1株產(chǎn)淀粉酶嗜鹽細(xì)菌X50的分類(lèi)鑒定及其粗酶活特性研究

王傳旭， 于慧瑛， 曹建斌， 高文庚， 李 新

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000)

1株產(chǎn)淀粉酶嗜鹽細(xì)菌X50的分類(lèi)鑒定及其粗酶活特性研究

王傳旭， 于慧瑛， 曹建斌， 高文庚， 李 新*

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000)

從運(yùn)城鹽湖分離獲得一株可產(chǎn)淀粉酶的嗜鹽細(xì)菌菌株X50，對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定及酶學(xué)特性分析。采用底物平板法進(jìn)行菌株X50產(chǎn)胞外淀粉酶活性檢測(cè)。通過(guò)16S rRNA基因序列分析對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定。研究不同因素對(duì)菌株X50所產(chǎn)淀粉酶活性的影響。16S rRNA基因序列分析結(jié)果表明，該菌為T(mén)halassobacillus屬成員，命名為T(mén)halassobacillussp. X50。對(duì)其所產(chǎn)淀粉酶酶特性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶最適pH值為6.0，在較寬pH范圍內(nèi)(4.0～12.0)可保持高活力，具有較強(qiáng)的耐酸堿能力。無(wú)鹽條件下，酶活性最強(qiáng)，且該酶具有良好的耐熱性，高溫處理后仍可保持較高活性。除Mg2+對(duì)酶的抑制作用較為顯著外，其他金屬離子基本無(wú)影響。PMSF可明顯抑制該酶活性，而DEPC和EDTA作用不明顯，表明該酶活性中心不含金屬離子，可能為絲氨酸蛋白酶。本文的研究結(jié)果將為促進(jìn)運(yùn)城鹽湖極端微生物資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

嗜鹽細(xì)菌；Thalassobacillus；分類(lèi)鑒定；淀粉酶；酶學(xué)特性

淀粉酶是水解淀粉和糖原的一類(lèi)酶的統(tǒng)稱(chēng)，其產(chǎn)量約占工業(yè)酶總產(chǎn)量的85%以上。淀粉酶在食品加工、焙烤、發(fā)酵、紡織、輕工業(yè)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用廣泛[1-2]。然而，工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的高溫、酸堿和重金屬等嚴(yán)苛條件，制約著淀粉酶的應(yīng)用。在這些條件下，淀粉酶的穩(wěn)定性下降，酶的活力大幅度損失或者完全喪失，使用壽命及使用效率降低。因此，開(kāi)發(fā)具有高穩(wěn)定性的生物酶，使其可以適應(yīng)高溫、高酸堿等苛刻的工業(yè)環(huán)境，是近年來(lái)亟待解決的重要課題。嗜鹽細(xì)菌對(duì)外界自然環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，是一類(lèi)重要的極端微生物資源。噬鹽菌可以在較高的鹽濃度環(huán)境中生存，其最適鹽濃度一般為0.5%～36%[3]。同嗜鹽細(xì)菌的生存條件相適應(yīng)，這類(lèi)細(xì)菌產(chǎn)生的各種酶往往具有一些獨(dú)特的生物學(xué)特性，如耐鹽、耐高/低pH、耐有機(jī)溶劑等。在一些外部條件變化較大時(shí)，嗜鹽細(xì)菌產(chǎn)生的酶往往可以保持較高的活性，這種特性特別適合于工業(yè)生產(chǎn)，也是普通的微生物酶無(wú)法比擬的[4-5]。近年人們將研究的注意力轉(zhuǎn)向嗜鹽微生物，其產(chǎn)生的多種功能酶也相繼報(bào)道[6-8]，但相關(guān)報(bào)道仍然較少。本課題組采用稀釋涂布平板法，從運(yùn)城鹽湖中分離獲得了一批嗜鹽微生物菌株，采用底物平板法篩選得到一株高產(chǎn)胞外淀粉酶的菌株。在此基礎(chǔ)上，克隆該菌株的16S rRNA基因并測(cè)序，對(duì)該基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，利用分析結(jié)果進(jìn)行簡(jiǎn)單的分類(lèi)學(xué)鑒定，同時(shí)對(duì)其產(chǎn)生的胞外淀粉酶的酶活特性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 菌株X50分離自運(yùn)城鹽湖所采的黑泥樣品，由本實(shí)驗(yàn)室保存。CM液體培養(yǎng)基(g/L)：酸水解酪蛋白7.5，檸檬酸三鈉3.0，酵母浸出物10.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，KCl 2.0， MgSO4·7H2O 20.0， NaCl 100.0，pH 7.5。CM固體培養(yǎng)基：在CM液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂。篩選固體培養(yǎng)基：在CM固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的可溶性淀粉。菌株X50于37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。

1.1.2 主要試劑及儀器 配置培養(yǎng)基所需要的蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖等及實(shí)驗(yàn)中需要的常見(jiàn)藥品如PMSF、EDTA等購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；DNA marker、DNA聚合酶、PCR引物等購(gòu)自大連TaKaRa公司；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀)；立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50K(上海申安醫(yī)療器械廠)；電泳儀DYY-6C(北京市六一儀器廠)；電熱鼓風(fēng)干燥培養(yǎng)箱101-51ES(汗諾儀器)。

1.2 方法

1.2.1 菌株X50的16S rRNA基因序列比對(duì)分析 利用提取的菌株X50的總DNA作為模板，選用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。其中采用的正向引物(27f)：5′-GAGTTTGATCCTGGTCAG-3′，反向引物(1540r)：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR體系：基因組總DNA(約50 mg/L) 1 μL，PCR Buffer 2 μL，dNTPs (20 mmol/L) 1.6 μL, 正反向引物(5 μmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶0.125 μL，加水至20 μL。針對(duì)該菌株，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 6 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物送交北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司完成測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交至GenBank獲得基因登錄號(hào)并進(jìn)行Blast比對(duì)分析，在分析結(jié)果中選取同源性較高的相關(guān)序列進(jìn)行多重序列比對(duì)(所用軟件為Bioedit)，之后利用MEGA 5.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)菌株X50進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.2 菌株X50產(chǎn)淀粉酶檢測(cè) 將菌株X50在CM篩選固體培養(yǎng)基上37 ℃劃線培養(yǎng)2 d后，將盧戈氏碘液(0.4 mol/L)均勻噴灑至平板上，觀察透明圈大小。

1.2.3 粗酶液的制備 菌株X50在液體CM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液離心 (4 ℃, 10 000 r/min, 10 min)，離心所得上清液即為粗酶液，保存于4 ℃，或立即用于之后的實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.4 淀粉酶活性測(cè)定 ①淀粉酶活力檢測(cè)方法：篩選固體CM培養(yǎng)基(加入1%可溶性淀粉)倒入培養(yǎng)平板中待其凝固，用鑷子將牛津杯擺放在培養(yǎng)基上，將制備好的粗酶液200 μL注入牛津杯中，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察有無(wú)透明圈。②淀粉酶粗酶特性研究：最適作用溫度：在不同溫度下(0、20、40、60、80、100、120 ℃)利用杯碟法檢測(cè)透明圈直徑，以測(cè)得的透明圈直徑與最大直徑的比值為該淀粉酶的相對(duì)活性，繪制溫度-相對(duì)活性曲線。最適作用pH：利用不同pH (4、6、8、10、12)緩沖液配制反應(yīng)液，檢測(cè)酶活力，采用杯碟法檢測(cè)透明圈直徑，以測(cè)得的透明圈直徑與最大直徑的比值為該淀粉酶的相對(duì)活性，繪制pH-相對(duì)活性曲線。最適鹽度：于不同鹽濃度(NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、5%、10%、15%、20%、25%)下，利用杯碟法檢測(cè)透明圈直徑，以測(cè)得的透明圈直徑與最大直徑的比值為該淀粉酶的相對(duì)活性，繪制鹽濃度-相對(duì)活性曲線。不同金屬離子及其他物質(zhì)對(duì)粗酶活性的影響：將粗酶液分別與不同金屬離子(Fe2+、Hg2+、Cu2+、K+、Ca2+、Fe3+、Mg2+、Zn2+, 10 mmol/L)、EDTA (10 mmol/L)、DEPC (10 mmol/L)和PMSF (10 mmol/L)溶液混合后，靜置20 min，取1 mL酶液在最適條件下檢測(cè)粗酶活力，采用杯碟法檢測(cè)透明圈直徑，以測(cè)得的透明圈直徑與最大直徑的比值為該淀粉酶的相對(duì)活性，繪制離子/化合物-相對(duì)活性曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株X50的分類(lèi)學(xué)鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增菌株X50的16S rRNA基因，獲得大小為1462 bp的基因片段并提交測(cè)序結(jié)果至GenBank (登錄號(hào)：KM974802)。將比對(duì)結(jié)果利用mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明,菌株X50與Thalassobacillus屬內(nèi)各種的同源性很高，可以達(dá)到98.0%～99.0%，系統(tǒng)發(fā)育分析歸于同一分枝(圖1)，由此確定其為T(mén)halassobacillus屬成員，命名為T(mén)halassobacillussp. X50。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株X50的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of strain X50 based on 16S rRNA gene sequence

2.2 菌株X50產(chǎn)胞外淀粉酶活性檢測(cè)

將菌株X50劃線接種于含淀粉的CM篩選固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d，將篩選培養(yǎng)基用盧戈氏碘液顯色并觀察透明圈。結(jié)果顯示菌株X50的菌落周?chē)霈F(xiàn)明顯的無(wú)色透明圈(圖2)，表明其產(chǎn)生了胞外淀粉酶。

圖2 菌株X50產(chǎn)胞外淀粉酶活性檢測(cè)Fig.2 Detection of extracellular amylase produced by strain X50

2.3 粗酶特性研究

2.3.1 淀粉酶最適溫度、pH和鹽度 溫度對(duì)粗酶活力的影響如圖3所示，菌株X50所產(chǎn)淀粉酶的活性受溫度影響不大。該酶在低于40 ℃的條件下活性最強(qiáng)，60 ℃對(duì)該淀粉酶的活性有較小的影響，但隨著溫度的升高，甚至在100 ℃以上時(shí)該酶仍然具有很高的活性。結(jié)果表明，X50所產(chǎn)淀粉酶具有良好的耐熱性，可以在較高的溫度下表現(xiàn)較好的酶活性。pH對(duì)粗酶活力的影響見(jiàn)圖4，該淀粉酶最適反應(yīng)pH為6.0，但在pH 4.0～12.0范圍內(nèi)均可保持高活力，說(shuō)明該酶在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境下均不影響其酶活性的發(fā)揮。此外，菌株X50所產(chǎn)淀粉酶在無(wú)NaCl條件下，酶活力最強(qiáng)，且在較寬的鹽濃度范圍內(nèi)(0～25%)，NaCl的濃度不影響該淀粉酶的活性(圖5)。以上結(jié)果表明，X50菌株所產(chǎn)的淀粉酶具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，可以在高溫、強(qiáng)酸堿以及不同的鹽濃度條件下保持較高的活性，這種特點(diǎn)預(yù)示該酶可以廣泛地應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。

圖3 溫度對(duì)粗酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of crude amylase.

圖4 pH對(duì)粗酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of crude amylase.

圖5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)粗酶活力的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on the activity of crude amylase

2.3.2 金屬離子等對(duì)粗酶活性的影響 在最適酶反應(yīng)條件下，不同的金屬離子和化合物對(duì)該淀粉酶活性有不同的影響。除了Hg2+不影響該淀粉酶的活性之外，其余金屬離子對(duì)酶活都有不同程度的抑制作用。在這些金屬離子或者抑制劑中，Mg2+和PMSF對(duì)酶的抑制作用最為明顯，但該淀粉酶仍具有一定的活性(圖6)?？傮w上，除Mg2+和PMSF外，大部分金屬離子、DEPC和EDTA對(duì)該淀粉酶活力的影響不明顯，說(shuō)明該菌株X50產(chǎn)生的胞外淀粉酶對(duì)金屬離子和部分酶抑制劑不敏感，具有活性非常穩(wěn)定的特點(diǎn)。

圖6 屬離子及化合物對(duì)粗酶活性的影響注Fig.6 Influence of metal ions or compounds on the activity of crude amylase

3 討 論

淀粉酶可以將淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和其他寡糖，已被廣泛應(yīng)用于焙烤、紡織、造紙和啤酒釀造等工業(yè)生產(chǎn)中，具有廣闊地應(yīng)用前景。利用微生物資源獲得高穩(wěn)定性及易提取純化的淀粉酶，是淀粉酶生產(chǎn)的重要方向。 近年來(lái)，本課題組針對(duì)運(yùn)城鹽湖嗜鹽微生物資源開(kāi)展了一系列的科研工作，在鹽湖中分離了一批嗜鹽菌株，開(kāi)發(fā)其潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究利用底物平板法，獲得一株高產(chǎn)胞外淀粉酶的嗜鹽細(xì)菌X50，通過(guò)16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌株為T(mén)halassobacillus屬成員。隨著人們對(duì)嗜鹽微生物的研究逐漸增多，目前已獲得了大量具有潛在應(yīng)用前景的新型生物酶[10-12]。Amoozegar等通過(guò)對(duì)來(lái)源于Halobacillussp. strain MA-2菌株的淀粉酶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其最適作用條件為50 ℃和pH 7.5～8.0[13]，這與我們報(bào)道的菌株X50所產(chǎn)淀粉酶最適條件(40 ℃，pH 6.0)比較接近。然而，金屬離子等可以顯著影響菌株MA-2所產(chǎn)淀粉酶的活性[13]，這一點(diǎn)同我們所分離的菌株X50不同。另外，和MA-2菌株相比，菌株X50所產(chǎn)的胞外淀粉酶可以很好地抵抗酸堿的影響，并具有耐熱及耐鹽等特點(diǎn)，在高溫條件和pH 4.0～12.0的范圍內(nèi)，X50依然保持著較高的酶活性。此前有文獻(xiàn)報(bào)道嗜鹽微生物所產(chǎn)的淀粉酶需要鈣離子參與[14-15]，但是，本研究結(jié)果顯示，EDTA并沒(méi)有降低該淀粉酶的活性，說(shuō)明其催化活性可能不依賴(lài)金屬離子的存在。這一點(diǎn)與之前的報(bào)道明顯不同。本研究發(fā)現(xiàn)，PMSF可顯著抑制該酶活性，說(shuō)明該酶結(jié)構(gòu)中存在絲氨酸殘基。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為T(mén)halassobacillussp. X50所產(chǎn)胞外淀粉酶與其他微生物淀粉酶相比，存在共性，同時(shí)其結(jié)構(gòu)上的某些差異可能使其產(chǎn)生了更穩(wěn)定的特性。

大量研究表明，由嗜鹽微生物產(chǎn)生的各種功能酶可以廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域。然而迄今為止，人們對(duì)這一方面的研究還不深入，關(guān)于嗜鹽細(xì)菌產(chǎn)淀粉酶的報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)嗜鹽細(xì)菌所產(chǎn)的淀粉酶酶學(xué)特性及作用機(jī)理的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。因此開(kāi)發(fā)具有產(chǎn)淀粉酶能力的功能性嗜鹽微生物，將對(duì)其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本研究利用選擇CM固體培養(yǎng)基，在運(yùn)城鹽湖黑泥中篩選到一株產(chǎn)胞外淀粉酶的噬鹽菌并將其命名為X50。16S rRNA進(jìn)化樹(shù)分析顯示該菌株為T(mén)halassobacillus屬成員，命名為T(mén)halassobacillussp. X50。對(duì)其產(chǎn)生的淀粉酶活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明該菌株所產(chǎn)淀粉酶具有良好的穩(wěn)定性，可以耐受較為苛刻的外部條件，在較寬的pH范圍，較大的溫度變化及金屬離子和部分化合物的作用下，可以保持穩(wěn)定的活性。該嗜鹽菌株X50的分類(lèi)鑒定和粗酶活性分析可以為運(yùn)城鹽湖的生物資源開(kāi)發(fā)提供參考。

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Characterization of a Halophilic Bacterium X50 and Analysis of Its Amylase Activity

WANG Chuan-xu, YU Hui-ying, CAO Jian-bin, GAO Wen-geng, LI Xin

(Coll.ofLifeSci.,YunchengUni.,Yuncheng044000)

A halophilic bacterium strain X50 that could produce amylase was isolated from Yuncheng salt lake, and carried out its classification and characterizations, and enzymological properties analysis. The activity of extracellular amylase produced by strain X50 was determined adopting substrate plate method. And studied the effects of different factors on the amylase activity produced by the strain X50. The results of 16S rRNA gene sequence analysis showed that the strain wasThalassobacillus, and named it asThalassobacillussp. X50. The results of initial study on the enzymology of the amylase showed the optimal pH of the amylase was 6.0, and maintained its high activity at fairly wide range of pH at 4.0～12.0, and possessing fairly strong resistance capacity against acid-base. Under salt-free condition, the amylase activity was the strongest, furthermore, it has fine property of heat resistance, even after high temperature treatment. Except for Mg2+that significantly inhibited the amylase, basically no effects of other metal ions on it. PMSF could significantly inhibit its activity, however, the effect of DEPC and EDTA on the amylase activity was not significant, indicated that the center of the enzyme activity contained no metal ion, probably was serine protease. The results of this study provide theoretical foundation and will promote the development and utilization of the extreme microbial resources in Yuncheng salt lake.

halophilic bacterium;Thalassobacillus; classification characterization; amylase; enzymological properties

山西省青年科技研究基金項(xiàng)目(2015021141)；運(yùn)城學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(YQ-2016015)

王傳旭 男，講師，博士。研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。Tel:0359-2508575，E-mail:wangchuanxu1985@163.com

* 通訊作者。男，副教授，博士。研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。Tel:0359-2508575，E-mail:lixin-eva@163.com

2016-04-11；

2016-06-20

Q939

A

1005-7021(2017)01-0078-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.01.012