低氧訓(xùn)練對大鼠小腸黏膜屏障功能的影響及其機(jī)制

劉霞金其貫金愛娜

1湖南師范大學(xué)體育學(xué)院（長沙 410012）

2揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院（揚(yáng)州225009）

低氧訓(xùn)練對大鼠小腸黏膜屏障功能的影響及其機(jī)制

劉霞1，2金其貫2金愛娜2

1湖南師范大學(xué)體育學(xué)院（長沙 410012）

2揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院（揚(yáng)州225009）

目的：探討低氧訓(xùn)練對大鼠小腸黏膜屏障功能的作用和機(jī)制。方法：5周齡雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為常氧對照組（C組，n=20）、常氧訓(xùn)練組（E組，n=20）、低氧對照組（HC組，n=20）、低氧訓(xùn)練組（HE組，n=20），通過人工低氧和游泳訓(xùn)練模擬高原訓(xùn)練，分別觀察2周、6周后大鼠小腸黏膜的組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)，檢測血漿中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-La）以及腸組織中腫瘤壞死因子（TNF-α）、核因子-κB（NF-κB）的含量和小腸黏膜中緊密連接蛋白o(hù)ccludin mRNA的表達(dá)量。結(jié)果：（1）實(shí)驗(yàn)6周后，透射電鏡觀察顯示，與常氧對照組相比，常氧訓(xùn)練組大鼠小腸微絨毛較稀疏，且排列不整齊，黏膜上皮細(xì)胞之間的間隙變寬，線粒體數(shù)量明顯減少，嵴模糊；低氧對照組小腸微絨毛長度顯著縮短，排列較為紊亂，黏膜上皮細(xì)胞之間的間隙變寬，少量線粒體變性；低氧訓(xùn)練組小腸微絨毛數(shù)量明顯減少，長度明顯縮短，腸絨毛出現(xiàn)倒伏，黏膜上皮細(xì)胞之間的間隙變寬，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，線粒體變性，部分線粒體嵴模糊、甚至消失。（2）2周后，運(yùn)動訓(xùn)練可顯著減少小腸絨毛數(shù)量（P＜0.01），顯著提高血漿DAO、D-La（P＜0.05）以及小腸組織中NF-κB含量（P＜0.01）；而低氧暴露可顯著降低小腸組織occludin mRNA表達(dá)（P＜0.01），顯著提高血漿DAO、D-La（P＜0.05）以及小腸組織TNF-α（P＜0.05）、NF-κB（P＜0.01）含量；低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步減少小腸絨毛數(shù)量、長度和occludin mRNA表達(dá)，升高血漿DAO、D-La以及小腸組織TNF-α、NF-κB含量均無顯著的交互作用（P＞0.05）。（3）6周后，運(yùn)動訓(xùn)練及低氧暴露均顯著降低小腸絨毛數(shù)量（P＜0.01），增加血漿DAO、D-La含量（P＜0.01）以及小腸組織中TNF-α（P＜0.01，P＜0.05）和NF-κB含量（P＜0.01），顯著降低小腸組織中occludin mRNA的表達(dá)（P＜0.05）；且低氧聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步減少小腸絨毛數(shù)量、長度（P＜0.01，P＜0.05），增加血漿中DAO、D-La含量（P＜0.01）具有顯著的交互作用。結(jié)論：（1）大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練以及低氧暴露均能導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能受損，其損害程度與訓(xùn)練及低氧暴露時(shí)間有關(guān)。（2）低氧暴露以及大強(qiáng)度訓(xùn)練可能是通過增加小腸內(nèi)TNF-α、NF-κB的含量從而降低緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)，最終導(dǎo)致小腸通透性增加，腸道黏膜屏障功能受損。

低氧；大強(qiáng)度運(yùn)動；腸道黏膜屏障；二胺氧化酶（DAO）；D-乳酸（D-La）；腫瘤壞死因子（TNF-α）；核因子-κB（NF-κB）；緊密連接蛋白o(hù)ccludin

高原訓(xùn)練已成為我國運(yùn)動員的一項(xiàng)重要的訓(xùn)練方法，關(guān)于其對運(yùn)動員身體機(jī)能影響的研究也在逐步完善。高原低氧以及大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練均能導(dǎo)致機(jī)體腸道黏膜屏障損傷[1]。二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）是腸黏膜上層絨毛細(xì)胞胞質(zhì)中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，當(dāng)腸道黏膜發(fā)生損傷后，D-乳酸（D-lactate，D-La）會進(jìn)入血液，腸黏膜上皮細(xì)胞DAO釋放增加，并大量進(jìn)入血漿，使血漿中DAO升高。因此，血漿D-La以及DAO含量的變化可作為評價(jià)腸黏膜屏障功能是否損傷的敏感指標(biāo)[2，3]。小腸的機(jī)械屏障包括粘液層、腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞間緊密連接、黏膜下固有層等，腸道上皮細(xì)胞間的緊密連接（tight junction，TJ）是保持腸黏膜屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而閉鎖蛋白（occludin）是緊密連接中的關(guān)鍵蛋白，可以調(diào)節(jié)旁細(xì)胞通路。因此，可以通過檢測上皮細(xì)胞中occludin的分布和相對表達(dá)量，判斷動物機(jī)體細(xì)胞屏障功能是否發(fā)生變化，其分布減少會導(dǎo)致腸屏障功能障礙。

關(guān)于高原低氧影響腸黏膜屏障功能的可能機(jī)制，Koury等[4]研究發(fā)現(xiàn)，缺血或缺氧都可以抑制缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α），使HIF-1α表達(dá)下調(diào)，從而生成大量炎性細(xì)胞，導(dǎo)致對抗胃腸黏膜屏障功能損害的保護(hù)減弱。而炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）和白介素-1（IL-1）為炎癥損傷初始因子，TNF與其受體結(jié)合后，可通過活化的轉(zhuǎn)錄因子使單核/巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子出現(xiàn)級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致這種炎性損傷進(jìn)一步擴(kuò)大[5]。TNF-α能直接抑制腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)，從而破壞腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接，導(dǎo)致腸道通透性升高。而TNF-α與NF-κB之間又存在著正反饋調(diào)節(jié)，TNF-α可通過誘導(dǎo)IKB磷酸化、泛素化并使其降解，從而促使核因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）的核定位序列暴露，NF-κB隨即轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)特定NF-κB的位點(diǎn)結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致包括TNF-α在內(nèi)的細(xì)胞因子大量釋放[6]。本研究在觀察小腸黏膜的組織結(jié)構(gòu)（包括絨毛長度和數(shù)量）以及電鏡下小腸超微結(jié)構(gòu)來判斷小腸黏膜損傷程度的同時(shí)，通過檢測血漿中DAO、DLa的含量，小腸組織中NF-κB、TNF-α的含量和緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的變化，探討低氧訓(xùn)練時(shí)小腸黏膜屏障通透性的影響及可能機(jī)制，為更進(jìn)一步提高高原訓(xùn)練效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選用5周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠80只，體重130～160 g，購于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為：SCXK（蘇）2013-0011。分籠飼養(yǎng)，每籠4～5只，飼養(yǎng)室溫20～22℃，自然光照，為保持籠內(nèi)清潔干燥，每天定時(shí)更換墊料。采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)前在安靜環(huán)境下適應(yīng)飼養(yǎng)3天后，隨機(jī)將大鼠分成常氧對照組（C組，n=20）、常氧訓(xùn)練組（E組，n=20）、低氧對照組（HC組，n=20）和低氧訓(xùn)練組（HE組，n=20）4組。

1.2 訓(xùn)練與低氧方案

C組大鼠常氧下生活，平時(shí)不進(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練；E組常氧下生活和訓(xùn)練；HC組在低氧艙（The MAG-10 Mountain Air Generator）中生活；HE組在低氧艙中生活和訓(xùn)練。在第1周內(nèi)將低氧艙模擬海拔高度由1600 m逐漸增加到3500 m高度，最終氧濃度為13.6%。E和HE組下午進(jìn)行負(fù)重游泳訓(xùn)練，在第1周內(nèi)E組大鼠負(fù)重逐漸增加到體重的1.9%（相當(dāng)于大鼠90%乳酸閾強(qiáng)度）[7]，為了保持運(yùn)動強(qiáng)度相近，HE組負(fù)重逐漸增加到體重的1.7%，運(yùn)動時(shí)間逐漸增加到90 min。以后按照此強(qiáng)度和時(shí)間進(jìn)行訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6天，共6周。游泳池為120 cm×80 cm×70 cm的長方體塑料水桶，內(nèi)壁光滑，水深50 cm以上，水溫30～33℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)取材

在2周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組大鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，其中一組供2周時(shí)取材，另一組繼續(xù)實(shí)驗(yàn)至6周結(jié)束后取材。E組和HE組2周后各有2只大鼠因取材或指標(biāo)測試的原因未獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在大鼠末次運(yùn)動訓(xùn)練后，禁食12 h，第2日晨依次按5 ml/kg的劑量腹腔注射20%的烏拉坦溶液麻醉，然后從腹主動脈取血3 ml至EDTA抗凝管中輕輕搖勻，靜置，在2 h內(nèi)，4℃、4000 r/min離心15 min，吸取血漿保存于－20℃冰箱；在大鼠回腸末端上3～5 cm處，取米粒大小的回腸組織，置于5%的戊二醛溶液中固定，制備超薄切片，在電子顯微鏡下觀察小腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；取一小段回腸組織置于10%甲醛溶液中固定，制備石蠟切片；準(zhǔn)確稱重0.1 g腸組織，裝入盛有0.9 ml預(yù)冷PBS（pH=7.0）的研磨管中，用組織勻漿器以6 M/s速度勻漿1 min，制備濃度為10%的小腸組織勻漿液。將勻漿液4℃，3500 r/min離心30 min，取上清液分裝后于－20℃保存。剩余組織裝凍存管置于－80℃冰箱冷凍保存待測。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 小腸黏膜組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)觀察

從甲醛溶液中取出回腸組織，制備石蠟切片，在Olympus顯微鏡下觀察小腸黏膜的組織結(jié)構(gòu)，并測量絨毛的長度和密度；從戊二醛溶液中取出回腸組織，進(jìn)行常規(guī)包埋、制片，用T-120型透射電鏡觀察回腸組織的超微結(jié)構(gòu)。

1.4.2 血漿D-乳酸、DAO以及小腸組織NNF- κB、TNF-α含量的測定

大鼠血漿中D-乳酸、DAO含量以及回腸NF-κB、TNF-α的含量采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定，試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，回腸組織中總蛋白濃度的測定采用BCA蛋白濃度測定法，儀器為multiskan全波段酶標(biāo)儀。

1.4.3 小腸組織occludin mRNA的檢測

小腸組織occludin mRNA采用Real-time PCR法，用RNAiso Plus（購自TaKaRa）從回腸組織中提取總RNA后，采用NanoDrop ND-3300微量分光光度計(jì)檢測260/280吸光度比值，判斷RNA純度。按照cDNA合成試劑盒（購自TaKaRa公司）中說明書上的操作步驟，使用2720Thermal Cycler梯度PCR儀（美國）進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)結(jié)束后，在－20℃條件下保存。使用SYBR Green Master（ROX）試劑盒（購自Roche Diag?nostics），以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，在ABI 7500 RT-PCR儀上進(jìn)行基因擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃預(yù)處理2 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。程序運(yùn)行結(jié)束后，將目的基因的Ct值與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算出目的基因的相對表達(dá)量。occludin的引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。

表1 occludin、GAPDH的引物序列表

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，C、E、HC和HE四組之間采用雙因素方差分析，P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠小腸絨毛長度和數(shù)量變化

由表2和表3可知，2周的運(yùn)動訓(xùn)練使小腸絨毛數(shù)量極顯著減少（P＜0.01），使小腸絨毛長度有所縮短，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而低氧暴露可使小腸絨毛數(shù)量減少和長度縮短，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步減少小腸絨毛數(shù)量和長度均無顯著的交互作用。

6周的運(yùn)動訓(xùn)練和低氧暴露均使小腸絨毛數(shù)量極顯著性減少（P＜0.01），且低氧聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步減少小腸絨毛數(shù)量具有極顯著的交互作用（P＜0.01）。6周的運(yùn)動訓(xùn)練及低氧暴露均可使小腸絨毛長度縮短，但無顯著性差異（P＞0.05）；低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步縮短小腸絨毛的長度具有顯著的交互作用（P＜0.05）。

表2 各組大鼠不同時(shí)間小腸絨毛數(shù)量和長度變化

表3 各組大鼠小腸絨毛數(shù)量及長度雙因素方差分析

2.2 各組大鼠腸道黏膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

如圖1所示，C組大鼠黏膜上皮細(xì)胞向腸腔內(nèi)突出形成微絨毛，微絨毛排列緊密，規(guī)則整齊；上皮細(xì)胞間連接緊密；胞質(zhì)中線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。E組大鼠小腸微絨毛較稀疏，且排列不整齊；線粒體數(shù)量明顯減少，嵴模糊且部分線粒體存在變性；部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，黏膜上皮細(xì)胞之間的間隙變寬。HC組大鼠小腸微絨毛長度顯著縮短，排列較為紊亂；黏膜上皮細(xì)胞之間的間隙變寬，可見線粒體變性，有些細(xì)胞基質(zhì)空泡化、密度減小。HE組大鼠小腸微絨毛數(shù)量明顯減少，長度明顯縮短，腸絨毛出現(xiàn)倒伏；黏膜上皮細(xì)胞之間的間隙變寬，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰；線粒體變性，部分線粒體嵴模糊、甚至消失。

圖1 各組大鼠小腸絨毛超微結(jié)構(gòu)變化

2.3 各組大鼠血漿DAO、D-La含量變化

從表4和表5可知，2周的低氧暴露和運(yùn)動訓(xùn)練均可導(dǎo)致血漿DAO和D-La含量顯著升高（P＜0.05），但低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步增加血漿DAO和DLa含量無顯著的交互作用（P＞0.05）；6周的低氧暴露和運(yùn)動訓(xùn)練均使血漿DAO和D-La含量極顯著升高（P＜0.01），且低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步增加血漿中DAO和D-La含量均具有極顯著的交互作用（P＜0.01）。

表4 各組大鼠不同時(shí)間血漿內(nèi)DAO和D-La含量的變化

表5 各組大鼠血漿DAO、D-乳酸含量雙因素方差分析

2.4各組大鼠小腸組織occludin mRNA表達(dá)變化

如表6和表7所示，2周的低氧暴露使小腸組織oc?cludin mRNA表達(dá)極顯著降低（P＜0.01），運(yùn)動訓(xùn)練雖然能夠降低其表達(dá)但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對降低小腸組織occludin mRNA表達(dá)無顯著的交互作用（P＞0.05）；6周的低氧暴露和運(yùn)動訓(xùn)練均能顯著降低小腸組織occludin mRNA的表達(dá)（P＜0.05），且低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步降低小腸occludin mRNA的表達(dá)無顯著交互作用（P＞0.05）。

表6 各組大鼠不同時(shí)間小腸組織occludin mRNA表達(dá)變化

表7 各組大鼠小腸組織occludin mRNA表達(dá)雙因素方差分析

2.5 各組大鼠腸組織中TNF-α和NF-κB含量的變化

如表8和表9所示，2周的低氧暴露使小腸組織TNF-α含量顯著增加（P＜0.05），運(yùn)動訓(xùn)練雖然能夠使TNF-α含量增加但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），低氧聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練可使小腸組織TNF-α的含量進(jìn)一步增加，但無顯著的交互作用（P＞0.05）；2周的低氧暴露與運(yùn)動訓(xùn)練均能夠極顯著地增加小腸組織中NF-κB的含量（P＜0.01），但低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步增加小腸組織中NF-κB的含量無顯著的交互作用（P＞0.05）。

6周的低氧暴露可使小腸組織中TNF-α的含量極顯著增加（P＜0.01），運(yùn)動訓(xùn)練使小腸組織中TNF-α的含量顯著增加（P＜0.05），但低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步增加小腸組織中TNF-α的含量無顯著的交互作用（P＞0.05）。6周的低氧暴露及運(yùn)動訓(xùn)練均使小腸組織中NF-κB含量極顯著增加（P＜0.01），低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練雖然能夠使腸組織中NF-κB含量進(jìn)一步增加，但無顯著的交互作用（P＞0.05）。

表8 各組大鼠不同時(shí)間小腸組織TNF-α和NF-κB含量的變化

表9 各組大鼠小腸組織TNF-α、NF-κB含量雙因素方差分析

3 討論

3.1 低氧和大負(fù)荷訓(xùn)練對大鼠腸道黏膜屏障功能的影響

機(jī)體內(nèi)正常的腸道屏障結(jié)構(gòu)包括腸道黏膜上皮的機(jī)械屏障、腸道黏膜的免疫屏障、腸道的化學(xué)屏障和生物屏障。其中物理-機(jī)械屏障由腸道黏膜上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接等構(gòu)成，能有效阻止細(xì)菌、毒素等有害因子穿透黏膜進(jìn)入深部組織，腸道黏膜上皮的完整性和正常的再生能力是腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究表明，急性或持續(xù)性的低氧暴露易引起機(jī)體腸道屏障黏膜的損傷。Recavarren等[8]的研究證實(shí)，相比于生活在海平面高度的人群，生活在高海拔的人群均存在嚴(yán)重的胃黏膜損傷。急進(jìn)高原后，絨毛從腫脹、縮短、增粗發(fā)展至倒伏、融合、破損甚至斷裂剝脫，固有層裸露，間質(zhì)充血，并可見炎性粒細(xì)胞，且隨著低氧暴露時(shí)間的增加，腸黏膜損傷加重[9]。李素芝等[3]研究發(fā)現(xiàn)，急性缺氧可導(dǎo)致胃腸道黏膜明顯受損，消化系統(tǒng)癥狀發(fā)生率高達(dá) 65%，且血漿中D-La及DAO含量升高。本研究發(fā)現(xiàn)，2周后低氧暴露組大鼠小腸絨毛長度和數(shù)量有所減少（P＞0.05），血漿DAO和D-La含量顯著升高（P＜0.05）；但隨著低氧暴露時(shí)間的延長，6周后低氧暴露大鼠小腸絨毛數(shù)量極顯著減少（P＜0.01），且血漿DAO和D-La含量極顯著升高（P＜0.01）。透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，低氧暴露組大鼠小腸微絨毛長度顯著縮短，排列紊亂，黏膜上皮細(xì)胞之間的間隙變寬，有些細(xì)胞基質(zhì)空泡化、密度減小。

由于大強(qiáng)度運(yùn)動也是一種應(yīng)激源，長時(shí)間的劇烈運(yùn)動可引起胃腸綜合征的發(fā)生使機(jī)體出現(xiàn)一系列消化道癥狀，如惡心、嘔吐、腹瀉、食欲下降等。史艷莉等[10]發(fā)現(xiàn)大鼠過度運(yùn)動后血漿內(nèi)毒素含量增加2倍，腸黏膜通透性增加2.5倍，細(xì)菌移位率增加達(dá)230%，腸上皮細(xì)胞長度水腫，且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)高爾基復(fù)合體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，2周和6周的大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練均使大鼠小腸絨毛數(shù)量極顯著減少（P＜0.01），血漿DAO和D-La含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。電鏡下，E組大鼠小腸微絨毛較稀疏，且排列不整齊；線粒體數(shù)量明顯減少，嵴模糊且部分線粒體存在變性；部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞間的連接松弛。從而說明無論是低氧暴露還是運(yùn)動訓(xùn)練均能夠?qū)Υ笫竽c道黏膜造成損傷。那么，在低氧環(huán)境下進(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練對大鼠的腸道損傷是否更加嚴(yán)重？低氧暴露與運(yùn)動訓(xùn)練是否存在交互作用？本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2周的低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練雖然能夠進(jìn)一步減少小腸絨毛的數(shù)量、降低小腸絨毛長度和增加血漿DAO和D-La含量，但沒有顯著的交互作用（P＞0.05）。然而6周后，低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對大鼠小腸絨毛長度、數(shù)量和血漿DAO、D-La含量有顯著的交互作用（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），可使小腸絨毛數(shù)量進(jìn)一步減少，絨毛長度進(jìn)一步降低，血漿DAO、D-La含量進(jìn)一步升高。因此，隨著低氧暴露以及大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練時(shí)間的增加，腸道黏膜屏障通透性增加，腸黏膜受損程度加重，且在低氧條件下進(jìn)行大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練使腸道粘膜通透性的改變以及腸黏膜屏障功能障礙比單純的低氧暴露或運(yùn)動訓(xùn)練更加嚴(yán)重。

3.2 低氧和大負(fù)荷訓(xùn)練對大鼠腸道黏膜屏障功能影響的可能機(jī)制

Occludin蛋白是第1個(gè)被分離的TJ跨膜蛋白，它通過外環(huán)形成嚴(yán)密的“拉鏈?zhǔn)健苯Y(jié)構(gòu)封鎖細(xì)胞間隙，直接參與緊密連接的形成。研究證實(shí)，occludin是TJ發(fā)揮正常功能的主要結(jié)構(gòu)，其缺失可能會導(dǎo)致TJ對離子的通透性增加[11]。occludin一旦進(jìn)入緊密連接，其連接部位的膜通透性將大大降低，使大分子自由出入受阻，進(jìn)而達(dá)到屏障保護(hù)作用[12]。劉海萍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，早期斷奶引起的腸道屏障功能損傷和細(xì)胞通透性改變可能是由于腸上皮緊密連接蛋白o(hù)ccludin mRNA的表達(dá)水平降低所致。敲除上皮細(xì)胞中occludin基因，動物機(jī)體會出現(xiàn)炎癥性腸炎等病理變化[14]。而且潰瘍性腸炎和克羅恩病人中occludin mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平呈顯著性降低，從而說明occludin可能參與了炎癥性腸病的發(fā)病過程[15]。低氧、炎性因子刺激等可引起occlu?din蛋白分布異常、表達(dá)減少甚至融解，導(dǎo)致TJ結(jié)構(gòu)和功能異常，細(xì)胞間隙增寬，進(jìn)而使內(nèi)皮層通透性增加[16]。有研究表明，低氧暴露使occludin的表達(dá)下調(diào)，從而可能導(dǎo)致TLR4/NF-κB傳導(dǎo)通路被激活，腸道屏障功能受損以及細(xì)菌位移[17]。急進(jìn)高原大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接出現(xiàn)斷裂，并與腸道緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)密切相關(guān)[18]。而大強(qiáng)度運(yùn)動應(yīng)激會導(dǎo)致腸道上皮間緊密連接蛋白破壞，進(jìn)而導(dǎo)致腸腔內(nèi)毒素進(jìn)入血液發(fā)生一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，損害腸道屏障的正常生理功能[19]。由于大強(qiáng)度運(yùn)動導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)熱急劇增加，當(dāng)體溫高于39℃時(shí)蛋白激酶活化導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞緊密連接中occludin和claudin蛋白磷酸化，蛋白間相互作用能力降低，腸黏膜通透性增加[20]。那么高原低氧應(yīng)激或大強(qiáng)度的運(yùn)動應(yīng)激對大鼠腸道屏障功能的破壞是否也與腸道occludin表達(dá)有關(guān)？本研究發(fā)現(xiàn)，2周的低氧暴露使大鼠小腸組織occludin mRNA表達(dá)極顯著降低（P＜0.01），運(yùn)動訓(xùn)練雖然能夠降低其表達(dá)但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而6周的低氧暴露或運(yùn)動訓(xùn)練均能顯著降低大鼠小腸組織中occludin mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。由此我們推測，低氧應(yīng)激使小腸occludin蛋白改變發(fā)生時(shí)間早于運(yùn)動應(yīng)激，而小腸通透性增加，腸黏膜屏障受到破壞可能與小腸黏膜occludin表達(dá)降低密切相關(guān)。隨著大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練時(shí)間的延長，小腸內(nèi)occludin mRNA表達(dá)降低越明顯，導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷越嚴(yán)重，可能發(fā)生了過度訓(xùn)練。

TNF-α是在炎癥刺激下由特定細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子。濃度低時(shí)起防御作用，高濃度時(shí)則會引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列的炎性損害。研究表明，過量的TNF-α將誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞過度凋亡，使中性粒細(xì)胞大量聚集，促進(jìn)黏膜固有層發(fā)生炎癥反應(yīng)，IL-8的表達(dá)增強(qiáng)，腸道上皮細(xì)胞通透性增加[21]。張文遠(yuǎn)[22]等研究表明，腸道微生態(tài)對三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白具有明顯的保護(hù)作用，其可能的機(jī)制是通過糾正腸道微生態(tài)，上調(diào)腸上皮細(xì)胞TJ蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)，降低結(jié)腸組織TNF-α水平，提高IL-10的水平，從而抑制內(nèi)毒素通過緊密連接進(jìn)入體循環(huán)。另外，TNF-α與NF-κB之間存在正反饋調(diào)節(jié)，在缺氧、缺血再灌注以及炎癥過程中 HIF-1α是破壞腸黏膜屏障的重要因子，而TNF-α誘導(dǎo)的 NF-κB能夠增加HIF-1α mRNA、蛋白及活化水平[23-25]。近年來的研究表明，在燒傷、感染、膿毒血癥、炎性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）、缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）、全胃腸外營養(yǎng)（total parenteral nutrition，TPN）等各種急、慢性病理刺激下均會引起腸黏膜屏障功能的破壞[26]，其可能與缺氧和炎癥引起炎癥細(xì)胞釋放大量的促炎細(xì)胞因子有關(guān)[27]，然而導(dǎo)致腸道屏障功能損害的具體機(jī)制尚未明確。

為了研究低氧暴露和/或運(yùn)動訓(xùn)練對小腸黏膜屏障損傷的干預(yù)機(jī)制，本研究測定了小腸組織中TNF-α、NF-κB的含量。結(jié)果顯示，2周的低氧暴露使大鼠小腸組織TNF-α的含量顯著增加（P＜0.05），運(yùn)動訓(xùn)練雖然能夠使TNF-α含量增加但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。6周的低氧暴露使大鼠小腸組織中TNF-α的含量極顯著增加（P＜0.01），運(yùn)動訓(xùn)練使大鼠小腸組織中TNF-α的含量顯著增加（P＜0.05）。然而，低氧暴露聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對進(jìn)一步增加小腸組織中TNF-α的含量無顯著的交互作用（P＞0.05）。2周、6周的低氧暴露或運(yùn)動訓(xùn)練均能夠極顯著地增加大鼠小腸組織中NF-κB的含量（P＜0.01），在低氧條件下進(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練雖然能夠使腸組織中NF-κB的含量進(jìn)一步增加，但低氧暴露與運(yùn)動訓(xùn)練對增加腸組織中NF-κB的含量無顯著的交互作用（P＞0.05）。這提示低氧暴露以及運(yùn)動訓(xùn)練的雙重刺激導(dǎo)致小腸中TNF-α以及NF-κB含量增加，使小腸黏膜發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而使緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)降低，小腸通透性增加，腸黏膜屏障損傷，且其損傷程度與時(shí)間成正比。

4 結(jié)論

4.1 大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練以及低氧暴露均能夠?qū)е履c道黏膜屏障功能受損，其損害程度與訓(xùn)練及低氧暴露時(shí)間成正比。

4.2 低氧暴露以及大強(qiáng)度訓(xùn)練可能是通過增加小腸內(nèi)TNF-α、NF-κB的含量從而降低TJ蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)，最終導(dǎo)致小腸通透性增加，腸道黏膜受損，這可能是高原訓(xùn)練導(dǎo)致小腸屏障損傷的機(jī)制之一。

[1] 金其貫，佘奇，金愛娜，等.模擬高原訓(xùn)練對大鼠小腸粘膜屏障的影響及其小麥肽的干預(yù)作用.西安體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，31（2）：225-230.

[2] 楊加玲，顧明.過度訓(xùn)練對大鼠小腸黏膜機(jī)械屏障的影響及谷氨酰胺的干預(yù)作用[J].中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2011，30（4）：345-349.

[3] 李素芝，鄭必海，周先利，等.急性缺氧個(gè)體血漿中D-乳酸及二胺氧化酶的變化與胃腸道黏膜損傷[J].職業(yè)與健康，2011，27（6）：701-702.

[4] Koury J，Deitch EA，Homma H，et al.Persistent HIF-1 [alpha] activation in gut is chemia/reperfusion injury：potential role of bacteria and lipopolysaccharide[J].Shock，2004，22（3）：270-277.

[5] Wang ZT，Yao YM，Xiao GX，et al.Risk factors of devel?opment of gut-derived bacterial translocation in thermal?ly injured rats[J].World J Gastroenterol，2004，10（11）：1619-1624.

[6] Gunther C，Martini E，Wittkopf N，et al.Caspase-8 regu?lates TNF-a-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis[J].Nature，2011，477（7364）：335-339.

[7] 王斌.運(yùn)動對HPA軸分泌、海馬相關(guān)蛋白及信號分子作用的研究[D].上海：華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文，2008.

[8] Recavarren-Arce S，Ramirez-Ramos A，Gilman RH，et al. Severe gastritis in the Peruvian Andes[J].Histopatholo?gy，2005，46（4）：374-379.

[9] Wu WM，Zhang FX，Zhang P.Influence of plateau hypox?ia on the tissue injury and expression of HIF-1α and iNOS in intestinal mucosa of rats[J].Med J Chin PLA，2010，35：592-594.

[10]史艷莉，費(fèi)曦艷.大鼠腸屏障功能變化與不同強(qiáng)度游泳運(yùn)動的關(guān)系[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（25）：5058-5060.

[11]Alan SL，McCarthy KM，F(xiàn)rancis SA，et al.Knockdown of occludin expression leads to diverse phenotypic altera?tions in epithelial cells[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（6）：C1231-C1241.

[12]鄧宸璽，王自蕊，游金明，等.丙氨酰-谷氨酰胺二肽對仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白o(hù)ccludin定位與表達(dá)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)，2014，26（3）：694-700.

[13]劉海萍，胡彩虹，徐勇．早期斷奶對仔豬腸通透性和腸上皮緊密連接蛋白 Occludin mRNA表達(dá)的影響[J]．動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，20（4）：442-446．

[14]Hermiston ML，Gordon JI.Inflammatoryboweldisease and adenomas in mice expressing a dominant negative N-cadherin[J].Science，1995，270（5239）：1203-1207.

[15]Kuchar zik T，Walsh SV，Chen J，et al．Neutrophil trans?migration in inflammatory bow el disease is associated with differential expression of epithelial intercellular junc?tion proteins[J].Am J Pathol，2001，159（6）：2001-2009．

[16]Wachtel M，F(xiàn)rei K，Ehler E，et al.Occludin proteolysis and increased permeability in endothelial cells through ty?rosine phosphatase inhibition[J].J Cell Sci，1999，112（23）：4347-4356.

[17]羅涵.TLR4/NF-κB在低氧暴露下大鼠腸道屏障功能損傷及細(xì)菌移位中的作用研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013.

[18]段云.高原環(huán)境下大鼠腸道緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)及其干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文，2011.

[19]Zuhl M，Schneider S，Lanphere K，et al.Exercise regula?tion of intestinal tight junction proteins[J].Br J Sports Med，2014，48（12）：980-986.

[20]Dokladny K，Moseley PL，Ma TY.Physiologically relevant increase in temperature causes an increase in intestinal epithelial tight junction permeability[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，290（2）：G204-G212.

[21]Peyrin-BirouletL.Anti-TNF therapyin inflammatory bowel diseases：a huge review [J].Minerva Gastroenterol Dietol，2010，56（2）：233-243.

[22]張文遠(yuǎn)，姜偉煒.腸道微生態(tài)對三硝基苯磺酸誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin保護(hù)作用的研究[J].臨床消化病雜志，2010（1）：21-24.

[23]Hiraki M，Kitajima Y，Kai K，et al.Knockdown of hypox?ia-inducible factor-1α accelerates peritoneal dissemina?tion via the upregulation of MMP-1 expression in gas?tric cancer cell lines[J].Exp Ther Med，2012，4（3）：355-362.

[24]Nam SY，Ko YS，Jung J，et al.A hypoxia-dependent up?regulation of hypoxia-inducible factor-1 by nuclear fac?tor-κB promotes gastric tumour growth and angiogenesis [J].Br J Cancer，2011，104（1）：166-174.

[25]Toiyama Y，Inoue Y，Saigusa S，et al.Gene expression profiles of epidermal growth factor receptor，vascular endo?thelial growth factor and hypoxia-inducible factor-1 with special reference to local responsiveness to neoadjuvant chemoradiotherapy and disease recurrence afterrectal cancer surgery[J].Clin Oncol，2010，22（4）：272-280.

[26]Kesik V，Guven A，Vurucu S，et al.Melatonin and 1400 W ameliorate both intestinal and remote organ injury fol?lowing mesenteric ischemia/reperfusion[J].J Surg Res，2009，157（1）：e97-e105.

[27]Capaldo CT，Nusrat A.Cytokine regulation of tight junc?tions[J].Biochimica Biophys Acta，2009，1788（4）：864-871.

Effects of Hypoxia Training on the Function of Small Intestinal Barrier in Rats and Its Mechanism

Liu Xia1，2，Jin Qiguan2，Jin Aina2
1 Physical Education College of Hunan Normal University，Changsha 410012，China
2 Physical Education College of Yangzhou University，Yangzhou 225009，China

Jin Qiguan，Email：qgjin@yzu.edu.cn

ObjectiveTo explore the effect of hypoxic training on the barrier function of intestinal mucous membrane and underlying mechanism in rats.MethodsEighty 5-week-old male Sprague-Daw?ley rats were randomly divided into a control group，an exercise training group，a hypoxia control group and a hypoxia exercise group，each of 20.The altitude training was conducted through swimmingtraining in artificial hypoxia environment.Two and 6 weeks after the intervention，the tissue structure and ultrastructure of small intestine mucosa were observed.The content of diamine oxidase（DAO）and D-lactate（D-LA），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and nuclear factor κB（NF-κB）in plasma and the mRNA level of occludin in ileal tissue were measured.Results（1）Electron microscopy data showed that，after six weeks，compared with the control group，the microvilli of rats in the exercise training group were sparser and arranged irregularly.Furthermore，the gap between epithelial cells became wid?er.In addition，the number of mitochondria decreased significantly and cristae were vague.For the hy?poxia control group，the microvilli shortened significantly and arranged irregularly.Moreover，the gap be?tween cells became wider with partial denatured mitochondria.For the Hypoxia exercise group，the num?ber of mucosal epithelium microvilli in the bowels reduced significantly and the microvilli shortened sig?nificantly.Similar to that of the hypoxia control group，the gap between epithelium cells growed wider. However，the cellular structure were fuzzier，and the denature of mitochondria worsened，with the cristae being vague even disappearing partially.（2）Two weeks of exercise training reduced the number of in?testinal microvilli significantly（P＜0.01），but increased the plasma level of the DAO and D-LA，as well as the expression level of NF-κB in intestinal tissue significantly（P＜0.05）.Hypoxic exposure signifi?cantly reduced the mRNA level of occludin in small intestine（P＜0.01），but significantly increased the plasma level of DAO and D-LA（P＜0.05 vs.control）and the expression of TNF-α and NF-κB in small intestine（P＜0.01）.There was no significant interaction between two weeks of exercise training and hypoxia exposure either on the reduction of the number and height of intestinal microvilli，or the transcription level of occluding in small intestine，or the plasma level of DAO and D-LA，or the expres?sion of TNF-α and NF-κB in small intestine（P＞0.05）.（3）Both exercise training for six weeks and hypoxia exposure significantly reduced the number and height of microvilli in small intestine（P＜0.01）and the occludin level in small intestine，but significantly increased the plasma level of DAO and DLA（P＜0.01），the expression of TNF-α（P＜0.01，P＜0.05）and NF-κB（P＜0.01）.Meanwhile there was significant interaction between six-week exercise training and hypoxia exposure on decreasing the num?ber（P＜0.01）and the height（P＜0.05）of microvilli in small intestine.Conclusion（1）Both intensive training and hypoxia exposure can impair intestinal mucosal barrier function and the extent of damage is correlated with the duration of training and hypoxia exposure.（2）Hypoxic exposure and intensive training may reduce the expression of occludin mRNA through increasing the expression of TNF-α and NF-κB in the small intestine，which in turn increases intestinal permeability and intestinal mucosa inju?ry.

hypoxia exposure，intensive training，small intestinal barrier，diamine oxidase（DAO），D-lactate（D-LA），tumor necrosis factor-α（TNF-α），nuclear factor κB（NF-κB），occludin

2016.08.15

揚(yáng)州市科技局2012科技攻關(guān)—社會發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目（2012112）；2016年國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2016yfd0400603-02）

第1作者：劉霞，Email：994721708@qq.com；

：金其貫，Email：qgjin@yzu.edu.cn