• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    卵巢癌細(xì)胞系SKOV3培養(yǎng)上清對巨噬細(xì)胞共刺激分子的影響

    2017-05-02 06:46:26宋玉霞趙濤張瑋璨郭清王宏衛(wèi)孟桐羽
    河北醫(yī)藥 2017年8期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)腹水亞型

    宋玉霞 趙濤 張瑋璨 郭清 王宏衛(wèi) 孟桐羽

    ·論著·

    卵巢癌細(xì)胞系SKOV3培養(yǎng)上清對巨噬細(xì)胞共刺激分子的影響

    宋玉霞 趙濤 張瑋璨 郭清 王宏衛(wèi) 孟桐羽

    目的 研究卵巢癌細(xì)胞系SKOV3培養(yǎng)上清處理巨噬細(xì)胞后,巨噬細(xì)胞亞型的改變,以及CD80、CD86、CD40在不同巨噬細(xì)胞亞型上表達(dá)的差異。方法 Ficoll 密度梯度法分離健康成人外周血單個核細(xì)胞,GM-CSF誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞(M0)后,用對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清處理14 d后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞亞型的改變及不同亞型細(xì)胞CD80、CD86和CD40的表達(dá)情況。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,用SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞14 d后,巨噬細(xì)胞主要向CD163-M2型巨噬細(xì)胞分化[M1/M2=(12.37±1.76)%/(22.23±2.21)%]。CD163-M2型巨噬細(xì)胞CD40的表達(dá)較CD64-M1型顯著降低,2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而CD80、CD86的表達(dá)無明顯改變,2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激后的巨噬細(xì)胞向不同巨噬細(xì)胞亞型分化;M2型巨噬細(xì)胞較M1型巨噬細(xì)胞共刺激分子表達(dá)下調(diào),提示這些共刺激分子在巨噬細(xì)胞的活化及免疫應(yīng)答過程中很重要,可能與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸有關(guān)。

    卵巢癌;M2型巨噬細(xì)胞;CD80/CD86/CD40

    卵巢癌是婦科腫瘤中惡性程度最高的疾病,腹膜轉(zhuǎn)移是晚期卵巢癌的特征之一。晚期卵巢癌患者腹水微環(huán)境的浸潤細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等等,其中巨噬細(xì)胞是含量最豐富的免疫細(xì)胞。近年來研究發(fā)現(xiàn),M2型巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量和卵巢癌預(yù)后有顯著的相關(guān)性[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在卵巢癌晚期患者腹水中,主要是M2型巨噬細(xì)胞,而非M1型巨噬細(xì)胞。這提示M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤的增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),M1型巨噬細(xì)胞和M2型在某些細(xì)胞因子的表達(dá)上有所差異[2]。本實驗通過研究CD68、CD80及CD40在M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)的差異,初步篩選出腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵分子靶點,為解釋卵巢癌的腹腔播散和轉(zhuǎn)移提供新的線索,并為卵巢癌分子靶點的干預(yù)策略提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 1640培養(yǎng)基,卵巢癌細(xì)胞系SKOV3。

    1.2 方法

    1.2.1 采集健康成人外周血,F(xiàn)icoll 密度梯度法收集中間層單個核細(xì)胞(1 000 r/min,20 min,23℃), PBS重懸后再次離心 (800 r/min,7 min,23℃)。

    1.2.2 巨噬細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞以不含血清的RPMI1640重懸后種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,細(xì)胞種植密度為1.0×106/ml,培養(yǎng)箱中靜置 2 h 使細(xì)胞貼壁,用預(yù)熱的PBS潤洗3次, 除去懸浮細(xì)胞。加入10%FBS-RPMI1640和GM-CSF,置入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),備用。

    1.2.3 用對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清處理14 d后,以免疫熒光的方式鑒定分離培養(yǎng)巨噬細(xì)胞純度。細(xì)胞刮輕刮培養(yǎng)皿收集巨噬細(xì)胞,離心收集細(xì)胞沉淀1 200 r/min, 5 min,23℃。棄上清,以CD68抗體標(biāo)記巨噬細(xì)胞,37℃,1 h。PBS洗滌3遍,標(biāo)記熒光二抗,37℃,1 h。PBS洗滌3遍,Hocest染核5 min。PBS洗滌3遍,熒光顯微鏡觀察,統(tǒng)計。

    1.2.4 SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞:用對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清處理M0巨噬細(xì)胞14 d。

    1.2.5 巨噬細(xì)胞各亞型比例的檢測:以CD64作為M1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記,以CD163作為M2型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記。收集細(xì)胞,取1.0×106個細(xì)胞,標(biāo)記上述熒光抗體,流式細(xì)胞學(xué)檢測M1、M2所占百分。

    1.2.6 巨噬細(xì)胞CD80、CD86和CD40的表達(dá)的檢測:收集SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清處理14 d后的細(xì)胞,取1.0×106個細(xì)胞,標(biāo)記熒光抗體M1、M2及CD80、CD86和CD40,流式細(xì)胞學(xué)檢測M1、M2中CD80、CD86和CD40的表達(dá)情況。

    2 結(jié)果

    2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記(CD64,CD163)表達(dá)情況SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞14d后,M1型巨噬細(xì)胞占(12.37±1.76)%,M2型巨噬細(xì)胞占(22.23±2.21)%,2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此可見,SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞14d后,M0主要向M2型巨噬細(xì)胞分化。見圖1。

    2.2 不同巨噬細(xì)胞亞型中,CD80、CD86和CD40表達(dá)的檢測SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞14d后,流式細(xì)胞術(shù)檢測不同細(xì)胞因子的表達(dá)情況,結(jié)果如下圖。CD80在CD64-M1、CD64-M2上表達(dá)所占百分比分別為:(7.50±1.10)%、(6.60±0.98)%,2組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);CD86在CD64-M1、CD64-M2上表達(dá)所占百分比分別為:(10.53±1.52)%、(10.30±1.50)%,2組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);CD40在CD64-M1、CD64-M2上表達(dá)所占百分比分別為:(10.22±1.10)%、(2.50±0.32)%,2組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、3。

    圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記(CD64,CD163)表達(dá)情況

    圖2 不同巨噬細(xì)胞亞型中,CD80、CD86和CD40的表達(dá)的檢測

    圖3 不同巨噬細(xì)胞亞型中,CD80、CD86和CD40的表達(dá)的檢測

    3 討論

    卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高的疾病。近年來,對于惡性腫瘤的治療出現(xiàn)了一些分子靶向治療藥物,像Herceptin,Gleevec,Sorafenib等。但是卵巢癌的分子靶向治療藥物仍未獲得突破性進展。分子靶向藥物在臨床應(yīng)用中暴露的一些問題使得人們逐漸把目光轉(zhuǎn)移到生物免疫治療上來。腹腔巨噬細(xì)胞與卵巢癌腫瘤細(xì)胞相互作用的研究,對揭示卵巢癌惡性表型有重要意義,同時還能對卵巢癌的免疫治療提供理論基礎(chǔ)。卵巢癌與免疫微環(huán)境相互作用的研究與日俱增,為闡明卵巢癌惡性表型機制提供新的線索。

    研究發(fā)現(xiàn):腹腔微環(huán)境對卵巢的進展與播散用重要作用,晚期卵巢癌患者多有惡性腹水形成,腹水中富含腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM),TAM對卵巢癌耐藥與播散有重要意義[1]。在晚期惡性腹水中分離出的腫瘤TAM高表達(dá)CD163,這種CD163的高表達(dá)與卵巢癌的早期復(fù)發(fā)和腹水IL-6、IL-10的表達(dá)水平相關(guān)。朱亞飛等[2]研究發(fā)現(xiàn):卵巢癌組織中存在M0向M2型的分化,且M2細(xì)胞比例是卵巢癌預(yù)后不良的預(yù)測因素。M2細(xì)胞百分比是卵巢癌預(yù)后的負(fù)相關(guān)因素,M1、M2密度與卵巢癌預(yù)后無關(guān)。而卵巢癌組患者生存率曲線顯示,M2密度及M2細(xì)胞百分比與患者生存時間有關(guān)??梢奙2細(xì)胞比例是影響卵巢癌預(yù)后的因素。

    張婷等[3]研究發(fā)現(xiàn):EOC腹膜內(nèi)激活的因子與浸潤TAM相互作用關(guān)系,提示EOC微環(huán)境內(nèi) 激活的因子可能是誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(MO/MA)分化和極化為M2型細(xì)胞的一個新的分子,表明EOC微環(huán)境中凝血系統(tǒng)的因子除直接作用腫瘤細(xì)胞外,還通過作用于基質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞促進腫瘤的侵襲、浸潤及血管生成。很有可能凝血因子與在EOC種植灶附近MO/MA相互作用產(chǎn)生的趨化因子、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)為腫瘤細(xì)胞沿腹膜表面種植鋪平了道路。另研究發(fā)現(xiàn):卵巢癌惡性進展與卵巢癌微環(huán)境密切相關(guān),通過構(gòu)建腹腔炎性環(huán)境老鼠模型,人卵巢癌腹腔注射,觀察腹腔炎性環(huán)境對卵巢癌進展的影響,發(fā)現(xiàn)腹腔炎性環(huán)境能夠促進卵巢的腹腔播散和腹水形成[4]。并且這種現(xiàn)象和腹腔巨噬細(xì)胞,間皮細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)密切相關(guān)。

    值得注意的是Tanaka等[5]在對89例卵巢癌患者的回顧性研究中發(fā)現(xiàn):TAMs分泌的Bikunin是一種Kunitz-type蛋白酶抑制劑,通過下調(diào)uPA的表達(dá),為無瘤生存率(P=0.040)和總生存期(P=0.042)提高的一項獨立的預(yù)后因素。這個結(jié)果與上述其他研究對TAMs在腫瘤預(yù)后上的結(jié)論不一。

    宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)可明顯改善卵巢癌患者的預(yù)后及生存率,通過加強卵巢癌患者的宿主抗腫瘤免疫反應(yīng),可顯著影響卵巢癌患者的預(yù)后[6]。已有研究表明,M2型巨噬細(xì)胞可以減弱急性期炎癥反應(yīng),抑制免疫應(yīng)答,促進腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移能力,并能夠誘導(dǎo)局部免疫耐受狀態(tài)[7]。通過本實驗可以發(fā)現(xiàn),用SKOV3培養(yǎng)上清處理后的巨噬細(xì)胞,除了亞型轉(zhuǎn)變之外,還有共刺激分子(CD86、CD80、CD40)的改變,這些共刺激分子在巨噬細(xì)胞的活化及免疫應(yīng)答過程中很重要,共刺激分子表達(dá)降低會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞不能產(chǎn)生殺傷腫瘤細(xì)胞,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。其中表達(dá)降低的主要是CD40。CD40可以促進凋亡和Fas基因的表達(dá),并且可以加強抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。

    在單核巨噬細(xì)胞中,CD40與CD40的受體CD40L結(jié)合后可上調(diào)其表面的CD54、CD80、CD86及MHCII的表達(dá),增強抗原遞呈的作用[8],這也可能是該實驗中CD86在M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)與M1型巨噬細(xì)胞無明顯差異的原因;CD40-CD40L還可以促進IL-6、IL-8、IL-12和MMPs的分泌[9]?;罨腡h2細(xì)胞高表達(dá)CD40L,可與B細(xì)胞表面的CD40結(jié)合,產(chǎn)生B細(xì)胞活化的第二信號,協(xié)同刺激B細(xì)胞活化、增殖和分化成漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體,如果CD40-CD40L的相互反應(yīng)中斷可誘導(dǎo)B細(xì)胞的免疫耐受[10]。CD40 與腫瘤血管形成有關(guān),可促進腫瘤細(xì)胞的生長[11]。然而,CD40-CD40L結(jié)合反應(yīng)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,促進抗原提呈細(xì)胞的活化,產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng)。CD40L可抑制IL-10和TGF-β的產(chǎn)生,誘導(dǎo)腫瘤部位的Th1反應(yīng),進而抑制腫瘤的發(fā)生[12]。激活的T細(xì)胞通過CD40-CD40L反應(yīng)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞上MMPs表達(dá),內(nèi)皮細(xì)胞上CD40的表達(dá)又可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá),提高MMP-1和MMP-3的水平,激活MMP-2。內(nèi)皮細(xì)胞上CD40的表達(dá)可引起血管重建,從而為腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移提供物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。原發(fā)性和復(fù)發(fā)性卵巢癌組織以及卵巢癌腹水中均可檢測到CD40,腹水中CD40含量明顯高于實體腫瘤組織中CD40的表達(dá),在原發(fā)性卵巢癌中的表達(dá)又明顯高于復(fù)發(fā)卵巢癌組織[14]。因此,CD40表達(dá)水平的檢測可作為復(fù)發(fā)卵巢癌檢測的指標(biāo)之一。CD40在腫瘤的基因治療中已得到越來越多的應(yīng)用。CD40、CD40L以及CD40/CD40L的結(jié)合反應(yīng)與癌細(xì)胞間作用的分子機制相當(dāng)復(fù)雜,需要進一步研究來闡明它們之間的關(guān)系。

    目前,不同學(xué)者對TAM與卵巢癌的相互作用提出各自看法,基本集中在腫瘤組織、腹膜、腸系膜中TAM的密度、比率或者分泌的細(xì)胞因子與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系等方面。不同研究對TAM與卵巢癌預(yù)后關(guān)系也說法不一。對其研究多停留在與預(yù)后關(guān)系的報道,但相互作用的具體機制、特異的分子靶點報道較少,而這正是指導(dǎo)免疫靶向治療的關(guān)鍵,是有待我們進一步闡明的問題。

    1ReinartzS,SchumannT,FinkernagelF,etal.Mixed-polarizationphenotypeofascites-associatedmacrophagesinhumanovariancarcinoma:correlationofcd163expression,cytokinelevelsandearlyrelapse.IntJCancer,2014,134:32-42.

    2 朱亞飛,胡愛民,張振東,等.卵巢癌組織中m2型巨噬細(xì)胞密度變化及其與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系.山東醫(yī)藥,2011,51:7-9.

    3 張婷,馬政文,王穎,等.凝血因子Ⅱ可誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化為卵巢癌腹膜內(nèi)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2009,4:29-32.

    4Robinson-SmithTM,IsaacsohnI,MercerCA,etal.macrophagesmediateinflammation-enhancedmetastasisofovariantumorsinmice.CancerRes,2007,67:5708-5716.

    5TanakaY,KobayashiH,SuzukiM,etal.Upregulationofbikuninintumor-infiltratingmacrophagesasafactoroffavorableprognosisinovariancancer.GynecolOncol,2004,94:725-734.

    6Mantia-SmaldoneGM,ChuCS.immunotherapyinovariancancer.HumVaccineImmunother,2012,8:1179-1191.

    7AlbertoMantovani,PaolaAllavena,AntonioSica,etal.Cancer-relatedinflammation.Nature,2008,454:436-444.

    8Feder-MengusC,Schultz-ThaterE,OertliD,etal.NonreplicatingrecombinantvacciniavirusexpressingCd40ligandenhancesapccapacitytostimulatespecificCd4+andCd8+Tcellresponses.HumGeneTher,2005,16:348-360.

    9ScottK,ManuntaM,GermainC,etal.Qualitativelydistinctpatternsofcytokinesarereleasedbyhumandendriticcellsinresponsetodifferentpathogens.Immunology,2005,116:245-254.

    10LoskogA,DzojicH,VikmanS,etal.AdenovirusCd40ligandgenetherapycounteractsimmuneescapemechanismsinthetumorenvironment.JImmunol,2004,172:7200-7205.

    11ThorstenV,KatherineC,WoodR,etal.DifferentialexpressionandregulationofmurineCd40inregionalvascularbeds.AmericanJournalofPhysiology.HeartandCirculatoryPhysiology,2006,290:631-639.

    12AndradeRM,WessendarpEA.Tnfreceptor-associatedfactor6-dependentCd40signalingprimesmacrophagestoacquireantimicrobialactivityinresponsetotnf-alpha.TheJournalofImmunology,2005,175:6014-6021.

    13Smola-HessS,SchnitzlerR,HadaschikD,etal.Cd401inducesmatrix-metalloproteinase-9butnottissueinhibitorofmetalloproteinases-1incervicalcarcinomacells:imbalancebetweennf-kappabandstat3activation.Experimentalcellresearch,2001,267:205-215.

    14CiaravinoG,BhatM,ManbeianCA,etal.Differentialexpressionofcd40andCd95inovariancarcinoma.Europeanjournalofgynaecologicaloncology,2004,25:27-32.

    Effects of culture supernatant of ovarian cancer cell line-SKOV3 on costimulatory molecules of macrophages

    SONGYuxia*,ZHAOTao*,ZHANGWeican,etal.

    *DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstHospitalofShijiazhuang,Shijiazhuang050011,China

    Objective To investigate the changes of subtypes of macrophage treated by culture supernatant of ovarian cancer cell line-SKOV3 in vitro,and to explore the differences of expressions of CD80,CD86,CD40 in different subtypes of macrophage.Methods The peripheral blood mononuclear cells were separated from healthy adults by Ficoll density gradient method,which were induced into macrophages by GM-CSF.Then the macrophages were cultured in supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells at exponential growth phase for 14 days. The changes of subtypes of macrophage and the expression levels of CD80,CD86,CD40 in different subtypes of macrophages were detected by flow cytometry.Results The examination results by flow cytometry showed that after the macrophages were treated in supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells for 14 days, the macrophages were mainly differentiated into CD163-M2 subtype macrophages [M1/M2=(12.37±1.76)%/(22.23±2.21)%]. The expression levels of CD40 in CD163-M2 subtype macrophages were significantly decreased,as compared with those in CD64-M1 subtype macrophage (P<0.05).HowevertherewerenosignificantdifferencesintheexpressionlevelsofCD80andCD86betweentwogroups(P>0.05).Conclusion After the macrophages are treated in culture supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells,which are differentiated into different subtypes.Moreover the expression levels of costimulatory molecules are down-regulated in M2 subtype macrophages,as compared with those in M1 subtype macrophages ,which suggests that these costimulatory molecules play an important role in activation of macrophages and immune response,which may be correlated to immune escape of tumor cells.

    ovarian carcinoma;M2 subtype macrophages; CD80/CD86/CD40

    10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.006

    050011 河北省石家莊市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(宋玉霞、趙濤、郭清、王宏衛(wèi)、孟桐羽);河北醫(yī)科大學(xué)(張瑋璨)

    郭清,050011 河北省石家莊市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科;

    E-mail:syx810511@126.com

    R

    A

    1002-7386(2017)08-1144-04

    2016-12-13)

    猜你喜歡
    細(xì)胞培養(yǎng)腹水亞型
    肉雞腹水咋防治
    一例黃顙魚腹水病的處理案例
    酶解大豆蛋白的制備工藝研究及其在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究
    3種陰離子交換色譜固定相捕獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液中紅細(xì)胞生成素的效果比較
    色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:32
    Ikaros的3種亞型對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響
    ABO亞型Bel06的分子生物學(xué)鑒定
    采用PCR和細(xì)胞培養(yǎng)方法比較流感樣病例不同標(biāo)本的流感病毒檢出觀察
    中西醫(yī)結(jié)合治療肝硬化腹水30例
    HeLa細(xì)胞中Zwint-1選擇剪接亞型v7的表達(dá)鑒定
    澤芪湯聯(lián)合腹水超濾回輸治療肝硬化頑固性腹水的43例
    久久香蕉国产精品| 日日夜夜操网爽| 日韩国内少妇激情av| 少妇粗大呻吟视频| 床上黄色一级片| 夜夜爽天天搞| 女人被狂操c到高潮| 国产激情偷乱视频一区二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产一区在线观看成人免费| 成在线人永久免费视频| x7x7x7水蜜桃| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 男女午夜视频在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 美女黄网站色视频| 色播亚洲综合网| 99热6这里只有精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产av在哪里看| 欧美午夜高清在线| 九色成人免费人妻av| 成人午夜高清在线视频| 天天添夜夜摸| 免费观看人在逋| 中国美女看黄片| 国产精华一区二区三区| 在线观看免费午夜福利视频| 桃色一区二区三区在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 曰老女人黄片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 午夜成年电影在线免费观看| 国产熟女xx| 久久久久久九九精品二区国产 | 一夜夜www| 国产成人av教育| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产乱人伦免费视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| av天堂在线播放| 亚洲美女视频黄频| 91av网站免费观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 天堂影院成人在线观看| 男男h啪啪无遮挡| av免费在线观看网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲无线在线观看| 青草久久国产| 高清在线国产一区| 国产午夜精品论理片| 麻豆成人av在线观看| 精品人妻1区二区| 天堂动漫精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 99精品久久久久人妻精品| 男女那种视频在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 午夜免费成人在线视频| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 免费看日本二区| 天堂影院成人在线观看| 国产亚洲精品av在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| a级毛片在线看网站| 欧美极品一区二区三区四区| 91在线观看av| 在线a可以看的网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看| av福利片在线| 看黄色毛片网站| 国产精品影院久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 一区二区三区高清视频在线| 极品教师在线免费播放| 黄色丝袜av网址大全| 国产黄片美女视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精品久久久人人做人人爽| 男人舔女人下体高潮全视频| 99re在线观看精品视频| 精品乱码久久久久久99久播| 制服丝袜大香蕉在线| 桃红色精品国产亚洲av| 国产成人aa在线观看| 国产成人av教育| 后天国语完整版免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久水蜜桃国产精品网| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美zozozo另类| 在线观看免费日韩欧美大片| 两人在一起打扑克的视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久精品国产综合久久久| 在线a可以看的网站| 亚洲 国产 在线| av国产免费在线观看| 午夜免费观看网址| av超薄肉色丝袜交足视频| 很黄的视频免费| 色综合婷婷激情| 在线视频色国产色| 男女视频在线观看网站免费 | 两个人免费观看高清视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久久久精品国产欧美久久久| 成人手机av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费无遮挡裸体视频| 国产99白浆流出| 此物有八面人人有两片| 丰满人妻一区二区三区视频av | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲黑人精品在线| 久久久国产成人免费| 色尼玛亚洲综合影院| 无限看片的www在线观看| 午夜福利高清视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| or卡值多少钱| 免费在线观看黄色视频的| 后天国语完整版免费观看| 级片在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲专区字幕在线| 国产午夜精品久久久久久| 精品久久蜜臀av无| 精品一区二区三区av网在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品av久久久久免费| 免费看日本二区| 亚洲国产精品合色在线| 无遮挡黄片免费观看| 国产伦人伦偷精品视频| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲人成网站高清观看| 欧美日韩精品网址| av欧美777| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久精品欧美日韩精品| 精品无人区乱码1区二区| 毛片女人毛片| 性欧美人与动物交配| 免费一级毛片在线播放高清视频| 午夜视频精品福利| 亚洲18禁久久av| 久久香蕉激情| 看黄色毛片网站| 不卡av一区二区三区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 美女免费视频网站| 99国产综合亚洲精品| 亚洲人与动物交配视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 国产伦人伦偷精品视频| 免费看十八禁软件| 男人的好看免费观看在线视频 | 女同久久另类99精品国产91| 色哟哟哟哟哟哟| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 午夜老司机福利片| 成人亚洲精品av一区二区| 麻豆一二三区av精品| 女同久久另类99精品国产91| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| or卡值多少钱| 久9热在线精品视频| 国产高清videossex| 婷婷亚洲欧美| 久久久久亚洲av毛片大全| АⅤ资源中文在线天堂| 日韩av在线大香蕉| 欧美一级毛片孕妇| 欧美日韩国产亚洲二区| svipshipincom国产片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲成av人片免费观看| 观看免费一级毛片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 嫩草影视91久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日本 欧美在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 中文字幕高清在线视频| 亚洲专区中文字幕在线| 麻豆国产97在线/欧美 | 国产久久久一区二区三区| 国产熟女xx| 久久国产乱子伦精品免费另类| 免费观看人在逋| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| bbb黄色大片| av福利片在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 看免费av毛片| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲av第一区精品v没综合| 一级毛片女人18水好多| www日本黄色视频网| 真人一进一出gif抽搐免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲黑人精品在线| 无限看片的www在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 女人被狂操c到高潮| 999精品在线视频| 国产三级黄色录像| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 无遮挡黄片免费观看| 欧美色视频一区免费| 亚洲最大成人中文| 嫩草影院精品99| 99热这里只有是精品50| 搡老岳熟女国产| 日韩有码中文字幕| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av熟女| 日日爽夜夜爽网站| 在线免费观看的www视频| 性欧美人与动物交配| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品 国内视频| 一级毛片高清免费大全| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产激情久久老熟女| 久久精品人妻少妇| 禁无遮挡网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 黄频高清免费视频| 欧美高清成人免费视频www| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品影院久久| 99久久国产精品久久久| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美成狂野欧美在线观看| 岛国在线观看网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品久久久久久精品电影| 两人在一起打扑克的视频| 两个人的视频大全免费| 一本一本综合久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品久久视频播放| 岛国在线观看网站| 听说在线观看完整版免费高清| 精品国产亚洲在线| 亚洲精华国产精华精| 又黄又粗又硬又大视频| 91成年电影在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 97碰自拍视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲电影在线观看av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲乱码一区二区免费版| 免费在线观看黄色视频的| 一区二区三区激情视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 丰满的人妻完整版| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲国产精品999在线| 精品无人区乱码1区二区| 老司机靠b影院| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产免费男女视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 老司机福利观看| 99国产极品粉嫩在线观看| av福利片在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 操出白浆在线播放| 亚洲 国产 在线| 99在线视频只有这里精品首页| 久热爱精品视频在线9| 成人午夜高清在线视频| 色老头精品视频在线观看| 香蕉丝袜av| 9191精品国产免费久久| 90打野战视频偷拍视频| 99久久99久久久精品蜜桃| АⅤ资源中文在线天堂| 成人欧美大片| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲,欧美精品.| 日韩欧美在线二视频| 美女大奶头视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产av在哪里看| 美女 人体艺术 gogo| 日韩免费av在线播放| 两性夫妻黄色片| 国产精品久久久久久久电影 | 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲一区中文字幕在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 女警被强在线播放| 国产亚洲精品av在线| 国产三级在线视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 级片在线观看| 日韩欧美 国产精品| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 男男h啪啪无遮挡| 成人特级黄色片久久久久久久| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产97色在线日韩免费| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲成人国产一区在线观看| 午夜老司机福利片| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产av一区二区精品久久| 久99久视频精品免费| 婷婷亚洲欧美| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产成+人综合+亚洲专区| 一二三四社区在线视频社区8| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 中文字幕人成人乱码亚洲影| √禁漫天堂资源中文www| 欧美黑人精品巨大| 欧美大码av| 国产精品,欧美在线| 精品久久久久久久久久久久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 美女午夜性视频免费| www国产在线视频色| 成人三级黄色视频| www.精华液| av在线播放免费不卡| 特大巨黑吊av在线直播| 国产又色又爽无遮挡免费看| 在线播放国产精品三级| 国产精品免费一区二区三区在线| 九色国产91popny在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 成人欧美大片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产午夜精品论理片| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美日韩乱码在线| 亚洲国产精品合色在线| 中国美女看黄片| 午夜两性在线视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 少妇的丰满在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 色av中文字幕| 国产精品,欧美在线| 国产成人av激情在线播放| 哪里可以看免费的av片| 国产亚洲精品av在线| 日韩欧美免费精品| 日韩精品中文字幕看吧| 中亚洲国语对白在线视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 午夜精品在线福利| 午夜福利高清视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产不卡一卡二| www.精华液| 国产精品一及| 黄色毛片三级朝国网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 少妇熟女aⅴ在线视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | www.精华液| 精品国产美女av久久久久小说| 久久国产精品人妻蜜桃| av有码第一页| 国产熟女xx| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲九九香蕉| 成年版毛片免费区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲免费av在线视频| 成人三级黄色视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲男人天堂网一区| 丁香六月欧美| 黄频高清免费视频| 一级黄色大片毛片| 在线观看日韩欧美| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产av一区在线观看免费| 丰满人妻一区二区三区视频av | 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久久久大精品| 中文字幕高清在线视频| 日本免费a在线| 午夜激情av网站| 中国美女看黄片| 999精品在线视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| √禁漫天堂资源中文www| 岛国视频午夜一区免费看| 久久 成人 亚洲| 免费观看人在逋| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久国产成人免费| 亚洲真实伦在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 久热爱精品视频在线9| 十八禁人妻一区二区| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久久久久午夜电影| 757午夜福利合集在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日本黄大片高清| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产一区二区激情短视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日韩大码丰满熟妇| 悠悠久久av| 亚洲一区高清亚洲精品| 香蕉av资源在线| 看免费av毛片| 日本免费a在线| 女同久久另类99精品国产91| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲成人中文字幕在线播放| 两个人看的免费小视频| 久久久久久大精品| 国产乱人伦免费视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 最好的美女福利视频网| 成人三级做爰电影| 99热只有精品国产| 搡老熟女国产l中国老女人| 老鸭窝网址在线观看| 老司机靠b影院| 成人国语在线视频| 免费电影在线观看免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 99国产精品一区二区蜜桃av| 悠悠久久av| 又爽又黄无遮挡网站| 国产91精品成人一区二区三区| 99国产精品99久久久久| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产爱豆传媒在线观看 | 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 日本 欧美在线| 亚洲av成人一区二区三| 精品久久久久久,| 久99久视频精品免费| 日韩欧美 国产精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 在线观看www视频免费| 国产av又大| 色哟哟哟哟哟哟| 麻豆成人午夜福利视频| 不卡一级毛片| 99精品久久久久人妻精品| 午夜视频精品福利| bbb黄色大片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久午夜亚洲精品久久| 999精品在线视频| 亚洲人成电影免费在线| 久久精品人妻少妇| 亚洲人成伊人成综合网2020| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲国产看品久久| 亚洲国产精品久久男人天堂| 一进一出好大好爽视频| 九色国产91popny在线| 88av欧美| 国产av麻豆久久久久久久| 久久久国产精品麻豆| 韩国av一区二区三区四区| 中文字幕熟女人妻在线| 成人精品一区二区免费| 久久精品综合一区二区三区| 日韩欧美在线乱码| 丝袜美腿诱惑在线| 久久精品国产综合久久久| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美黄色淫秽网站| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产一区二区在线av高清观看| 久久热在线av| 在线永久观看黄色视频| 国产区一区二久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美中文综合在线视频| 美女黄网站色视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| av国产免费在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 91国产中文字幕| 日本黄大片高清| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产成人系列免费观看| 性欧美人与动物交配| 午夜福利欧美成人| 我要搜黄色片| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 成年版毛片免费区| 亚洲五月婷婷丁香| 日韩免费av在线播放| 桃色一区二区三区在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 日本在线视频免费播放| 日韩欧美三级三区| 国产1区2区3区精品| 亚洲九九香蕉| 国产乱人伦免费视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲成人久久性| av片东京热男人的天堂| av国产免费在线观看| 天堂影院成人在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 中文资源天堂在线| 亚洲黑人精品在线| 动漫黄色视频在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 午夜成年电影在线免费观看| 黄色视频不卡| 一级黄色大片毛片| 国产精品永久免费网站| 国产99久久九九免费精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产三级中文精品| 国产精品永久免费网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久精品综合一区二区三区| 精品不卡国产一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 深夜精品福利| 欧美日韩精品网址| 亚洲免费av在线视频| 国产黄a三级三级三级人| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 又爽又黄无遮挡网站| 一本久久中文字幕| 久久精品91蜜桃| 国产v大片淫在线免费观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 在线观看免费视频日本深夜| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久久久久久午夜电影| 动漫黄色视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 91在线观看av| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 少妇被粗大的猛进出69影院| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | www日本在线高清视频|