PMA結(jié)合ddPCR檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的研究

趙麗青， 王 靜， 秦 燕 ， 賈俊濤， 姜英輝， 唐 靜， 張 健

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266002；2.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 威海 264200)

PMA結(jié)合ddPCR檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的研究

趙麗青1， 王 靜2*， 秦 燕2， 賈俊濤1， 姜英輝1， 唐 靜1， 張 健1

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266002；2.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 威海 264200)

研究了將疊氮溴化丙錠(PMA)與微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)相結(jié)合，用于金黃色葡萄球菌活菌的檢測(cè)。結(jié)果表明，強(qiáng)烈光照15 min，可以使PMA與死菌DNA共價(jià)交聯(lián)，同時(shí)鈍化游離的PMA；可以有效抑制金黃色葡萄球菌死菌DNA PCR擴(kuò)增的PMA終濃度為2.0 μg/mL；不抑制活菌DNA擴(kuò)增的PMA最高濃度是5.0 μg/mL。在不同死、活菌比例下，PMA-ddPCR可以定量檢測(cè)活菌，避免了死菌DNA的干擾，本方法的檢出限為10 copy/20 μL。利用PMA-ddPCR檢測(cè)人工污染雞肉樣品，最低可檢出102cfu/mL的金黃色葡萄球菌。表明PMA-ddPCR方法的靈敏度高。

疊氮溴化丙錠；微滴式數(shù)字PCR；金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)廣泛分布于自然界，是一種重要的人畜共患病病原菌。傳播途徑較多，對(duì)人類(lèi)的安全構(gòu)成威脅。食品中的SA在一定條件下可以產(chǎn)生腸毒素，從而導(dǎo)致食物中毒。至今，已有多起牛奶及奶制品污染SA的事件報(bào)道[1]。因此，對(duì)SA進(jìn)行檢測(cè)十分重要，而檢測(cè)的關(guān)鍵是食品中活菌是否存在和如何準(zhǔn)確定量的問(wèn)題。為檢測(cè)食品中的SA，國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)的微生物定量方法有平板計(jì)數(shù)法、磷酸酶活性定量法、MPN-PCR法等，這些方法耗時(shí)、費(fèi)力，不能滿(mǎn)足快速檢測(cè)的需要。因此，開(kāi)發(fā)定量檢測(cè)活菌的方法非常必要。本研究將基于核酸共價(jià)交聯(lián)技術(shù)從分子水平尋找細(xì)菌活的狀態(tài)的標(biāo)志物，建立活菌的檢測(cè)方法。疊氮溴化丙錠(propidium monoazide, PMA)是對(duì)DNA 具有高度親和力的光敏染料，能夠選擇性地穿透死菌細(xì)胞的細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并且插入細(xì)胞內(nèi)DNA雙螺旋上[2-5]。隨后在強(qiáng)光作用下，已經(jīng)插入到細(xì)胞內(nèi)DNA 雙螺旋上的PMA可與DNA雙螺旋發(fā)生交叉偶合作用，阻止了以此DNA為模版的PCR 反應(yīng)的進(jìn)行。因此PMA和PCR技術(shù)相結(jié)合在定量檢測(cè)活菌方面有巨大的發(fā)展?jié)摿6]。微滴數(shù)字PCR方法(Droplet digital PCR,ddPCR)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的快速、準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)DNA絕對(duì)定量的PCR方法。其原理是通過(guò)把稀釋到一定濃度的DNA分子分布在一定數(shù)目的微滴中，使大部分微滴中的DNA分子數(shù)目為1或0，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)的累計(jì)讀取陽(yáng)性微滴數(shù)目，再根據(jù)泊松分布計(jì)算出樣本中的DNA分子數(shù)。本方法無(wú)需依賴(lài)外部核算標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)核酸絕對(duì)定量分析。ddPCR與qPCR方法相比，本方法無(wú)需核酸標(biāo)準(zhǔn)品，又兼具qPCR方法的優(yōu)點(diǎn)[7]，用于病原體基因檢測(cè)具有更廣闊的應(yīng)用前景。因此，研究和建立金黃色葡萄球菌的PMA-ddPCR方法,對(duì)金黃色葡萄球菌的快速、準(zhǔn)確的定性和定量檢測(cè)具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 金黃色葡萄球菌staphylococcusaureusATCC29213。

1.1.2 試劑與儀器 PMA(1 mg，美國(guó) Biotium公司)：溶解于1.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的DMSO溶液，得到1 mg/mL儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京Tiangen公司)；引物、探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；熒光定量PCR反應(yīng)體系有關(guān)試劑購(gòu)自羅氏公司；微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系有關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司)；7900HT Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；CF16RXII高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；鹵鎢燈(500 W)(飛利浦燈具(上海)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)探針 根據(jù)金黃色葡萄球菌特異的nuc基因片段為靶基因，設(shè)計(jì)引物和探針序列見(jiàn)表1，采用設(shè)計(jì)好的引物和探針建立實(shí)時(shí)熒光PCR方法。

表1 金黃色葡萄球菌特異性PCR擴(kuò)增和探針序列

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及不同脅迫條件下受損細(xì)菌的制備 用接種環(huán)沾取甘油管保存的菌液，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線(xiàn)，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。受損細(xì)菌的制備：吸取3份處于對(duì)數(shù)期的細(xì)菌培養(yǎng)液于離心管中，分別沸水浴5 min，70%異丙醇處理30 min，30 W紫外燈照射30 min，吸取1 mL涂布于平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)24 h觀察是否有菌落長(zhǎng)出。

1.2.3 最佳PMA濃度的選取 取500 μL受損細(xì)菌于1.5 mL離心管中，分別加入PMA使其終濃度為0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、50.0 μg/mL，充分混勻后暗處孵育15 min，每隔5 min顛倒混勻，使PMA最大限度進(jìn)入受損細(xì)胞內(nèi)。將離心管置于500 W鹵鎢燈下20 cm處曝光15 min(管口朝上，置于冰上)，期間每隔5 min混勻，以使樣品溶液曝光均勻。隨后用試劑盒法提取基因組DNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。取500 μL金黃色葡萄球菌液作為對(duì)照組，處理同實(shí)驗(yàn)組。設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 最佳曝光時(shí)間的選取 取500 μL受損細(xì)菌于1.5 mL離心管中，加入終濃度40.0 μg/mL PMA后暗處孵育15 min，置于鹵鎢燈下方20 cm處，分別曝光0、2.0、5.0、10.0、 15.0、20.0 min，隨后用試劑盒提取基因組DNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.5 PMA-qPCR及PMA-ddPCR檢測(cè) 分別利用7900HT Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)和QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。PMA-qPCR反應(yīng)體系(25.0 μL)：12.5 μL LightCycler?480 Probes Master；10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL；10 μmol/L探針0.5 μL；模板DNA 2.0 μL；最后用水補(bǔ)充至25.0 μL。qPCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集FAM熒光。PMA-ddPCR反應(yīng)體系(20.0 μL)：10.0 μL ddPCRTMSupermix for Probes (No dUTP)；10 μmol/L上、下游引物各1 μL；10 μmol/L探針0.5 μL；模板DNA 6 μL；用ddH2O補(bǔ)至20 μL。ddPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min。

1.2.6 qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測(cè)不同比例活菌的比較 配制活菌比例(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為100%、50%、25%、12.5%、0%的金黃色葡萄球菌菌懸液，分別取500 μL于1.5 mL離心管中，qPCR組不加入PMA，PMA-qPCR、PMA-ddPCR組用PMA處理(PMA終濃度為40.0 μg/mL，曝光15 min)，按照試劑盒提取基因組DNA，進(jìn)行qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測(cè)。

1.2.7 PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度 將107cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌液依次稀釋10倍制得濃度為107、106、105、104、103、102、10 cfu/mL的菌液，分別標(biāo)記為J7～J1。在優(yōu)化條件下，進(jìn)行PMA-qPCR、 PMA-ddPCR檢測(cè)。

1.2.8 PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測(cè)人工污染雞肉樣品中金黃色葡萄球菌 取25.0 g新鮮雞肉樣品，用均質(zhì)器制成雞肉勻漿，加入105cfu/mL死菌，然后加入人工污染10～106cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌液，濃度2.0 μg/mL PMA暗處孵育15 min，置于鹵鎢燈下方20 cm處理15 min，在優(yōu)化條件下進(jìn)行PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌在不同受損條件下PMA的處理效果

金黃色葡萄球菌在不同受損條件下PMA的處理效果見(jiàn)圖1。未加PMA處理的對(duì)照組中，熱、異丙醇、紫外燈照射處理得到的金黃色葡萄球菌死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增沒(méi)有明顯差異。加PMA處理的實(shí)驗(yàn)組中，紫外燈照射對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增幾乎沒(méi)有影響，原因是紫外照射只破壞了細(xì)胞中的核酸結(jié)構(gòu)，沒(méi)有破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜；與對(duì)照組相比，熱處理組和異丙醇處理組CT(C代表Cycle，T代表threshold，CT值指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))值均明顯升高，說(shuō)明PMA抑制了其DNA擴(kuò)增。本研究采用了30 W紫外燈照射進(jìn)行處理。

圖1 不同致死方式對(duì)疊氮溴化丙錠進(jìn)入細(xì)胞膜的影響Fig.1 Effects of different lethal modes on PMA into the cell membrane

2.2 最佳PMA濃度的優(yōu)化

不同濃度PMA對(duì)金黃色葡萄球菌的影響見(jiàn)圖2。隨著PMA濃度的增大，死菌DNA qPCR擴(kuò)增的CT值明顯升高，當(dāng)PMA濃度超過(guò)2.0 μg/mL時(shí)， CT值幾乎不再發(fā)生變化。當(dāng)PMA濃度超過(guò)5.0 μg/mL時(shí)，活菌DNA qPCR擴(kuò)增的CT值略高于不加PMA的對(duì)照組，高濃度PMA影響了活菌DNA的qPCR擴(kuò)增。本研究選用2.0 μg/mL PMA為最佳濃度。

圖2 不同濃度疊氮溴化丙錠對(duì)活菌和熱滅活菌的影響Fig.2 Effect of PMA concentration on live and dead Staphylococcus aureus

2.3 最佳曝光時(shí)間的優(yōu)化

曝光時(shí)間對(duì)PMA處理受損金黃色葡萄球菌的影響見(jiàn)圖3。隨著光照時(shí)間的增加，體系的CT值迅速升高，光照時(shí)間超過(guò)15.0 min后，體系的CT值不發(fā)生明顯變化，說(shuō)明PMA和DNA發(fā)生了共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，多余的PMA與水溶液反應(yīng)生成沒(méi)有活性的羥胺。本研究選取15.0 min作為最佳光照時(shí)間。

圖3 曝光時(shí)間對(duì)疊氮溴化丙錠處理死細(xì)胞的影響Fig.3 Optimization of different light exposure

2.4 qPCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌的線(xiàn)性曲線(xiàn)

qPCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌的線(xiàn)性曲線(xiàn)如圖4所示。CT值與金黃色葡萄球菌的濃度在102～108cfu/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系(R=0.999 4)，其線(xiàn)性回歸方程：y=49.641-3.636 5x，方程中y代表DNA qPCR擴(kuò)增的CT值，x代表金黃色葡萄球菌的濃度對(duì)數(shù)值。PMA-qPCR的檢測(cè)限是103cfu/mL。

圖4 金黃色葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Standard curve of Staphylococcus aureus qPCR

2.5 PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度

將原菌液濃度為6.3×105cfu/mL的金黃色葡萄球菌10倍梯度稀釋?zhuān)謩e標(biāo)記為J5～J1進(jìn)行PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖5、6、7。從圖6金黃色葡萄球菌擴(kuò)增散點(diǎn)圖可知，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的PCR體系對(duì)金黃色葡萄球菌基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果良好，其中陽(yáng)性微滴和陰性微滴明顯分成兩簇，而且中間彌散的微滴數(shù)目很少，表明經(jīng)過(guò)優(yōu)化確定的ddPCR探針濃度和擴(kuò)增體系適合金黃色葡萄球菌進(jìn)行定量分析。從圖5可計(jì)算出PMA-ddPCR檢出限為10 copy/20 μL ，圖7中，PMA-qPCR最少可檢出103cfu/mL的金黃色葡萄球菌?？梢?jiàn)，ddPCR方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度非常高。

圖5 疊氮溴化丙錠-數(shù)字PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌靈敏度Fig.5 Sensitivity of Staphylococcus aureus by PMA-ddPCR detection

圖6 疊氮溴化丙錠-數(shù)字PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的一唯散點(diǎn)圖Fig.6 One-dimensional scatter plos of selected wells/samples for Staphylococcus aureus by PMA-ddPCR detection

2.6 肉類(lèi)樣品檢測(cè)

對(duì)不同菌量人工污染的雞肉樣品在優(yōu)化條件下進(jìn)行PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測(cè)，如表1所示，PMA-ddPCR檢測(cè)人工染菌雞肉樣品，最低可檢出102cfu/mL的金黃色葡萄球菌，而PMA-qPCR測(cè)得值與理論添加值偏差較大。PMA-ddPCR對(duì)樣品檢測(cè)的RSD均小于5.0%。

圖7 疊氮溴化丙錠-實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌靈敏度Fig.7 Sensitivity of Staphylococcus aureus by PMA-qPCR detection

理論添加/(cfu·mL-1)PMA-qPCR結(jié)果/(cfu·mL-1)PMA-ddPCR結(jié)果/(cfu·mL-1)J12.1×10NDNDJ22.1×102ND2.60×102J32.1×1039.67×1021.60×103J42.1×1041.34×1031.80×104J52.1×1051.64×1042.06×105J62.1×1061.9×1052.09×106

3 討 論

SA的檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)法、瓊脂擴(kuò)散法、免疫學(xué)檢測(cè)法、血清學(xué)及核酸探針檢測(cè)法，這些方法即費(fèi)時(shí)費(fèi)力，又易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，很難滿(mǎn)足快速檢測(cè)需要[8]。另外，應(yīng)用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的研究，在國(guó)內(nèi)有很多相關(guān)的報(bào)道[9]。但微滴數(shù)字PCR檢測(cè)方法在金黃色葡萄球菌檢測(cè)方面尚不多見(jiàn)。在檢測(cè)中傳統(tǒng)的PCR技術(shù)無(wú)法區(qū)分死菌與活菌，死菌DNA在PCR檢測(cè)中也能擴(kuò)增出目的基因，從而使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)大量假陽(yáng)性。本研究選取SAnuc基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物和探針，將PMA與微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)相結(jié)合，用于金黃色葡萄球菌活菌的檢測(cè)，避免了死菌DNA的PCR干擾。

本研究將原菌液濃度為6.3×105cfu/mL的金黃色葡萄球菌10倍梯度稀釋?zhuān)謩e進(jìn)行PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PMA-ddPCR檢出限為10 copy/20 μL，而PMA-qPCR最少可檢出103cfu/mL的金黃色葡萄球菌。ddPCR方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度非常高。為了評(píng)估PMA-ddPCR對(duì)污染食品樣本的定量檢測(cè)性能，本研究選用人工污染的雞肉樣品進(jìn)行PMA-ddPCR和PMA-qPCR檢測(cè)。最終，PMA-ddPCR對(duì)樣品檢測(cè)的RSD均小于5.0%，而PMA-qPCR測(cè)得值與理論添加值偏差較大。因此，本研究建立的方法較PMA-qPCR有明顯的優(yōu)勢(shì)。

微生物在食品生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷(xiāo)售的整個(gè)過(guò)程中處于動(dòng)態(tài)變化中。如何實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微生物數(shù)量成為微生物控制的關(guān)鍵。本研究建立了一種靈敏度高、檢測(cè)限低、精密度好的檢測(cè)金黃色葡萄球菌活菌的方法，將為食品、水源環(huán)境中金黃色葡萄球菌進(jìn)行大規(guī)模、高通量、多元化、快速檢測(cè)提供了可能。

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Detection ofStaphylococcusaureusin Foods by PMA Combined with ddPCR

ZHAO Li-qing1, WANG Jing2, QIN Yan2, JIA Jun-tao1,JIANG Ying-hui1, TANG Jing1, ZHANG Jian1

(1.Technol.Ctr.,ShandongEntry-ExitInspect. &Quarant.Bur.,Qingdao266002;2.Technol.Ctr.,WeihaiEntry-ExitInspect. &Quarant.Bur.,Weihai264200)

Propidium monoazide (PMA) combined with droplet digital PCR (ddPCR) was used for testing liveStaphylococcusaureusin this study. The results showed that under strong light radiation for 15 min. made the covalent cross linkage between PMA and dead bacteria DNA to happen and free PMA to be deactivated simultaneously; The final PMA concentration of 2.0 μg/mL can effectively inhibit DNA PCR amplification of deadS.aureus; The highest PMA concentration that cannot inhibit DNA PCR amplification of liveS.aureuswas 5.0 μg/mL. Mixture of dead and liveS.aureusin different proportion, PMA-ddPCR can quantitatively detect live bacteria and avoid the interference of dead bacteria DNA. The detection limits of the method was 10 copy/20 μL. Using PMA-ddPCR to detect samples of artificial infected chicken, the minimum ofS.aureuscan be detected was 102cfu/mL. Suggested that PMA-ddPCR method had high sensitivity.

propidium monoazide (PMA); droplet digital PCR (ddPCR);Staphylococcusaureus

國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2014IK114，2016IK198)

趙麗青 女，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士。主要研究方向?yàn)槭称肺⑸镅芯?。Tel：0532-80885629，E-mail：zlq3022@163.com

* 通訊作者。女，高級(jí)工程師，碩士。主要研究方向?yàn)槭称肺⑸镅芯俊?Tel：0631-3807388，E-mail：1094325001@qq.com

2016-03-11；

2016-05-05

Q93；TS207

B

1005-7021(2017)01-0105-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.01.017