秸稈藍(lán)藻混合發(fā)酵產(chǎn)沼氣過(guò)程中微生物群落分析

穆維娜， 李玉成， 武 超， 張學(xué)勝， 王 寧， 高兆慧

(安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230601)

秸稈藍(lán)藻混合發(fā)酵產(chǎn)沼氣過(guò)程中微生物群落分析

穆維娜， 李玉成*， 武 超， 張學(xué)勝， 王 寧， 高兆慧

(安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230601)

采用實(shí)驗(yàn)室自制秸稈藍(lán)藻混合厭氧反應(yīng)裝置進(jìn)行沼氣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，利用16S rRNA基因克隆文庫(kù)的方法，對(duì)不同產(chǎn)氣階段的細(xì)菌和古菌的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行多樣性研究。結(jié)果表明：①不同產(chǎn)氣階段細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種類(lèi)存在差異，供試秸稈沼氣反應(yīng)器階段細(xì)菌種類(lèi)較為豐富，分屬于6個(gè)門(mén)：產(chǎn)氣初始階段優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)(Proteobacteria)，相對(duì)豐度為51.76%；產(chǎn)氣高峰階段優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，相對(duì)豐度為47.13%；產(chǎn)氣結(jié)束階段優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，相對(duì)豐度為28.89%；此外，還包括綠彎菌門(mén)、螺旋體門(mén)、綠菌門(mén)的細(xì)菌。②古菌種類(lèi)明顯少于細(xì)菌，均屬于甲烷微菌綱(Methanomicrobia)、甲烷桿菌綱(Methanobacteria)和熱原體綱(Thermoplasmata)。秸稈藍(lán)藻沼氣系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的闡明具有一定的意義，可為秸稈沼氣工程調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

秸稈；混合發(fā)酵；微生物群落；克隆文庫(kù)

安徽省作為農(nóng)業(yè)大省，每年都有大量的秸稈產(chǎn)生，主要農(nóng)作物秸稈年理論資源量達(dá)4 487.99萬(wàn)t，年可收集資源量達(dá)3 878.84萬(wàn)t[1]。秸稈作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的副產(chǎn)品是一種容易獲取的生物能源，然而大量的秸稈被隨意丟棄和焚燒，造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[2]。巢湖是中國(guó)第五大淡水湖，連通長(zhǎng)江，巢湖的水質(zhì)不僅會(huì)影響到其周邊環(huán)境，還會(huì)影響到整個(gè)長(zhǎng)江流域。巢湖水體近年來(lái)富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，藍(lán)藻暴發(fā)成為環(huán)境問(wèn)題。藍(lán)藻含豐富的有機(jī)質(zhì)，是一種生物質(zhì)資源[3]。厭氧發(fā)酵可以使秸稈和藍(lán)藻轉(zhuǎn)化為清潔能源，既保護(hù)了環(huán)境也使資源得到了利用[4]。秸稈是一種富含木質(zhì)纖維素與其他多糖的有機(jī)質(zhì)，而藍(lán)藻中含豐富的蛋白質(zhì)和藻多糖，利用含氮量比較豐富的藍(lán)藻調(diào)節(jié)底物的碳氮比，可以提高發(fā)酵的效率[5-6]。彭書(shū)傳等利用玉米秸稈和巢湖藍(lán)藻進(jìn)行混合厭氧發(fā)酵，與單一的玉米秸稈或藍(lán)藻發(fā)酵過(guò)程相比，玉米秸稈和藍(lán)藻混合發(fā)酵能夠有效促進(jìn)沼氣的生成[7]。有機(jī)物厭氧降解過(guò)程主要分為水解發(fā)酵、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸及產(chǎn)甲烷3個(gè)階段。其中水解發(fā)酵與產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段主要由細(xì)菌參與，涉及一系列復(fù)雜的化學(xué)代謝過(guò)程，生成乙酸等揮發(fā)性有機(jī)酸；而產(chǎn)甲烷階段主要由甲烷古菌參與，將乙酸轉(zhuǎn)化為甲烷[8]。沼氣發(fā)酵過(guò)程需要不同階段的微生物相互協(xié)作完成，因此沼氣發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的解析已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)[9]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用秸稈進(jìn)行發(fā)酵的微生物群落研究主要集中在秸稈和禽畜糞便等常規(guī)原料的混合上[10]，而以秸稈和藍(lán)藻混合發(fā)酵為對(duì)象的研究鮮有報(bào)道。分子生物學(xué)技術(shù)在微生物鑒定方面的應(yīng)用，可以研究微生物在厭氧發(fā)酵過(guò)程中變化情況[11-13]。本文在秸稈藍(lán)藻混合厭氧產(chǎn)氣的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫(kù)，了解混合發(fā)酵不同階段的細(xì)菌和古菌的優(yōu)勢(shì)菌群及其變化規(guī)律，為調(diào)控混合發(fā)酵過(guò)程提供微生物基本信息。結(jié)合不同產(chǎn)氣階段的產(chǎn)氣率，解析沼氣發(fā)酵各階段優(yōu)勢(shì)微生物的功能，為優(yōu)化秸稈沼氣發(fā)酵工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)所用水稻秸稈采自安徽省周邊某稻田，總固體(TS)含量為91.1%，揮發(fā)性固體(VS)含量為85.9%，曬干后剪至1 cm左右待用;新鮮藍(lán)藻采自巢湖塘西河口，總固體(TS)含量為1.96%，揮發(fā)性固體(VS)含量為91.58%，經(jīng)濾網(wǎng)濾水后裝入自封袋置于冰箱冷凍備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)常溫解凍待用；接種污泥采自實(shí)驗(yàn)室35 ℃中溫厭氧發(fā)酵反應(yīng)器剩余污泥，TS=3.9%，VS=72.51%，pH=7。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)裝置 實(shí)驗(yàn)裝置主要由發(fā)酵瓶、集氣瓶、集水瓶組成(見(jiàn)圖1)。

圖1 厭氧發(fā)酵裝置圖Fig.1 Schematic diagram of bio-gas fermentation system

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵與取樣 將處理后秸稈與解凍新鮮藍(lán)藻按碳氮比為25∶1混合成發(fā)酵原料。將原料分別置于4 L厭氧發(fā)酵罐中，加入500 mL厭氧污泥，配水至2.5 L，調(diào)節(jié)反應(yīng)總底物的pH至(7.0±0.05)?；靹蚝笱b入反應(yīng)器內(nèi)，用氮?dú)鈱?duì)整個(gè)裝置進(jìn)行吹氮除氧0.5 h以上。密封后進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度35 ℃，每天保證人為手動(dòng)振蕩搖晃發(fā)酵瓶2～3次，防止顆粒污泥沉淀或秸稈藍(lán)藻浮于液面。共采樣3次，分別在第1、7、29天取樣，將樣品依次命名為d1、d7、d29。樣品采集前，先排空采樣管道中殘余的厭氧污泥，然后再將厭氧污泥向外流動(dòng)幾分鐘后從反應(yīng)器中取固液混合樣30 mL裝入無(wú)菌聚丙烯離心管中，凍存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2.2 常規(guī)測(cè)試方法 TS：105 ℃烘至恒重；VS：于550 ℃馬弗爐中燒至恒重；沼氣產(chǎn)量：采用水壓集氣法，每日測(cè)量排出的飽和食鹽水總量；甲烷含量：采用安捷倫7890A氣相色譜測(cè)定。

1.2.3 基因組DNA提取 基因組DNA的提取采用QIAamp DNA Stool mini kit基因組提取試劑盒。為了保證提取樣品的基因組DNA的代表性，每個(gè)厭氧污泥樣品平行提取3次，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)基因組DNA的提取結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 克隆文庫(kù)構(gòu)建 用16S rRNA基因通用引物分別對(duì)3個(gè)樣品中的細(xì)菌和古菌的16S rRNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中細(xì)菌引物序列為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-TACG GCTACCTTGTTACGACTT-3′)；古菌引物序列為AR109F(5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′)，AR-912r(5′-CTCCCCCGCCAATTCCTTTA-3′)。PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min(古菌16S rRNA基因延伸時(shí)間1 min)，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段并用膠回收試劑盒(TAKARA，大連)進(jìn)行純化。純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用pUC-mT載體(生工，上海)依操作說(shuō)明進(jìn)行連接，采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans 1大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞(全式金，北京)中。通過(guò)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆對(duì)于每個(gè)克隆文庫(kù)，隨機(jī)挑取96個(gè)白色克隆子進(jìn)行PCR鑒定，引物采用M13F/M13R。

1.2.5 酶切分型與測(cè)序 將鑒定為陽(yáng)性PCR產(chǎn)物的片段用HhaI和Hind III限制性?xún)?nèi)切酶消化(37 ℃)，酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，據(jù)酶切電泳圖，將酶切圖譜完全一致的克隆子劃分為1個(gè)操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit，OTU)[14]，統(tǒng)計(jì)各OTU所含陽(yáng)性克隆的數(shù)量，每個(gè)酶切分型選取一個(gè)代表克隆送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得的16S rRNA基因序列與測(cè)定序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性檢索，使用MEGA 6.06軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈藍(lán)藻混合發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)

發(fā)酵期間日產(chǎn)氣量及每日甲烷含量如圖2所示。反應(yīng)開(kāi)始1 d快速產(chǎn)氣，7 d達(dá)到產(chǎn)氣高峰(397 mL)。然后隨著原料的減少而逐漸下降，在12 d達(dá)到第2次產(chǎn)氣高峰(300 mL)。甲烷濃度在9 d達(dá)到63%，隨后小幅回落后上升，并保持50%以上；前12 d為單日產(chǎn)氣量較高，12 d后進(jìn)入緩慢增長(zhǎng)期；推測(cè)在發(fā)酵12 d后，系統(tǒng)中易產(chǎn)沼氣的物質(zhì)基本利用完畢，后期主要靠分解難降解物質(zhì)來(lái)產(chǎn)沼氣。29 d產(chǎn)氣基本停止。

圖2 秸稈和藍(lán)藻混合發(fā)酵產(chǎn)氣量及甲烷含量Fig.2 Bio-gas production and methane percentage composition in the fermentation mixed straw with algae

2.2 總DNA提取和PCR擴(kuò)增

圖3為藍(lán)藻秸稈厭氧產(chǎn)氣裝置中樣品總DNA提取電泳圖，所用Marker為全式金的Trans15k，圖中泳道1～3、4～6、7～9依次為樣品d1、d7、d29平行樣。由圖3可知，提取的基因組較完整，大小在20 kb左右，可進(jìn)行下一步的16S rRNA基因片段擴(kuò)增。圖4為樣品d7總基因組細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增電泳圖，所用Marker為全式金的Trans2K Plus，圖中泳道1、2為電泳試驗(yàn)平行樣。電泳結(jié)果表明PCR擴(kuò)增所產(chǎn)生的DNA片段大小約為1.6 kb,說(shuō)明得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物適合下一步的16S rRNA基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建。

圖3 樣品總基因組提取電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of total genome

圖4 樣品d7總基因組細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of d7 genome bacterial 16S rRNA genes amplification products

2.3 細(xì)菌種群群落分析

樣品d196個(gè)克隆子陽(yáng)性克隆85個(gè)，共有9個(gè)操作分類(lèi)單元(OTU)；樣品d796個(gè)克隆子陽(yáng)性克隆87個(gè)，共有15個(gè)操作分類(lèi)單元(OTU)；樣品d2996個(gè)克隆子陽(yáng)性克隆90個(gè)，共有10個(gè)操作分類(lèi)單元(OTU)。測(cè)得有效克隆子16S rRNA基因序列在GenBank數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 進(jìn) 行BLAST比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌16S rRNA基因文庫(kù)克隆子在數(shù)據(jù)庫(kù)中的相似性比對(duì)結(jié)果

由表1可知，隨機(jī)挑選的克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的序列同源性最高為100%，最低為85%。由比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，厭氧顆粒污泥中微生物種群豐富，共分6個(gè)類(lèi)群(見(jiàn)表2)，分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、螺旋體門(mén)(Spirochaetes)、綠菌門(mén)(Ignavibacteriae)。其中厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)與擬桿菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌群，分別占3個(gè)樣品細(xì)菌克隆子總數(shù)18.82%～47.13%、12.64%～51.76%、13.33%～35.63%。系統(tǒng)中微生物以變形菌和不可培養(yǎng)細(xì)菌為主。

表2 反應(yīng)器中所有細(xì)菌所屬門(mén)類(lèi)分布情況

通過(guò)分析不同發(fā)酵時(shí)間樣品細(xì)菌群中豐度最大的OTU，可以了解不同發(fā)酵時(shí)間的重要細(xì)菌。3個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間細(xì)菌群中豐度最大的OTU是不同的(見(jiàn)圖5)。d1細(xì)菌群中豐度最大的OTU為Pseudomonassp.，屬于變形菌門(mén)，占樣品d1總克隆子數(shù)的30.6%。Pseudomonassp.分離自土壤，為短桿狀，革蘭陰性，好氧菌，生長(zhǎng)溫度為4～65 ℃，可利用葡萄糖，不能水解淀粉[15]。d7細(xì)菌群中豐度最大的OTU為Bacteroidespaurosaccharolyticus，屬于擬桿菌門(mén)，占樣品d7總克隆子數(shù)的27.6%。Bacteroidespaurosaccharolyticus分離自稻草殘?jiān)?，革蘭陰性，嚴(yán)格厭氧菌，生長(zhǎng)溫度為10～40 ℃，最優(yōu)35 ℃，可優(yōu)先利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖等，麥芽糖、糊精、糖原、淀粉和果膠也可利用，代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸和琥珀酸[16]。d29細(xì)菌群中豐度最大的OTU為Dechloromonassp. PC1和D.formicoaceticum,D.formicoaceticum屬于厚壁菌門(mén)，占樣品d29總克隆子數(shù)的23.3%，是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，可利用甲酸、乙酸和少量的甲醇[17]；Dechloromonassp. PC1屬于變形菌門(mén)，占樣品d29總克隆子數(shù)的24.4%，為革蘭陰性短桿菌，微好氧，最適條件為25 ℃，pH 7。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間樣品細(xì)菌組成Fig.5 Bacterial compositions in samples collected at different fermentation time

變形菌門(mén)是產(chǎn)氣初始階段的優(yōu)勢(shì)菌群。該門(mén)菌的純培養(yǎng)主要分離自土壤、糞便、厭氧活性污泥等，可利用淀粉、長(zhǎng)鏈脂肪酸及氨基酸等，具有水解作用，部分細(xì)菌有脫氮作用[18]。結(jié)合發(fā)酵裝置中的物料及接種物，推測(cè)該菌很可能來(lái)自厭氧污泥或藍(lán)藻；擬桿菌門(mén)是產(chǎn)氣高峰階段的優(yōu)勢(shì)菌群。該門(mén)菌主要分離自海底、腸道、厭氧反應(yīng)器等厭氧環(huán)境，有降解大分子碳水化合物產(chǎn)酸的功能[19]；厚壁菌門(mén)是產(chǎn)氣終止階段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群，該門(mén)細(xì)菌已在厭氧消化污泥、廢水處理反應(yīng)器[20]、玉米秸稈厭氧反應(yīng)器[21]等環(huán)境中被大量發(fā)現(xiàn)，主要進(jìn)行纖維素降解、有機(jī)物水解、長(zhǎng)鏈脂肪酸降解，生成小分子物質(zhì)。

2.4 古菌種群群落分析

樣品d196個(gè)克隆子陽(yáng)性克隆85個(gè)，共有8個(gè)操作分類(lèi)單元(OTU);樣品d796個(gè)克隆子陽(yáng)性克隆有84個(gè)，共有6個(gè)操作分類(lèi)單元(OTU);樣品d2996個(gè)克隆子陽(yáng)性克隆80個(gè)，共有4個(gè)操作分類(lèi)單元(OTU)。測(cè)得有效克隆子16S rRNA基因序列在GenBank數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 進(jìn) 行BLAST比對(duì)，其微生物所屬古菌類(lèi)別較為豐富(見(jiàn)表3)。在科和屬分類(lèi)水平上(見(jiàn)表4)，11個(gè)古菌OTUs中可分為Methanoregula、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、甲烷微菌屬(Methanosphaerula)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)、甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)、甲烷繩菌屬(Methanolinea)、馬氏甲烷球菌科(Methanomassiliicoccus)與甲烷螺菌屬(Methanospirillum)、甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)。其中，Methanoregula和甲烷八疊球菌屬為文庫(kù)中的優(yōu)勢(shì)克隆，分別占克隆總數(shù)的15.1%和13.2%。

表3 古菌16S rRNA基因文庫(kù)克隆子在數(shù)據(jù)庫(kù)中的相似性比對(duì)結(jié)果

表4 古菌的16S rRNA基因文庫(kù)中克隆子的分布情況

通過(guò)分析不同發(fā)酵時(shí)間樣品古菌群中豐度最大的OTU，可以了解不同發(fā)酵時(shí)間的重要古菌。各樣品在綱(Class)水平上的組成情況是不同的(見(jiàn)圖6)。甲烷微菌在d1系統(tǒng)中占48.2%，到d7迅速升高至95.2%，d29后又有所下降，但仍占76.3%。甲烷微菌呈短、彎桿，不產(chǎn)芽胞，革蘭陰性，極端嚴(yán)格厭氧。最適生長(zhǎng)溫度40 ℃，最適pH 6.1～6.9。以H2或甲酸鹽為電子供體還原CO2為CH4，不利用乙酸、甲基胺和甲醇、H2，可在瘤胃液中分離到。甲烷微菌綱含量變化規(guī)律與沼氣中的甲烷含量變化規(guī)律相似，都是從d1后迅速上升并維持在高位，說(shuō)明甲烷微菌綱古菌在該混合發(fā)酵系統(tǒng)中起主要作用。甲烷桿菌豐度則從d1的30.6%迅速下降到d7的0，隨后d29也未檢測(cè)出。甲烷桿菌極端嚴(yán)格厭氧，最適生長(zhǎng)溫度是37 ℃，可還原CO2為CH4，不能代謝甲基胺和乙酸，不能固氮，可在水田、沉積物或其他缺氧的環(huán)境分離到，推測(cè)裝置中甲烷桿菌來(lái)自厭氧污泥。熱原體綱在d1和d7未檢測(cè)出，而在d29豐度較高，占23.8%。

在屬(Genus)分類(lèi)水平上，d1古菌群中豐度最大的2個(gè)OTU依次屬于甲烷微菌屬(22.3%)、甲烷桿菌(18.8%)；d7古菌群中豐度最大的2個(gè)OTU為Methanoregula(42.9%)、甲烷八疊球菌屬(27.4%)；d29古菌群中豐度最大的2個(gè)OTU為甲烷粒菌屬(37.5%)、馬氏甲烷球菌科(23.8%)。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)間樣品古菌組成Fig.6 Archaeal compositions in samples collected at different fermentation time

3 討 論

本研究首先采用實(shí)驗(yàn)室自制秸稈藍(lán)藻混合厭氧反應(yīng)裝置進(jìn)行沼氣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，再分別采集產(chǎn)氣初始期(d1)、產(chǎn)氣高峰期(d7)和產(chǎn)氣終止期(d29)的厭氧發(fā)酵液，利用16S rRNA基因克隆文庫(kù)的方法，對(duì)不同產(chǎn)氣階段的細(xì)菌和古菌進(jìn)行多樣性研究。盡管利用該技術(shù)不能反映樣品中所有的微生物類(lèi)群，但可以反映樣品中主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、古菌類(lèi)群。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)到6個(gè)門(mén)類(lèi)的細(xì)菌，即厚壁菌門(mén)(31.7%)、擬桿菌門(mén)(27.5%)、變形菌門(mén)(29.4%)、綠彎菌門(mén)(1.5%)、螺旋體門(mén)(4.2%)、綠菌門(mén)(5.7%)。這與其他秸稈產(chǎn)氣裝置典型類(lèi)群一致。例如，張蕾等[19]應(yīng)用16S rRNA基因克隆文庫(kù)技術(shù)對(duì)四種規(guī)?；斩挳a(chǎn)氣裝置中微生物的群落分析中發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)與擬桿菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)種群。Yan等[22]發(fā)現(xiàn)稻草沼氣系統(tǒng)細(xì)菌主要?dú)w屬于擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、脫鐵桿菌門(mén)(8.9%)和厚壁菌門(mén)。Klocke等[23]發(fā)現(xiàn)青貯甜菜沼氣系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要?dú)w屬于厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。喬江濤等[9]對(duì)玉米秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)及熱袍菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群。d1細(xì)菌群中豐度最大的OTU屬于變形菌門(mén)(30.6%)，d7細(xì)菌群中豐度最大的OTU屬于擬桿菌門(mén)(27.6%)，d29細(xì)菌群中豐度最大的OTU屬于變形菌門(mén)(24.4%)，這與袁月祥等[21]對(duì)玉米秸稈產(chǎn)生物燃?xì)饧捌湮⑸锶郝浣馕鼋Y(jié)果相比發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣初始和高峰優(yōu)勢(shì)菌群一致，而產(chǎn)氣終止的優(yōu)勢(shì)菌群不同，推測(cè)是由于物料中添加藍(lán)藻，發(fā)酵裝置含氮量升高導(dǎo)致變形菌門(mén)豐度隨之升高。這些沼氣系統(tǒng)中豐度最大的幾個(gè)門(mén)基本上都是擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，但含量有些變化，且不同細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中的豐度變化趨勢(shì)不同。以上結(jié)果表明，擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)在富含纖維素的有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，需要結(jié)合反應(yīng)器的運(yùn)行參數(shù)與運(yùn)行狀況，進(jìn)一步研究這些優(yōu)勢(shì)微生物在沼氣發(fā)酵過(guò)程中群落演替與代謝功能。

通過(guò)構(gòu)建古菌克隆文庫(kù)，得知各樣品所測(cè)得的OTU都?xì)w為廣古菌門(mén)。分別屬于甲烷微菌綱、甲烷桿菌綱和熱原體綱。其豐度變化與袁月祥等[21]對(duì)玉米秸稈產(chǎn)生物燃?xì)饧捌湮⑸锶郝浣馕鲋械墓啪侩S發(fā)酵時(shí)間變化情況基本吻合。張蕾等[19]在規(guī)?；斩捳託獍l(fā)酵反應(yīng)器中微生物群落特征時(shí)，古菌序列均屬于甲烷桿菌綱和甲烷微菌綱。楊承劍等[24]應(yīng)用16S rRNA基因克隆文庫(kù)技術(shù)分析廣西富鐘水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌組成及多樣性中發(fā)現(xiàn)，所有古菌群落均屬于甲烷桿菌目、熱原體目、除硫球菌目。以上實(shí)驗(yàn)均是只研究了一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)研究了混合發(fā)酵系統(tǒng)中古菌的變化情況。通過(guò)比較推測(cè)，藍(lán)藻的添加對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣裝置中古菌群落影響不大，不同發(fā)酵時(shí)間古菌變化趨勢(shì)與以秸稈為單一物料產(chǎn)沼氣的趨勢(shì)基本相同。不同發(fā)酵原料對(duì)沼氣系統(tǒng)古菌的多樣性的影響有待進(jìn)一步研究。

[1] 鮑恩財(cái),田爭(zhēng)光,劉偉偉,等.主要農(nóng)作物秸稈資源調(diào)查及能源化利用評(píng)價(jià)——以安徽省為例[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2014,30(29):222-228.

[2] 孫曉艷.秸稈焚燒的危害及綜合利用研究[J].綠色科技,2015, (3):222-224.

[3] 李媛,張家衛(wèi),魏杰,等.我國(guó)藍(lán)藻水華的發(fā)生機(jī)理、危害及防控利用研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志,2015, 35(8):93-97.

[4] 徐雙鎖,劉愛(ài)民,蔡欣,等.稻秸與藍(lán)藻混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣試驗(yàn)研究[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào),2011,34(3):260-264.

[5] Westerholm M, Hansson M,Schnürer A. Improved bio-gas production from whole still-age by co-digestion with cattle manure[J]. Bioresour Technol, 2012, 114:314-319.

[6] 劉戰(zhàn)廣,朱洪光,王彪,等.糞草比對(duì)干式厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣效果的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009, 12(4):196-200.

[7] 彭書(shū)傳,侯成虎,王進(jìn),等.玉米秸稈與巢湖藍(lán)藻混合厭氧發(fā)酵的產(chǎn)沼氣性能[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2012,(15):173-178.

[8] Carina S, Waleed A, Madeleine L, et al. 454 pyrosequencing analyses of bacterial and archaeal richness in 21 full-scale biogas digesters[J]. FEMS Microbial Ecol, 2013, 85(12):612-626.

[9] 喬江濤,郭榮波,袁憲正,等.玉米秸稈厭氧降解復(fù)合菌系的微生物群落結(jié)構(gòu)[J].環(huán)境科學(xué),2013, 34(4):1531-1539.

[10]郎會(huì)花,楊洪江,張永剛.雞糞沼氣池產(chǎn)甲烷菌多樣性[J].微生物學(xué)通報(bào),2010, 37(4):508-512.

[11]Kaeberlein T, Lewis K, Epstein S S. Isolating"uncultivable"microorganisms in pure culture in a simulated natural environment[J].Science, 2002, 296(5570):1127-1129.

[12]Traversi D, Villa S, Lorenzi E, et al. Application of a real-time qPCR method to measure the methanogen concentration during anaerobic digestion as an indicator of biogas production capacity[J]. J Environ Manage, 2012, 111(7):173-177.

[13]葉凝芳,何品晶,呂凡,等.厭氧發(fā)酵過(guò)程pH對(duì)微生物多樣性和產(chǎn)物分布的影響(英文)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2007, 13(2):238-242.

[14]Wu L, Ge G, Zhu G F, et al. Diversity and composition of the bacterial community of Poyang Lake(China) as determined by 16S rRNA gene sequence analysis[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(1):233-244.

[15]丁延芹,黃偉紅,姚良同,等.PseudomonaspseudoalcaligenesB50鐵載體合成相關(guān)基因pyrD的克隆與功能分析[J].微生物學(xué)通報(bào),2010, 37(7):981-985.

[16]Ueki A, Abe K, Ohtaki Y, et al.Bacteroidespaurosaccharolyticussp. nov., isolated from a methanogenic reactor treating waste from cattle farms[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2011, 61(Pt 2):448-53.

[17]Frank C, Schwarz U, Matthies C, et al. Metabolism of aromatic aldehydes as cosubstrates by the acetogen Clostridium formicoaceticum[J]. Arch Microbiol, 1998, 170(6):427-34.

[18]Lai Q,Shao Z.Pseudomonasxiamenensissp.nov.,a denitrifying bacterium isolated from activated sludge[J].Int J Syat Evol Microbiol, 2008, 58(8):1911-1915.

[19]張蕾,梁軍鋒,崔文文,等.規(guī)模化秸稈沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中微生物群落特征[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2014, 33(3):584-592.

[20]朱文秀,黃振興,任洪艷,等.IC反應(yīng)器處理啤酒廢水的效能及其微生物群落動(dòng)態(tài)分析[J].環(huán)境科學(xué),2012, 33(8):2715-2722.

[21]袁月祥,文昊深,黃顯波,等.玉米秸稈產(chǎn)生物燃?xì)饧捌湮⑸锶郝浣馕鯷J].化工學(xué)報(bào),2014, 65(5):1784-1791.

[22]Yan L, Gao Y F, Wang Y J, et al. Diversity of a mesophilic lignocellulolytic microbial consortium which is useful for enhancement of biogas production[J]. Bioresour. Technol, 2012, 111:49-54.

[24]楊承劍,梁辛,韋升菊,等.基于16S rRNA基因克隆文庫(kù)技術(shù)分析廣西富鐘水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌組成及多樣性[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2014, 16(12):3635-3642.

Analysis of Microbial Community in Methane Co-Fermentation of Straw & Blue Algae

MU Wei-na, LI Yu-cheng, WU Chao, ZHANG Xue-sheng, WANG Ning, GAO Zhao-hui

(Schl.ofRes. &Environ’lEngin.AnhuiUniversity,Hefei230601)

The diversity study on different stages of gas production by dominant communities of bacteria and archabacteria was carried out adopting self-made anaerobic reaction device filled with mixed straw and blue algae for methane fermentation experiment, using methods of 16S rRNA gene cloning library. The results indicated that the dominant bacterial communities are different in different methane producing stages. At the stage of the tested straw methane reactor the categories of bacteria were more abundant, respectively belonging to six phyla: At the beginning of methane producing stage, the dominant bacterial community was Proteobacteria, with relative abundance at 51.76%, and at the peak stage of gas production the dominant bacterial community was Firmicutes, with relative abundance at 47.13%, while at the completion stage of gas production, the dominant bacterial community was Firmicutes with relative abundance at 28.89%. The category of archabacterial communities were apparently less than bacterial communities, all belonging to Methanomicrobia, Methanobacteria and Thermoplasmata. The interpretation of the structure of microbial communities of straw-blue algae methane system possessed certain significance, it provide a scientific foundation for the regulation of straw bio-gas project.

straw; mixed fermentation; microbial community; cloning library

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41172121)

穆維娜 女，碩士研究生。主要從事環(huán)境微生物方面的研究。Tel:0551-63861783，E-mail：mu_weina@sina.com

* 通訊作者。男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)榈刭|(zhì)與古生物。Tel:0551-63861783，E-mail：li-yucheng@163.com

2016-02-17；

2016-05-05

Q938；X712

A

1005-7021(2017)01-0070-08

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.01.011