單核細(xì)胞增生性李斯特菌inlA和inlB基因缺失菌株的構(gòu)建

劉武康， 李 森， 陳國薇， 羅 勤， 吳 嫚， 丁承超， 謝曼曼， 劉 箐 *

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079)

單核細(xì)胞增生性李斯特菌inlA和inlB基因缺失菌株的構(gòu)建

劉武康1， 李 森1， 陳國薇1， 羅 勤2， 吳 嫚1， 丁承超1， 謝曼曼1， 劉 箐1*

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079)

單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是人畜共患的食源性致病菌，其對惡劣環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，廣泛存在于各種食品加工環(huán)境，容易引起嚴(yán)重的食品安全問題。LM是一種胞內(nèi)寄生菌，其毒力因子內(nèi)化素A(internalin A，InlA)和內(nèi)化素B(internalin B，InlB)被認(rèn)為在LM穿透宿主屏障、入侵宿主細(xì)胞以及胞間傳播等過程中起到重要作用。本文利用同源重組法將LM野生菌株EGDe的inlA和inlB基因的敲除，對inlA和inlB基因缺失菌株的基本生物學(xué)特性進(jìn)行研究，并運(yùn)用RealTime-PCR監(jiān)測LM的毒力基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基因的缺失對突變菌株的生長以及對環(huán)境中的氯化鈉(NaCl)和乙醇(EtOH)的耐受能力沒有影響，但多個毒力基因的表達(dá)量明顯下降。該缺失菌株的構(gòu)建為進(jìn)一步研究InlA和InlB在LM入侵宿主細(xì)胞過程中的具體功能提供了重要材料。

單核細(xì)胞增生性李斯特菌；內(nèi)化素A；內(nèi)化素B；基因敲除；RealTime-PCR

單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一種革蘭陽性、腐生的人畜共患食源性致病菌，在土壤和腐敗植被中大量分布[1]。感染LM的患者致死率可達(dá)20%～30%，死亡病例中以兒童、老人、孕婦等居多，因此LM是毒力最強(qiáng)的食源性致病菌之一[2]。LM對外界生存環(huán)境的適應(yīng)能力快，對惡劣的生存條件如極寒極熱、高滲、強(qiáng)酸強(qiáng)堿等都有較強(qiáng)的抵抗能力，同時LM能生成生物被膜，既能幫助其抵抗外界環(huán)境中的生存壓力，又使其能長期生存在食品加工、運(yùn)輸?shù)冗^程中所使用的工具和器皿上，帶來極大的食品質(zhì)量安全風(fēng)險[3]。LM感染性很強(qiáng)，可以穿透宿主的腸道、胎盤和血腦三大屏障，在宿主細(xì)胞內(nèi)寄生、繁殖并在胞間傳播，LM感染宿主的過程中每一個步驟都需要多個毒力基因共同協(xié)作完成，LM感染宿主的過程可大致概括為內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞、逃逸吞噬、胞質(zhì)內(nèi)移動并在胞間傳播三個主要階段[4]。內(nèi)化素蛋白家族便是LM眾多毒力因子中比較重要的一類，它們在介導(dǎo)LM內(nèi)化進(jìn)入宿主非吞噬細(xì)胞的過程中有著非常重要的作用[5]。InlA和InlB是內(nèi)化素蛋白家族中最重要的內(nèi)化素蛋白，是最早被發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)LM入侵宿主細(xì)胞的內(nèi)化素，也是迄今為止研究最為深入的LM的毒力因子之一。這兩種蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：在N-末端具有相似的結(jié)構(gòu)，如信號肽區(qū)域，富含亮氨酸重復(fù)區(qū)域 (Leucine-rich repeat domain，LRR)等，但I(xiàn)nlA 的C-末端的分選信號(Sorting signal)區(qū)域決定其通過共價結(jié)合的方式固定在細(xì)菌的細(xì)胞壁上，而InlB的C-末端富含甘氨酸/色氨酸的GW基元使其通過靜電作用與細(xì)胞壁中脂磷壁酸結(jié)合，同時由于InlB的N-末端具有分泌信號, 因此也可能被分泌到LM 的胞外[6]。為進(jìn)一步探究InlA、InlB對LM毒力的影響，本研究使用溫敏型穿梭質(zhì)粒pKSV7運(yùn)用同源重組技術(shù)構(gòu)建了inlA和inlB基因缺失的LM基因缺失菌株[7-8]。inlA和inlB基因缺失LM菌株的構(gòu)建為深入研究該毒力基因在LM侵襲宿主細(xì)胞過程中的具體功能提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 血清型為1/2 a單核細(xì)胞增生李斯特菌的野生型菌株EGDe、穿梭質(zhì)粒pKSV7 (大腸埃希菌中為氨芐青霉素抗性，LM中為氯霉素抗性)質(zhì)粒由華中師范大學(xué)羅勤博士饋贈；大腸埃希菌(Escherichiacoli)JM109感受態(tài)細(xì)胞和pMD19-T Vector 購于大連寶生物(TaKaRa)公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 本研究使用的腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、胰蛋白胨、酵母浸粉購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Taq酶、dNTPS、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購于大連寶生物(TaKaRa)公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；細(xì)菌基因組抽提試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 9500型PCR儀和7500型實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國應(yīng)用生物公司(ABI)；SpectraMax M2型多功能全波長酶標(biāo)儀購自美國分子設(shè)備公司(Molecular Devices)；核酸電泳設(shè)備、電轉(zhuǎn)化儀、凝膠成像儀及相關(guān)軟件購自美國伯樂公司(Bio-rad)。

1.2 方法

1.2.1 引物序列 基因敲除操作過程中所使用的引物根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)對LM相關(guān)基因序列的報導(dǎo)使用DNAman軟件自行設(shè)計，引物序列的詳細(xì)信息見表1。A1、A2用于擴(kuò)增inlA的上游片段，A3、A4用于擴(kuò)增inlA的下游片段，A5、A6用于擴(kuò)增inlA編碼區(qū)內(nèi)的片段而鑒定基因是否缺失；B1、B2用于擴(kuò)增inlB的上游片段，B3、B4用于擴(kuò)增inlB的下游片段，B5、B6用于擴(kuò)增inlB編碼區(qū)內(nèi)的片段而鑒定基因是否缺失。引物A1、B1中含有SmaI的酶切位點(diǎn)，A4、B4中含有PstI的酶切位點(diǎn)，A2、A3以及B2、B3中均含有XbaI的酶切位點(diǎn)。

RealTime-PCR所使用的相關(guān)引物由本實(shí)驗(yàn)室其他人員前期設(shè)計，經(jīng)驗(yàn)證特異性良好，此處不再列出詳細(xì)序列信息。

表1 引物序列

1.2.2 LM基因組DNA和總RNA的提取 LM基因組DNA的提取使用細(xì)菌基因組抽提試劑盒，詳細(xì)操作步驟見試劑盒說明書。LM總RNA提取方法：取過夜培養(yǎng)的菌液離心收集菌體，用適量溶菌酶在37 ℃溫浴30 min左右，使用Trizol破碎菌體后加入氯仿(三氯甲烷)震蕩混勻，離心后轉(zhuǎn)移上層水相，加入異丙醇使RNA沉淀，收集沉淀，用適量75%乙醇清洗后用適量無RNase的無菌水溶解沉淀。

1.2.3inlA和inlB基因上下游同源臂的擴(kuò)增及連接 以LM基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并割膠回收，割膠回收具體操作見核酸凝膠回收試劑盒說明書。上下游同源臂單酶切并進(jìn)行電泳、割膠回收，用T4 DNA連接酶過夜連接，連接完成后進(jìn)行T-A克隆并導(dǎo)入JM109感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆保存。

1.2.4 pKSV7重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將連有同源臂的T載體與pKSV7質(zhì)粒使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，電泳后割膠回收，使用T4 DNA連接酶過夜連接并導(dǎo)入JM109感受態(tài)細(xì)胞中。將陽性克隆的質(zhì)粒抽提后進(jìn)行雙酶切鑒定并測序，測序由華大基因完成，測序后將序列比對正確的質(zhì)粒保存待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.5 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化LM感受態(tài)細(xì)胞 根據(jù)Park等[9]的報導(dǎo)，用終濃度為5 μg/mL的青霉素G和3.5×SMHEM溶液(952 mmol/L 蔗糖、3.5 mmol/L MgCl2和7 mmol/L HEPES溶于50 mL雙蒸水，使用0.22 μm濾膜過濾除菌)處理菌體，分裝至小離心管中于-80 ℃保存。電轉(zhuǎn)場強(qiáng)設(shè)置為11.25～12.5 kV，電擊時間為3～4 ms。

1.2.6inlA和inlB基因缺失突變株的篩選與鑒定 將含有重組質(zhì)粒的LM轉(zhuǎn)接到BHI(含10 μg/mL Cam)液體培養(yǎng)基中41 ℃連續(xù)培養(yǎng)并轉(zhuǎn)接8～10次，將末代細(xì)菌培養(yǎng)物劃線于BHI(含10 μg/mL Cam)平板上 41 ℃過夜培養(yǎng)；挑取BHI(含10 μg/mL Cam)平板上的單菌落于BHI液體培養(yǎng)基中30 ℃連續(xù)培養(yǎng)并轉(zhuǎn)接6～8次，取末代培養(yǎng)物劃線于BHI平板，30 ℃過夜培養(yǎng)；挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，并將疑似突變株分別劃線于抗性平板和非抗性平板；對突變區(qū)域的基因序列測序以驗(yàn)證基因完全缺失。

1.2.7 突變株生長曲線及NaCl、EtOH耐受能力的測定 將LM、LM△inlA和LM△inlB接種于BHI液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日取1 mL飽和菌液轉(zhuǎn)接到100 mL新鮮BHI液體培養(yǎng)基中，200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取200 μL菌液加入96孔板中測定OD600，共測定12 h，實(shí)驗(yàn)設(shè)有3個平行組并重復(fù)3次。對菌株NaCl、EtOH耐受能力測定時，將培養(yǎng)基改為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaCl的BHI液體培養(yǎng)基和含有體積分?jǐn)?shù)3% EtOH的BHI液體培養(yǎng)基，其他操作同生長曲線的測定。

1.2.8 RealTime-PCR 將提取的LM、LM△inlA和LM△inlB總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(反轉(zhuǎn)錄試劑盒中含有去除基因組DNA的相關(guān)試劑)，以cDNA為模板進(jìn)行SYBR Green熒光染料法RealTime-PCR，以LM的16S 核糖體RNA為內(nèi)參基因，測定LM的11個主要毒力基因表達(dá)變化。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 本研究所有電泳圖片使用Adobe PhotoShop CS6處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism5處理并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1inlA和inlB基因上下游同源臂的擴(kuò)增

同源臂擴(kuò)增結(jié)果見圖1，inlA基因上游同源臂790 bp(1、2泳道)，下游同源臂873 bp(3、4泳道)；inlB基因上游同源臂747 bp(1、2泳道)，下游同源臂607 bp(3、4泳道)，擴(kuò)增片段與預(yù)期片段大小相符且特異性良好無雜帶。同時確定4對引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時的退火溫度均為56 ℃。

2.2 pKSV7重組質(zhì)粒的構(gòu)建

含有重組質(zhì)粒的陽性克隆篩選、鑒定結(jié)果見圖2，A、B圖中1號泳道均為以無菌水為擴(kuò)增模板的陰性對照，2～5號泳道為鑒定樣本。電泳圖顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功并篩選到陽性克隆，雙酶切鑒定與測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒上連接的目的基因同源臂序列與NCBI 報導(dǎo)的LM相關(guān)基因序列匹配度達(dá)到99%以上，無大量突變和錯配情況存在，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 上下游同源臂擴(kuò)增Fig.1 Amplification of the flanking sequencesA：inlA基因上下游同源臂的擴(kuò)增；B：inlB基因上下游同源臂的擴(kuò)增；M：DL1 000 bp MarkerA: Amplification of the flanking sequences of inlA; B: Amplification of the flanking sequences of inlB; M: DL1 000 bp Marker

圖2 重組質(zhì)粒鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmidA:inlA基因重組質(zhì)粒鑒定;B:inlB基因重組質(zhì)粒鑒定;M:500 bp DNA Ladder MarkerA: Identification of recombinant plasmid of inlA;B: Identification of recombinant plasmid of inlB; M: 500 bp DNA Ladder Marker

2.3inlA和inlB基因缺失突變株的篩選與鑒定

圖3A為inlA基因缺失菌株的篩選結(jié)果，1號泳道為以無菌水為擴(kuò)增模板的陰性對照，2號泳道為以LM基因組DNA作為模板的陽性對照，電泳結(jié)果顯示，4、5號泳道未擴(kuò)增出目標(biāo)片段(448 bp)，說明該樣本為疑似突變株。測序結(jié)果表明樣本中的inlA基因已經(jīng)缺失，而抗性鑒定顯示，基因缺失菌株完全失去氯霉素抗性，將該菌株命名為LM△inlA，菌液凍存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3B為inlB基因缺失菌株的篩選結(jié)果，1號泳道為以LM基因組DNA作為模板的陽性對照，2號泳道為以無菌水為擴(kuò)增模板的陰性對照，電泳結(jié)果顯示，僅有6號泳道未擴(kuò)增出目標(biāo)片段(560 bp)，說明該樣本為疑似突變株。測序結(jié)果表明樣本中的inlB基因已經(jīng)缺失，抗性鑒定顯示基因缺失菌株完全失去氯霉素抗性，將inlB基因缺失的LM菌株命名為LM△inlB，菌液凍存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 基因缺失菌株的篩選Fig.3 Identification of the deletion mutantA:inlA基因缺失菌株鑒定;B:inlB基因缺失菌株鑒定;M:DL1 000 bp MarkerA: Identification of the mutant in inlA;B: Identification of the mutant in inlB;M:DL1 000 bp Marker

2.4 突變株生長曲線和NaCl、EtOH耐受能力的測定

LM、LM△inlA和LM△inlB三株菌株的生長曲線以及NaCl、EtOH耐受能力的測定完成后，以測定時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制曲線。結(jié)果如圖4所示，inlA和inlB基因的缺失對LM的生長和NaCl、EtOH的耐受能力沒有顯著影響，所以inlA和inlB 很可能不是LM的正常生長以及抵御不良生長環(huán)境的過程中必需的基因。由于LM△inlA和LM△inlB的生長能力沒有改變，后續(xù)針對突變菌株毒力、致病性等方面的研究則無需考慮菌株自身生長能力的差異帶來的影響。

圖4 突變株生長曲線和NaCl、EtOH耐受能力測定Fig.4 Growth curvature and NaCl，ethanol tolerance of mutant strainA：生長曲線測定；B：5%NaCl耐受能力的測定；C：3%EtOH耐受能力的測定A:Growth curvature; B:5% NaCl tolerance;C:3% ethanol tolerance

2.5 RealTime-PCR

LM△inlA和LM△inlB的毒力基因RealTime-PCR結(jié)果如圖5所示，LM△inlA和LM△inlB中的hly、plcA、prfA、sigB和srtA均有明顯下調(diào)(P<0.05)，2-△△Ct均在0.5左右，即基因的表達(dá)下調(diào)一半左右；LM△inlB中還有inlA、inlC、plcB、vip基因有明顯下調(diào)(P<0.05)；LM△inlA和LM△inlB中actA基因的表達(dá)量都沒有明顯變化。

圖5 LM毒力基因RealTime-PCRFig.5 RealTime-PCR of virulence genes of LM

3 討 論

本研究運(yùn)用同源重組技術(shù)，成功地對單核細(xì)胞增生性李斯特菌野生型菌株EGDe進(jìn)行了inlA和inlB基因的敲除，同時對突變株的生長、抗脅迫能力進(jìn)行了研究，還利用RealTime-PCR技術(shù)測定了突變株中LM的主要毒力基因表達(dá)變化，為深入研究InlA和InlB在介導(dǎo)LM入侵宿主細(xì)胞過程中的具體作用機(jī)制提供了參考。

本研究使用的基因改造方法為使用溫敏型自殺載體pKSV7，利用載體在41 ℃和氯霉素雙重壓力下整合進(jìn)入LM基因組DNA進(jìn)行復(fù)制的特點(diǎn)，將目的基因上下游同源臂連接于載體上，引導(dǎo)載體在菌體內(nèi)部特定位置進(jìn)行同源重組，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除。此種方法有操作簡單、只需基礎(chǔ)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)備即可進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)，但與目前新興的多種基因編輯技術(shù)相比，存在實(shí)驗(yàn)周期長、依賴專門的穿梭載體、篩選過程中獲得突變株的概率不高等明顯的缺點(diǎn)。目前，將最新的基因編輯技術(shù)應(yīng)用于LM的基因改造還鮮有報導(dǎo)，該領(lǐng)域若能取得突破性進(jìn)展將有助于LM的功能基因、毒力基因的研究。

突變株的生長、抗脅迫能力以及RealTime-PCR等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，inlA和inlB基因的缺失對LM的生長和抗脅迫能力沒有影響，但inlA和inlB基因的缺失造成了多個毒力基因的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的變化。根據(jù)RealTime-PCR的結(jié)果可以初步推測，LM在缺失inlA和inlB基因后，由于hly、inlC等主要用于介導(dǎo)LM入侵宿主細(xì)胞以及prfA、sigB等調(diào)控基因的表達(dá)量下降，其毒力會明顯下降，且主要體現(xiàn)在入侵宿主細(xì)胞能力的減弱，但由于兩株突變株的actA基因表達(dá)沒有明顯變化，因此突變株在胞內(nèi)寄生、運(yùn)動以及胞間傳播的能力可能沒有變化。由于基因調(diào)控的復(fù)雜性和本實(shí)驗(yàn)中RealTime-PCR針對的毒力基因有一定的局限性， LM△inlA和LM△inlB毒力的具體變化情況，還需要進(jìn)行后續(xù)的動物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

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Construction ofinlA &inlB Genes Deletion Strain ofListeriamonocytogenes

LIU Wu-kang1, LI Sen1, CHEN Guo-wei1, LUO Qin2, WU Man1,DING Cheng-chao1, XIE Man-man1, LIU Qing1

(1.Schl.ofMed.Instrum't&FoodEngin.,Uni.ofShanghaiforSci. &Technol.,Shanghai200093;2.Coll.ofLifeSci.,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079)

Listeriamonocytogenes(LM) is a food-borne pathogen shared by human being and animals which has a strong resistance to the adverse environment, and widely exists in various food processing environment and easily causes severe food safety problems. LM is a kind of intracellular parasitic bacterium, its virulence factor internalin A (InlA) and internalin B(InlB)are deemed to play important roles in LM penetrating the host barrier, invading the host cell and the transmission between cells. This paper adopted homologous recombination method to knock out theinlA andinlB genes of the wild strain EGDe and carried out the research on the basic biological characteristics ofinlA andinlB deletion strains, and applied RealTime-PCR to monitored the LM virulence genes’expression. The experimental results showed that its growth and tolerance of NaCl and ethanol (EtOH) were not affected by the mutation, but many virulence genes’expression was significantly decreased. The construction of deletion mutant strains provided important materials for further study on the specific function ofInlA andInlB in the process of LM invading to the host cell.

Listeriamonocytogenes; internalin A; internalin B; gene knock-out; RealTime-PCR

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371776)

劉武康 男，碩士研究生。研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【虏C(jī)理。E-mail：liu_wukang@126.com

* 通訊作者。男，博士，教授。研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【虏C(jī)理及快速檢測技術(shù)。E-mail：liuq@usst.edu.cn

2016-04-08；

2016-06-27

Q933

A

1005-7021(2017)01-0064-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.01.010