EB病毒變異型EBER2對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響

李斐斐， 王其春， 劉芡芡，， 鄧洪巖， 王 云*

(1．青島大學醫(yī)學院 微生物教研室，山東 青島 266021；2．山東省萊鋼醫(yī)院 檢驗科，山東 萊蕪 271126)

EB病毒變異型EBER2對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響

李斐斐1， 王其春2， 劉芡芡1，2， 鄧洪巖1， 王 云1*

(1．青島大學醫(yī)學院 微生物教研室，山東 青島 266021；2．山東省萊鋼醫(yī)院 檢驗科，山東 萊蕪 271126)

EB病毒(EBV)編碼小RNA(EBERs，包括EBER1和EBER2)的致癌作用已在多種細胞系中得到證實，我們前期研究發(fā)現(xiàn)在EBER2基因發(fā)生6處突變的EB-8m變異型可能與鼻咽癌(NPC)的發(fā)生相關(guān)。本研究探討變異型EBER2對NPC細胞增殖和凋亡的影響，以進一步明確EBER2基因變異在NPC發(fā)生中的作用。分別以B95-8原型和EB-8m變異型EBER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EBV陰性NPC細胞系，MTT法和平板克隆檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡。與轉(zhuǎn)染原型EBER2細胞及轉(zhuǎn)染載體的對照細胞比較，轉(zhuǎn)染變異型EBER2細胞的MTT吸光度值和平板克隆形成率增高，細胞凋亡率降低(P均小于0.05)，原型和對照之間細胞增殖無差異，但原型的細胞凋亡率亦低于對照(P<0.05)。上述結(jié)果表明，EB-8m變異型EBER2可通過提高NPC細胞增殖及抗凋亡能力而增強其致癌作用。

EB病毒；EBER2；鼻咽癌；基因變異

EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)是重要的腫瘤相關(guān)病毒，與鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)的發(fā)生密切相關(guān)。EBV致癌機制尚不明確，腫瘤組織中EBV主要以潛伏感染的形式存在，EBV潛伏感染和細胞轉(zhuǎn)化能力是其致癌基礎(chǔ)。EBV編碼小RNA(EBV-encoded small RNAs，EBERs)是所有EBV潛伏感染類型中表達最豐富的mRNA，每個細胞中高達106～107拷貝，是EBV潛伏感染的標志物[1]。EBERs的致癌作用已在淋巴瘤、NPC和胃癌等多種細胞系中得到證實，EBERs基因過表達，可增強這些腫瘤細胞的增殖、抗凋亡及異種動物致瘤能力，因此EBERs在NPC及其他EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生中的作用日益受到關(guān)注[2-3]。EBERs為非編碼RNA，包括167 bp的EBER1和172 bp的EBER2，中間間隔161 bp的非轉(zhuǎn)錄區(qū)。我們前期對山東地區(qū)和廣東地區(qū)NPC及健康人群標本中EBERs基因多態(tài)性的檢測表明，與原型毒株B95-8比較，EBER1基因高度保守，但幾乎所有標本在EBER2編碼區(qū)以及非轉(zhuǎn)錄區(qū)出現(xiàn)突變，在EBER2轉(zhuǎn)錄區(qū)出現(xiàn)6處共有突變的EB-8m變異型在山東地區(qū)和廣東地區(qū)NPC中的檢出率均高于同一地區(qū)健康人群，差異有顯著性(P<0.05)，而且在廣東地區(qū)NPC中的檢出率高達82%，提示EB-8m變異型與NPC的發(fā)生相關(guān)[4-5]。本研究檢測比較原型和EB-8m變異型EBER2基因過表達對NPC細胞增殖和凋亡的影響，進一步明確EBER2基因變異在NPC發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與病毒 EBV陰性NPC細胞系HONE1和CNE1由廣東醫(yī)學院病理科朱偉教授饋贈。EBER2慢病毒表達載體由上海吉瑪生物制藥有限公司構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 引物由南京金思瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、RNA提取試劑TRIzol和噻唑藍(MTT)購自美國Gibco公司；Real-time PCR試劑盒購于Roche公司；細胞轉(zhuǎn)染試劑polybrene和結(jié)晶紫染色液購自美國Sigma公司；嘌呤霉素購自美國Invitrogen公司；Active人類干擾素-α(Interferon α，IFN-α)全長蛋白質(zhì)購自英國Abcam公司；細胞凋亡檢測試劑Annexin V-APC和7-AAD(7-amino-actinomycin D)分別購自美國eBioscience公司和美國BD公司；二甲基亞砜(DMSO)為安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰井a(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Real-time PCR擴增儀(Roche Light Cycler 96型)；流式細胞儀(美國BD 公司Accuri C6型)；酶標儀(美國Bio Tek公司ELx 808型)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒載體構(gòu)建 前期已構(gòu)建了含EBERs原型(EB-B95-8)和EB-8m基因的T-A克隆，并經(jīng)過測序證實序列正確。將EB-8m變異型和EB-B95-8原型的T-A克隆作為摸板，送上海吉瑪生物制藥有限公司進行EBER2基因的慢病毒載體構(gòu)建、包裝、病毒滴定。兩種病毒分別命名為EBER2-B95-8和EBER2-8m，不含外源基因的對照病毒命名為Control。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染目的細胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞篩選 以最佳MOI值50轉(zhuǎn)染CNE1和HONE1細胞(按慢病毒包裝與使用工具手冊操作)，轉(zhuǎn)染成功后，以1 μg/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞后，收集細胞，提取轉(zhuǎn)染細胞RNA，采用Real-time PCR檢測EBER2基因mRNA，RNA提取步驟及 PCR具體步驟按照試劑盒說明進行。Rea-ltime PCR檢測EBER2及內(nèi)參基因GAPDH表達所用引物序列如表1所示。用ΔΔCt法分析基因表達的相對定量，ΔCt= Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt轉(zhuǎn)染基因組-Ct轉(zhuǎn)染對照病毒組，2-ΔΔCt表示轉(zhuǎn)染基因組與對照組比較的相對表達量。

表1 Real-time PCR檢測EBER2基因表達所用引物

1.2.3 細胞增殖實驗 采用MTT法檢測細胞增殖，收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度至5×104個/mL，每孔加入100 μL，鋪96孔板，5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)1～8 d。每24 h加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，每次加入MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490處測量各孔的吸光值，連續(xù)觀察9 d。設(shè)置不加細胞的空白調(diào)零孔，每種細胞設(shè)置6個復(fù)孔，取3次試驗均值。同時進行平板克隆實驗，收集對數(shù)期細胞，0.25%胰蛋白酶消化成單細胞。向6孔板中加入3 mL培養(yǎng)液，每孔加入100個細胞，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細胞分散均勻，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)2周。當培養(yǎng)皿中的克隆肉眼可見時，終止培養(yǎng)。PBS洗2遍，70%乙醇固定30 min，去固定液，加1 mL 0.1%結(jié)晶紫染色30 min，然后清洗細胞，晾干。拍照并計算克隆形成率：克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.2.4 細胞凋亡誘導實驗 收集對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為6×104個/mL，鋪6孔板，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)過夜，加入濃度10 000 IU/mL的 IFN-α，于加藥后72 h，采用Annexin V-APC和7-AAD(7-amino-actinomycin D)雙染，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 3次以上重復(fù)實驗結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，采用完全隨機資料方差分析比較不同實驗組與對照組之間的差異。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，P<0.05時為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的篩選及鑒定

慢病毒轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選后，熒光顯微鏡下觀察，幾乎所有細胞均表達綠色熒光蛋白。采用Real-time PCR擴增檢測EBER2轉(zhuǎn)染細胞中EBER2基因表達，與轉(zhuǎn)染對照病毒組細胞(Control組)比較，轉(zhuǎn)染EB-B95-8型和EB-8m變異型 EBER2基因的CNE1細胞以及HONE1中EBER2基因過表達顯著，CNE1細胞中表達量分別增加了(2 385.37±276.65)和(2 336.28±189.23)倍；HONE1細胞中表達量分別增加了(4 451.27±200.56)和(4 870.99±303.20)倍(圖1A)。以3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測Real-time PCR擴增結(jié)果見圖1B。

圖1 EBER2基因轉(zhuǎn)染細胞中EBER2基因表達Fig.1 The expression of EBER2 in EBER2-transfected cellsA：EBER2轉(zhuǎn)染細胞中EBER2的表達水平；B：Real-time PCR電泳結(jié)果A: The expression levels of EBER2 mRNA in EBER2-transfected cells versus control; B: The results of Real-time PCR showed by agarose gel electrophoresis

2.2 EBER2原型和變異型基因?qū)PC細胞增殖的影響

MTT實驗中從第0～8 天，兩細胞系中各組細胞的吸光度均逐漸增加。在CNE1細胞中，0～4 d 三組細胞間吸光度值無明顯差異(P>0.05)，但5～8 d，EBER2-B95-8組及Control組細胞增殖減慢，EBER2-8m組吸光度值高于EBER2-B95-8組及Control組，差異有顯著性(P<0.05)，EBER2-B95-8組與Control組之間無顯著性差異(P>0.05)(圖2A)；在HONE1細胞中，0～5 d三組細胞間吸光度值無明顯差異(P>0.05)，但6～8 d，EBER2-8m組吸光度值高于EBER2-B95-8組及Control組，差異有顯著性(P<0.05)，EBER2-B95-8組與Control組之間無顯著性差異(P>0.05)(圖2D)。平板克隆實驗表明無論CNE1還是HONE1細胞系，EBER2-8m組細胞克隆形成率均高于EBER2-B95-8及Control組，差異有顯著性(P<0.05)，EBER2-B95-8與Control組相比無顯著性差異(P>0.05)(CNE1：圖2B和C；HONE1：圖2E和F)。

圖2 MTT和平板克隆檢測EBER2轉(zhuǎn)染CNE1及HONE1細胞增殖Fig.2 Effects of EBER2 expression on CNE1 and HONE1 cell proliferation by MTT assay and colony forming assayA：CNE1細胞MTT實驗結(jié)果；B：CNE1細胞平板克隆實驗結(jié)果統(tǒng)計分析；C：CNE1細胞平板克隆實驗照片圖；D：HONE1細胞MTT實驗結(jié)果；E：HONE1細胞平板克隆實驗結(jié)果統(tǒng)計分析；F：HONE1細胞平板克隆實驗照片圖；*：與Control組及EBER2-B95-8比較，P<0.05A: The results of MTT assay for CNE1 cell lines; B: Analysis of the results of colony forming assay for CNE1 cell lines; C: The representative photos of forming colony for CNE1 cell lines; D: The results of MTT assay for HONE1 cell lines; E: Analysis of the results of colony forming assay for HONE1 cell lines; F: The representative photos of forming colony for HONE1 cell lines; *Compared with Control group or EBER2-B95-8 group, P<0.05

2.3 EBER2原型和變異型基因?qū)PC細胞凋亡的影響

采用Annexin V-APC和7-AAD雙染檢測IFN-α誘導細胞凋亡，結(jié)果顯示兩個細胞系EBER2-B95-8組和EBER2-8m組凋亡細胞百分數(shù)(3次實驗均值)均低于Control組，差異均有顯著性(P<0.05)，且EBER2-8m組凋亡細胞百分數(shù)(3次實驗均值)低于EBER2-B95-8組，差異有顯著性(P<0.05)，CNE1細胞的結(jié)果見圖3A和B，HONE1細胞的結(jié)果見圖3C和D。

圖3 流式細胞術(shù)檢測IFN-α誘導細胞凋亡結(jié)果Fig.3 Determination of IFN-α induced apoptosis by flow cytometryA：CNE1細胞流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率的統(tǒng)計結(jié)果；B：CNE1細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；C：HONE1細胞流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率的統(tǒng)計結(jié)果；D：HONE1細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；*：與Control組及EBER2-B95-8比較，P<0.05；**：與Control組比較，P<0.05A: Analysis of the results of flow cytometry for CNE1 cell lines; B: Representative images of flow cytometry for CNE1 cell lines; C: Analysis of the results of flow cytometry for HONE1 cell lines; D: Representative images of flow cytometry for HONE1 cell lines; * Compared with Control group or EBER2-B95-8 group, P<0.05; **Compared with Control group, P<0.05

3 討 論

本研究將攜帶原型和EB-8m變異型EBER2基因的慢病毒成功轉(zhuǎn)染EBV陰性NPC細胞系CNE1和HONE1，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，Real-time PCR結(jié)果顯示2種基因在CNE1和HONE1細胞中均能有效表達。檢測了EBER2過表達對細胞增殖及IFN-α誘導細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示原型和變異型EBER2均可增強細胞的抗凋亡能力，且變異型EBER2還可促進細胞增殖，提示EBER2基因尤其是變異型EBER2基因可以增強NPC細胞的腫瘤原性。

通過體外過表達EBERs進行EBERs功能研究的實驗中，多數(shù)研究過表達的基因包含EBER1、EBER2及上游調(diào)控區(qū)在內(nèi)的基因，研究表明EBERs基因具有促癌作用。將EBERs轉(zhuǎn)染EBV陰性BL細胞系A(chǔ)kata和B淋巴瘤細胞系BJAB，可使細胞回復(fù)惡性表型，如抗凋能力增強、軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成和聯(lián)合免疫缺陷鼠皮下成瘤等[6-9]；轉(zhuǎn)染EBERs的永生化鼻咽上皮細胞NP-69抗凋亡能力和細胞增殖能力增強[10]；轉(zhuǎn)染EBERs的BL細胞系MUTU和Daudi抗凋亡能力增強[9]。Laing 等[11]將EBER1在NIH 3T3細胞中過表達，可提高細胞軟瓊脂克隆生成率。另外有研究采用基因敲除技術(shù)敲除EBV基因組中EBERs基因，證實EBERs在EBV轉(zhuǎn)化B細胞中發(fā)揮重要作用[12-13]；Wu等[13]分別敲除EBER1和EBER2基因，表明EBER2是引起B(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因。Gregorovic等[14]采用表達譜芯片檢測EBV對B細胞基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)EBER2基因缺失EBV比EBER1基因缺失 EBV使B細胞基因表達發(fā)生更大差異。本研究結(jié)果表明EBER2基因尤其是EB-8m變異型EBER2基因也具有致癌作用，進一步提示了EBER2功能的重要性。

本研究結(jié)果還表明與原型EBER2比較，EB-8m變異型提高了NPC細胞系增殖和抗凋亡的能力，提示EBER2基因變異提高了EBERs或EBER2基因的致癌潛能。EB-8m變異型首次在山東地區(qū)樣本中檢出并命名，其在NPC中的檢出率(33.7%，33/95)高于EBV相關(guān)胃癌(2.0%，1/50)和健康人群(1.1%，1/92)，差異有顯著性(P<0.05)[4-5]，我們后續(xù)對NPC高發(fā)區(qū)廣州地區(qū)樣本的檢測表明EB-8m在NPC中的檢出率高達82%(41/50)，高于健康人群(32.4%，24/74)，差異有顯著性(P<0.05)，提示EB-8m變異型與NPC尤其是高發(fā)區(qū)NPC的發(fā)生相關(guān)[5]。除EB-8m變異型外，在山東和廣東地區(qū)樣本中還檢測到B95-8原型和另外兩種變異型，即EB-6m和EB-10m，其中EB-10m和B95-8原型僅見于少數(shù)樣本，山東地區(qū)NPC、EBV相關(guān)胃癌和健康人群及廣東地區(qū)健康人群均以EB-6m為主要亞型。EB-6m發(fā)生6處突變，5處位于非轉(zhuǎn)錄區(qū)，1處位于EBER2基因。來自德國、南非、美國和意大利的EBV相關(guān)惡性和良性疾病的小樣本檢測中，只檢出2種基因型即B95-8和EB-6m，其中大多數(shù)樣本為EB-6m[15-18]。我們對已完整測序的19株EBV毒株的EBERs序列進行分析，發(fā)現(xiàn)來源于廣東和香港NPC的13株毒株中，12株(GD2、M81、C666-1、HKNPC1-HLNPC9)為EB-8m，1株(GD1)為EB-6m；來源于美國傳染性單核細胞增多癥的B95-8和非洲BL的MUTU為B95-8型；來自非洲BL的AG876、日本BL的Akata和美國健康人的K4413Mi和K4123Mi為EB-6m[5]。盡管目前對EBERs多態(tài)性的研究相對較少，但從上述來自不同地域的數(shù)據(jù)可以推測，EB-8m變異型只在廣東地區(qū)NPC組織中具有較高的檢出率，是與NPC相關(guān)的亞型。本研究中功能學的研究結(jié)果進一步支持EB-8m變異型與NPC的發(fā)生相關(guān)。

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Effects of the Variant of Epstein-Barr Virus-Encoded RNA2 (EBER2) to Cell Proliferation and Apoptosis of Nasopharyngeal Carcinoma

LI Fei-fei1, WANG Qi-chun2, LIU Qian-qian1, 2, DENG Hong-yan1, WANG Yun1

(1.Teach&Res.DivofMed.Microbiol.,Med.Coll.,QingdaoUni.,Qingdao266021；2.Div.ofClin.Lab.,LaigangHosp.ofShandongProv.,Laiwu271126)

It has been confirmed that EBV-encoded RNAs (EBERs, including EBER1 and EBER2) contribute to carcinogenesis in multiple cell lines. The previous researches demonstrated that EB-8m variant with 6 common mutants in the EBER2 gene area may be associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC). This study aims to investigate the effects of EBER2 with EB-8m variant to the cell proliferation and apoptosis of EBV-negative NPC cell lines, and so as to further make certain the role of variant EBER2 in the biogenesis of NPC. In EBV-negative NPC cell lines (CNE1 and HONE1) with stable expression of EBER2 prototype (B95-8) or EB-8m variant gene and control cells with vector transfection, the cell proliferation was assessed by MTT test and plate clone forming assay, and the cell apoptosis was evaluated by flow cytometry. Comparison of infection prototype EBER2 cells with control cells of transfection vector, MTT absorbance value and plate clone formation rate increased, and cell apoptosis dampened (Pall <0.05), the proliferation between prototype and control cell had no difference, however, the apoptosis rate of prototype also lower than control (P<0.05). The above mentioned results showed that EB-8m variant EBER2 could strengthen its carcinogenic effects through the increment of NPC cell proliferation and anti-apoptosis ability.

Epstein-Barr virus; EBER2; nasopharyngeal carcinoma; gene variation

國家自然科學基金項目(81171571)；青島市科技計劃項目(13-1-3-50-nsh)

李斐斐 女，碩士研究生。主要研究方向為腫瘤病毒學。E-mial：lifeifei0930@163.com

2016-10-09；

2016-10-21

Q939.93;R373

A

1005-7021(2017)01-0057-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.01.009

* 通訊作者。女，博士，教授，碩士生導師。主要研究方向為腫瘤病毒學。Tel：0532-82991083，E-mial：qdwangyun@aliyun.com