海洋短小枯草芽胞桿菌的鑒定及抑菌活性分析

陳 香， 唐彤彤， 孫 星， 劉 勤*

(1.中國科學(xué)院 南京土壤研究所，江蘇 南京 210008；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

海洋短小枯草芽胞桿菌的鑒定及抑菌活性分析

陳 香1,2， 唐彤彤1,2， 孫 星1， 劉 勤1*

(1.中國科學(xué)院 南京土壤研究所，江蘇 南京 210008；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

對從連云港東西連島海泥樣品中分離得到的菌株BacilluspumilusHX2-2的分類地位、生長條件和抑菌活性進行了研究。經(jīng)過形態(tài)特征、生理生化性質(zhì)及16S rDNA序列分析鑒定，該菌屬于短小芽胞桿菌。不同溫度、鹽度、pH培養(yǎng)條件下測定菌液吸光度OD600值，表明該菌是一株輕度嗜鹽菌，最適溫度、鹽度、pH分別為30 ℃、3%、7.0～8.0。在不同病原真菌的平板抑菌活性試驗中，該菌對草莓尖胞鐮刀菌、馬鈴薯炭疽病菌和水稻立枯絲核菌表現(xiàn)出顯著的抑菌作用。菌株B.pumilusHX2-2是一株短小芽胞桿菌，具有廣譜抑菌活性，具有進一步研究的價值。

短小芽胞桿菌B.pumilusHX2-2；菌種鑒定；16S rDNA;抑菌活性

海洋微生物長期生活在高壓、高鹽、貧營養(yǎng)、低溫等特殊的海洋環(huán)境中，因此具有獨特的代謝途徑，能夠產(chǎn)生完全不同于陸地微生物的結(jié)構(gòu)新穎、功能獨特的生物活性物質(zhì)[1-2]。海洋微生物能夠分泌抗生素、胞外酶、胞外毒素等多種活性物質(zhì)，這些物質(zhì)具有抗菌、溶菌、抑藻和抗腫瘤等作用，因此分離鑒定具有生物活性物質(zhì)的海洋微生物已成為國內(nèi)外研究的熱點[3-4]。海洋微生物是海洋活性物質(zhì)的重要來源，芽胞桿菌是目前發(fā)現(xiàn)的具有開發(fā)應(yīng)用前景的菌種之一，關(guān)于芽胞桿菌的研究報道表明，其產(chǎn)生的胞外活性物質(zhì)對病原菌具有明顯的拮抗作用，是研發(fā)利用生防菌劑防治植物病害的熱點研究方向[5]。微生物生態(tài)平衡的破壞，病原菌的感染成為影響設(shè)施農(nóng)業(yè)土傳病害的主要原因之一?；瘜W(xué)農(nóng)藥的施用不僅不能有效根治由致病菌引起的土傳病害，而且造成化學(xué)農(nóng)藥的殘留污染環(huán)境，甚至使病原菌產(chǎn)生抗藥性，殺死有益微生物[6-7]。近年來，利用對病原菌具有拮抗活性的生防菌或其代謝產(chǎn)物進行生物防治成為一種綠色、有效的新手段[8]。研究表明，從海洋微生物中篩選根際促生菌的能力遠高于陸地微生物，并且短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)產(chǎn)生的胞子抗逆性強，繁殖速度快[9-10]；具有較寬的抑菌譜，對多種病原菌有抑制作用，常被用來制成菌劑防治植物病害[11-13]。Swarding等[14]發(fā)現(xiàn)了短小芽胞桿菌B.pumilusNClMB13374對草莓多種病原菌有抑制作用，是一種具有生物防治潛力的菌株 ；Akhtar等[15]報道了短小芽胞桿菌的生物制劑對鷹嘴豆根腐病有很好的防治效果；Xinqi等[5]通過綠色熒光蛋白標(biāo)記等方法發(fā)現(xiàn)接種短小芽胞桿菌B.pumilusSOR-N43的發(fā)酵有機肥在黃瓜根部定殖能力較強，能夠誘導(dǎo)立枯絲核菌RhizoctoniasolaniQ1 菌絲變形、細胞膨脹、細胞質(zhì)泄露，是一種有效的拮抗菌劑。因此，可以看出短小芽胞桿菌對植物致病菌防治利用方面有很好的應(yīng)用前景。從連云港東西連島海域的海泥中篩選出一株具有抑菌活性的海洋細菌，通過對該菌的形態(tài)特征、生理生化特征、培養(yǎng)特征以及16S rDNA序列測定，表明該菌屬于短小芽胞桿菌，初步研究了該菌對不同致病菌的平板抑菌效果，為進一步研究該菌及其對植物病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 生防菌為短小芽胞桿菌B.pumilusHX2-2,從連云港東西連島海域海泥中篩選得到,由本實驗室保存。植物致病菌有黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumfsp.cucumerinumOwen)、草莓尖胞鐮刀菌(Pestalotiopsisphotiniae)、馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、水稻立枯絲核菌(Fusariumgraminearum)、小麥禾谷鐮刀菌(Rhizoctoniasolani)、板栗圍小叢殼菌(Glomerellacingulate),由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹生物技術(shù)實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基[16]2216E培養(yǎng)基用于海洋細菌的分離；PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)真菌；用陳海水配置的NA培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，牛肉膏3 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，陳海水1 000 mL，pH 7.0～8.0，用于測定抑菌活性。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離和純化 采取連云港東西連島海域海泥樣品。將海泥用無菌生理鹽水按1∶10(體積比)的比例稀釋制成懸液，稀釋10倍后備用。取100 μL稀釋懸液，用涂布法在2216E培養(yǎng)基上分離，觀察平板上不同菌落的形態(tài)特征和生長情況，挑取生長良好的乳黃色菌落在2216E培養(yǎng)基上劃線純化，30 ℃培養(yǎng)48～72 h。最后劃線得到的單一菌落用試管保存法和甘油管保存法分別置于4 ℃和-20 ℃的冰箱保存。

1.2.2 菌株鑒定 ① 菌株形態(tài)觀察: 將分離純化的菌株在2216E培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落的顏色、大小、形狀等特征，同時進行革蘭染色觀察。利用穿刺培養(yǎng)法，將菌株接種于半固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌株的生長情況，確定菌株是否具有運動性。② 菌株理化鑒定: 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第9版)[18]所提供的方法對菌株B.pumilusHX2-2進行生理生化特性分析。③菌株16S rDNA序列測定和構(gòu)建發(fā)育樹: 菌株B.pumilusHX2-2基因組DNA提取采用OMEGA提供的Bacterial DNA kit(50) 試劑盒。PCR擴增引物：27 F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492 R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)用于擴增16S rDNA基因。 PCR反應(yīng)體系(100 μL):10×PCR緩沖液1 μL,dNTP(20 mmol/L)5 μL，MgCl2(25 mmol/L)8 μL,引物(20 μmol/L)各2 μL,DNA模板1 μL,Taq酶(175 U/μL)1 μL,雙蒸水80 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,循環(huán)30次，72 ℃后延伸5 min。擴增后吸取2 μL PCR反應(yīng)液，于1%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳分析結(jié)果，將PCR產(chǎn)物送華大基因公司測序。將測序得到的16S rDNA序列提交到GenBank進行BLASTN相似性對比，選擇將相似性較高的序列采用Clustal X 2.1進行多序列比對，并用MEGA5.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建發(fā)育樹。

1.2.3 菌株生長條件優(yōu)化 ① 制備菌株種子液: 將試管保存的短小芽胞桿菌B.pumilusHX2-2轉(zhuǎn)接到2216E培養(yǎng)基，30 ℃活化48 h。挑取活化好的菌株B.pumilusHX2-2的單菌落，接入裝有2216E液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)24 h，菌液菌量為108cfu/mL。②不同溫度、鹽度、pH對菌株生長的影響:將制備好的菌株B.pumilusHX2-2的種子液，按1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入裝有50 mL 2216E培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，分別放置在不同溫度(10、20、25、30、35、40、45 ℃)中，180 r/min培養(yǎng)24 h，測定不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)液的OD600值，各處理重復(fù)3次，以不接菌的2216E液體培養(yǎng)基作為空白對照。按1%(體積分?jǐn)?shù))接種量將菌株B.pumilusHX2-2的種子液，分別轉(zhuǎn)接到不同鹽度(1%、3%、5%、7%、10%、13%、15%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))的2216E培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，測定不同NaCl濃度下培養(yǎng)液OD600值，各處理重復(fù)3次，以不接菌的2216E液體培養(yǎng)基作為空白對照。將菌株B.pumilusHX2-2的種子液以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量，轉(zhuǎn)接到含最適NaCl濃度，pH值不同(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的2216E液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，測定不同pH下培養(yǎng)液的OD600值，各處理重復(fù)3次，以不接菌的2216E液體培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.4 菌株抑菌活性測定 用平板對峙法[19]測定海洋短小芽胞桿菌B.pumilusHX2-2的抑菌活性，挑取短小芽胞桿菌B.pumilusHX2-2單菌落，接到2216E液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，菌量為108cfu/mL。用陳海水配置NA瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基溫度降至45 ℃時，吸取制備好的菌株發(fā)酵液按1∶20(體積比)的比例轉(zhuǎn)接到NS瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后倒平板。然后用直徑5 mm的打孔器，打取圓形的病原菌菌苔接種到涂有拮抗菌的PDA平板上，同時以不涂拮抗菌的病原菌平板為對照，各個處理做3次重復(fù)。放置于30 ℃恒溫箱培養(yǎng)，直到對照組的病原菌長滿平板時，用十字交叉法分別測量對照組平板和供試組平板的真菌菌落直徑，計算抑菌率。供試菌抑菌率=(對照平板真菌直徑-供試平板真菌直徑)/(對照平板真菌直徑)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株B.pumilusHX2-2的形態(tài)觀察

從連云港東西連島海域采集的海泥樣品，采用平板稀釋和涂布的方法分離出一株具有代表性的乳黃色的單菌落。菌株B.pumilusHX2-2在2216E培養(yǎng)基上為圓形、低凸、邊緣整齊，菌落直徑1～3 mm，表面光滑濕潤；顯微鏡下呈桿狀(圖1)，菌體長1.4～4.0 μm，寬0.4～0.5 μm，有鞭毛，能運動。

圖1 菌株B. pumilus HX2-2在油鏡下的形態(tài)

2.2 菌株生理生化特征

菌株B.pumilusHX2-2的生理生化特性結(jié)果如表1所示。菌株B.pumilusHX2-2為革蘭陽性菌，能分解利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇，可以水解淀粉、纖維素，菌株的甲基紅(M.R.)、乙酰甲基甲醇(V.P.)、檸檬酸鹽反應(yīng)呈陽性；菌株可以分解利用牛肉膏、酵母粉、蛋白胨作為唯一氮源，能分解明膠，產(chǎn)硫化氫，石蕊牛乳和硝酸鹽還原反應(yīng)呈陽性，吲哚反應(yīng)為陰性；能夠產(chǎn)生氧化酶、過氧化氫酶、苯丙氨酸脫氫酶。菌株B.pumilusHX2-2的理化指標(biāo)反應(yīng)特性與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]中描述的短小芽胞桿菌理化特性基本一致，因此被初步鑒定為短小芽胞桿菌。

表1 菌株B. pumilus HX2-2的生理生化特性分析

續(xù)表1

注:“+” 陽性；“-”陰性

2.3 菌株16S rDNA序列分析和構(gòu)建發(fā)育樹

菌株序列總長度1 422 bp(如圖2)，將菌株序列提交至GenBank獲得登陸號KU948153。通過BLASTN比對分析，菌株B.pumilusHX2-2的16S rDNA序列和GenBank中公布的短小芽胞桿菌序列的相似性高于99%。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明(圖3)短小芽胞桿菌B.pumilusHX2-2和Bacill-uspumilusL17、BacilluspumilusHB29和BacilluspumilusHNS70聚在一起，親緣關(guān)系較近，并且Bootstrap檢驗值為100。綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析結(jié)果，可以確定菌株B.pumilusHX2-2屬于短小芽胞桿菌。

圖2 菌株B. pumilus HX2-2的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoretic result of PCR product of strain B. pumilus HX2-21：菌株B. pumilus HX2-2的基因組DNA;M:Marker1:genomic DNA of strain B.pumlius HX2-2;M:Marker

圖3 菌株B. pumilus HX2-2的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株生長條件測定

溫度是影響菌株生長的重要因素，能夠影響菌株的酶活性。如圖4所示，菌株B.pumilusHX2-2能在20～45 ℃生長，最適生長溫度30 ℃。當(dāng)溫度為10～30 ℃時，隨著溫度的上升，OD600值不斷增加，菌株活菌數(shù)不斷增加；高于30 ℃時，OD600值開始下降，活菌數(shù)開始減少；溫度超過35 ℃，OD600值急劇下降。

圖4 不同溫度對菌株B.pumilus HX2-2生長情況的影響Fig.4 Effects of different temperature on the biomass of strain B.pumilus HX2-2

圖5為菌株B.pumilusHX2-2在不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的生長曲線。由圖5可以看出，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～3%時菌株生長最好，生物量最大；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于5%時，菌株OD600值急劇下降，生物量迅速減少；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～13%時，OD600值接近0，菌株幾乎不生長。因此，菌株B.pumilusHX2-2是輕度嗜鹽菌。

圖5 不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株B.pumilus HX2-2生長情況的影響Fig.5 Effects of different NaCl concentration on the biomass of strain B.pumilus HX2-2

由圖6可以看出，pH為4.0～5.0，菌株幾乎不生長，活菌量接近0；pH大于5.0，OD600值急劇上升，活菌數(shù)迅速增加；pH為6.0～8.0，菌株生長的最好；pH大于9.0，OD600值急劇下降，當(dāng)pH為10.0，菌株還是能夠生長的，說明菌株B.pumilusHX2-2耐堿不耐酸，對pH的適應(yīng)范圍較寬。

圖6 不同pH對菌株B.pumilus HX2-2生長情況的影響Fig.6 Effects of different pH on the biomass of strain B.pumilus HX2-2

2.5 抑菌活性分析

菌株B.pumilusHX2-2對黃瓜枯萎病菌、草莓尖胞鐮刀菌、馬鈴薯炭疽病菌、水稻立枯絲核菌、小麥禾谷鐮刀菌、板栗圍小叢殼菌這些植物病原指示菌的抑菌效果見表2。圖7為植物病原菌在有拮抗菌液的平板和沒有拮抗菌液的平板上的生長情況，可以看出菌株對不同植物病原菌表現(xiàn)出不同的抑菌活性，對草莓尖胞鐮刀菌、馬鈴薯炭疽病菌、水稻立枯絲核菌有較為顯著的抑活性，抑菌率超過70%；對黃瓜枯萎病菌和小麥禾谷鐮刀菌的抑菌效果不太明顯，抑菌率只有30%左右。

表2 菌株B.pumilus HX2-2對不同植物致病菌的抑菌活性

注:表中數(shù)據(jù)是通過SPSS16.0分析得到的，字母a、b、c、d表示在0.05水平上差異顯著

圖7 菌株B.pumilus HX2-2對6種植物致病菌的抑菌效果Fig.7 Antimicrobial effects of strain B.pumilus HX2-2 against six plant pathogensA:黃瓜枯萎病原菌；B:草莓尖胞鐮刀菌；C:馬鈴薯炭疽病菌；D:小麥禾谷鐮刀菌；E:水稻立枯絲核菌；F:板栗圍小叢殼菌;其中A、B、C、D、E、F為對照組；A′、B′、C′、D′、E′、F′為實驗組A：Fusarium oxysporumf sp.cucumerinum;B:Pestalotiopsispho tiniae;C:Colletotrichum coccodes;D:Fusarium graminearum;E:Rhizoctonia solani;F:Glomerella cingulate;A,B,C,D,E,F are control groups; A′、B′、C′、D′、E′、F′are experimental groups

3 討 論

目前所報道的芽胞桿菌主要是從土壤中篩選得到的，很少來自于海洋[20]。由于海洋的特殊環(huán)境，海洋微生物較陸地微生物有著特殊的代謝途徑，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、種類豐富的抗菌活性物質(zhì)，因此，從海洋中篩選具有抗菌活性的菌株已經(jīng)成為微生物學(xué)研究的一個重要方向[21]。短小芽胞桿菌能夠產(chǎn)生豐富的抗菌活性物質(zhì)，在植物病害的防治和醫(yī)學(xué)上具有潛在的應(yīng)用價值。顏愛勤等[22]發(fā)現(xiàn)短小芽胞桿菌JK-SX001能夠產(chǎn)生非蛋白類物質(zhì)鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)對楊樹潰瘍病的3種病原真菌具有較強的拮抗作用；程丹丹等[23]從水稻植株樣內(nèi)分離出一株短小芽胞桿菌223所產(chǎn)生的蛋白類拮抗物質(zhì)能有效抑制水稻紋枯病菌的生長。于婷等[24]提取的短小芽胞桿菌BSH-4的抗菌物質(zhì)對蛋白酶較穩(wěn)定，具有良好的熱穩(wěn)定性，并且對黃瓜蔓枯病菌、黃瓜立枯病菌和番茄早疫病菌有很好的抑菌活性。

本研究從連云港東西連島篩選得到短小芽胞桿菌B.pumilusHX2-2，通過對其形態(tài)特征、生理生化性質(zhì)鑒定表明菌株B.pumilusHX2-2和菌株鑒定手冊中短小芽胞桿菌的描述較為接近。16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建揭示了菌株B.pumilusHX2-2和短小芽胞桿菌親緣關(guān)系較近，因此，綜合菌株的形態(tài)、生理生化和16S rDNA序列分析的結(jié)果，認為分離到的菌株B.pumilusHX2-2是一株短小芽胞桿菌。

分離得到的短小芽胞桿菌B.pumilusHX2-2的抑菌譜較廣，對多種植物病原菌有抑菌活性。對主要的植物致病菌如草莓尖胞鐮刀菌、馬鈴薯炭疽病菌和水稻立枯絲核菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性，因此，菌株B.pumilusHX2-2在植物病原菌的生物防治方面具有潛在的開發(fā)利用價值。但是，當(dāng)前的抑菌活性實驗僅僅是在瓊脂平板上的菌株B.pumilusHX2-2的體外抑制試驗，菌株B.pumilusHX2-2抑菌物質(zhì)的組成成分、理化性質(zhì)及對病原菌的抑菌機理還需要進一步做更深入的研究。

[1] 林白雪，黃志強，謝聯(lián)輝.海洋細菌活性物質(zhì)的研究進展[J].微生物學(xué)報，2005，45(4)：657-660.

[2] Habbu P,Warad V,Shastri R,et al.Antimicrobial metabolites from marine microorganisms[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2016,14(2):101-116.

[3] 高偉，田黎，周俊英，等.海洋芽胞桿菌(Bacillusmarinus)B-9987菌株抑制病原真菌機理[J].微生物學(xué)報，2009,49(11):1494-1501.

[4] 王書錦，胡江春，薛德林，等.中國黃、渤海、遼寧近海地區(qū)海洋微生物資源的研究[J].錦州師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2001,22(1):2-5.

[5] Xinqi Huang,Nan Zhang,Xiaoyu Yong,et al.Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off disease in cucumber withBacilluspumilusSQR-N43[J].Microbiogical Research,2012,167(3):135-143.

[6] Yi Sun,Li Tian,Yongfu Huang,et al.A new cyclotetrapeptide from marine fungus Trichodermareesei[J].Pharmazie,2006,61(9):809-810.

[7] 楊秀榮，劉水芳，孫淑琴，等.生防細菌防治土傳病害的研究進展[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,14(4):38-42.

[8] Berrue F,Ibrahim A,Boland P,et al.Newly isolated marineBacilluspumilus(SP21)A source of novel lipoamides and other antimicrobial agents[J].International Union of Pure and Applied Chemistry,2009,81(6):1027-1031.

[9] 李學(xué)恭，雷曉凌.海洋短小芽胞桿菌ZH1-6菌株的鑒定及生物學(xué)特性[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報,2009,29(3):82-85.

[10]孔高飛，金敏，朱蓮蓮，等.一種短小芽胞桿菌分離鑒定及培養(yǎng)條件研究[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,31(4):468-473.

[11]Kapoor M,Nair L,Kuhad R.Cost-effective xylanase production from free and immobilizedBacilluspumilusstrain MK001 and its application in saccharification of Prosopisjuliflora[J].Biochemical Engineering Journal,2008,38(1):88-97.

[12]Hongzhen Zhang,Fengli Zhang,Zhiyong Li.Geneanalysis,optimized production and property of marine lipasefromBacilluspumilusB106 associated with South China Sea sponge Halichondria rugosa[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25(7):1267-1274.

[13]Mari M,Guizzardi M,Pratella G C.Biological control of gray mold in pears by antagonistic bacteria[J].Biological Control,1996,7(1):30-37.

[14]Swarding I P，Jeffries P.Antagonistic properties of two bacterial biocontrol agents of greymould disease[J].Biocontrol Science & Technology,1998,8(3):439-448.

[15]Akhtar M S,Siddiqui Z A,Glomus intraradices.Pseudomonas alcaligenes,andBacilluspumilus:effective agents for the control of root-rot disease complex of chickpea(Cicerarietinum L.)[J].Journal of General Plant Pathology,2007,74(1):53-60.

[16]聶亞峰，劉永峰，李德全，等. 海洋源拮抗細菌對水稻紋枯病的防治[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，23(5)：420-427.

[17]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001：63-64，242-266，364-370.

[18]Holt J G,Krieg N R,Sneath P H A,et al.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology[M].Baltimore:William & Wilkins,1994:175-187.

[19]張立靜，李術(shù)娜，朱寶成，等.高效纖維素降解菌短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)T-7的篩選、鑒定及降解能力研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27(7)：112-118.

[20]Catre B K.Biomedical potential of marine natural products[J].Bioscience,1996,46(4):271-286.

[21]李越中，陳琦.海洋微生物資源及其產(chǎn)生生物活性代謝產(chǎn)物的研究[J].生物工程進展，2000，20(5)：28-31.

[22]顏愛勤，吳小芹，葉建人，等.短小芽胞桿菌JK-SX001非蛋白抗菌物質(zhì)研究[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2012，36(3)：13-16.

[23]程丹丹.水稻紋枯病生防潛力菌株短小芽胞桿菌223的初步研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2008.

[24]于婷，尚玉珂，李艷芳，等.短小芽胞桿菌BSH-4抗菌物質(zhì)的提取及其特性[J].植物保護學(xué)報，2009，36(1)：65-69.

Identification of a MarineBacilluspumilusand Antimicrobial Activity Analysis

CHEN Xiang1, 2, TANG Tong-tong1, 2, SUN Xing1, LIU Qin1

(1.Inst.ofSoilSci.,ChineseAcad.ofSci.,JiangsuUni.,Nanjing210008; 2.Uni.ofChineseAcad.ofSci.,Beijing100049)

B.pumilusHX2-2 isolated from marine sediment samples collected in Is. Dongxi in Lianyungang was studied for its classification position, growth conditions, and microbial inhibition activity. On the basis of its morphological, physiological and biochemical characteristics and its 16S rDNA sequence analysis, the bacterium belonged toBacilluspumilus. The absorbance value ofOD600under different temperatures, salinity, pH, and growth conditions was tested, indicating that the strain was a slightly halophilic Bacillus strain, and its optimal temperature, salinity, and pH were at 30 ℃, 3%, and 7.0-8.0 respectively. The inhibition activities experiments on plate with different pathogen fungi, the strain showed significant inhibition against strawberry oxyspore Fusarium (Fusariumoxysporum), potato anthracnose pathogen (Colletotrichumcoccodes), and seeding blight of rice (Rhizoctoniasolani).B.pumilusHX2-2 possessed inhibition activities of broad spectrum, and have the value for further study.

BacilluspumilusHX2-2 strain; strain characterization; 16S rDNA; inhibition activity

國家自然科學(xué)基金項目(31400464)

陳香 女，碩士研究生。研究方向為生物多樣性及其利用。E-mail:xchen@issas.ac.cn

2016-04-29；

2016-06-16

Q93-331

A

1005-7021(2017)01-0007-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.01.002

* 通訊作者。男，研究員，博士生導(dǎo)師。主要從事農(nóng)田土壤生態(tài)養(yǎng)分循環(huán)、污染物遷移及環(huán)境效應(yīng)、農(nóng)村景觀生態(tài)環(huán)境建設(shè)等

研究工作。E-mail:qliu@issas.ac.cn