Stomatology Hospital Affiliated to Zhejiang University of Medicine, Hangzhou 310000, China)

Objective This work aims to examine the effects of paeonol treatment on the ability of bone marrow-derived macrophage (BMM) to excrete inflammatory factors and to differentiate into osteoclasts upon induction with Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). This work also aims to investigate the underlying mechanisms of these abilities.MethodsBMM culture was treated with different paeonol concentrations at for 1 h and then stimulated with P. gingivalis for 24 h before programmed death-ligand 1 (PD-L1) was quantified with flow cytometry. Tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β, and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The BMM culture was treated with the receptor activator for nuclear factor-κB ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), and then with paeonol for 1 h prior to induction with P. gingivalis. Then, osteoclast formation was assessed using tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining. The osteoclast-relatedproteins TRAP and receptor activator of nuclear factor-κB (RANK) were quantified by Western blotting.ResultsPaeonol was nontoxic to BMM within a range of 10–50 μmol·L-1. Flow cytometry showed that paeonol inhibited PD-L1 expression inP. gingivalis-induced BMM in a dose-dependent manner. ELISA indicated that paeonol dose-dependently inhibited the excretion of TNF-α, IL-1β, and IL-6 by P.gingivalis-inducedBMM (P＜0.01). TRAP staining revealed that paenol treatment inhibited the differentiation of P.gingivalis-induced BMM into osteoclasts. Western blot results suggested that paeonol decreased the expression of TRAP and RANK in BMM.ConclusionPaeonol dose-dependently inhibited the excretion of the inflammatory factors TNF-α, IL-1β, and IL-6 by P. gingivalis-induced BMM in a dose-dependent manner. Moreover, paenol treatment prevented the differentiation of P. gingivalis-induced BMM differentiation into osteoclasts.

paeonol;Porphyromonas gingivalis; bone marrow-derived macrophage; osteoclast; inflammatory; differentiation

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2017.02.006

Supported by: Innovative Talents Program of Guiyang City [(2012HK)209-50]; Special Project of Talent Cultivation in the Western Region [(2013)5044]. Correspondence: Su Lingkai, E-mail: 258512692@qq.com.

2016-05-12；

2017-01-18

貴陽市高層次創(chuàng)新型青年科技人才培養(yǎng)計(jì)劃[筑教發(fā)（2-012HK）209-50號(hào)]；西部地區(qū)人才培養(yǎng)出國(guó)特別項(xiàng)目[（2013）5044號(hào)]

陳筑，副主任醫(yī)師，博士，E-mail：17784810646@163. com

宿凌愷，住院醫(yī)師，博士，E-mail：258512692@qq.com