構(gòu)建PDCD5基因真核表達(dá)載體及電轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞的研究

李鵬輝++費(fèi)洪新++王立紅++許惠玉++張海燕

[摘要] 目的 構(gòu)建PDCD5基因真核表達(dá)載體，并電轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 方法 設(shè)計(jì)合成PDCD5基因片段，將其插入經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的pcDNA3.1+表達(dá)載體，菌落PCR和基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，G418篩選數(shù)周后PCR鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR測(cè)序分析表明，PDCD5基因序列準(zhǔn)確插入預(yù)期位置，且序列正確。重組質(zhì)粒成功電轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，并整合入細(xì)胞基因組DNA。結(jié)論 成功構(gòu)建了PDCD5基因真核表達(dá)載體，并整合進(jìn)BGC823細(xì)胞基因組，為研究PDCD5基因的功能及胃癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] PDCD5基因；pcDNA3.1+表達(dá)載體；電轉(zhuǎn)染；BGC823細(xì)胞系

[中圖分類號(hào)] R394 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）06-0033-03

[Abstract] Objective To construct eukaryotic expression vector of PDCD5 gene and transfect BGC823 cells to obtain stable transfected cells. Methods The PDCD5 gene fragment was designed and inserted into pcDNA3.1+ expression vector which was digested with EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ. Colony PCR and sequencing were used for identification. The recombinant plasmid was electrically transfected into BGC823 cells， and PCR was used for identifying the stably transfected cells after G418 screening for weeks. Results It was suggested by colony PCR and sequencing analysis that the recombinant plasmid PDCD5 gene sequenc was accurately inserted into the desired position and the sequence was correct.Recombinant plasmids were successfully transfected into BGC823 cells and integrated into cell genomic DNA. Conclusion The eukaryotic expression vector of PDCD5 gene is successfully constructed and integrated into BGC823 cell genome， which provided experimental basis for studying the function of PDCD5 gene and gene therapy of gastric cancer.

[Key words] PDCD5 gene； pcDNA3.1+ expression vector； Electrical transfection； BGC823 cell line

程序性細(xì)胞死亡因子5（programmed cell death 5，PDCD5）原名為TFAR19，由北京大學(xué)人類疾病基因中心從白血病細(xì)胞株TF-1細(xì)胞中克隆得到，具有促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡和抑制增殖的效應(yīng)，其異常表達(dá)與多種腫瘤及自身免疫性疾病有相關(guān)性[1]。研究表明，PDCD5基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞[2]、前列腺癌細(xì)胞[3]、結(jié)腸癌[4]和胃癌[5]等多種惡性腫瘤組織中較正常組織表達(dá)水平下降，并且重組人PDCD5蛋白可以增強(qiáng)軟骨肉瘤細(xì)胞[6]和肺癌細(xì)胞[7]等腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其5年生存率低于20%，是全球第二個(gè)癌癥死亡相關(guān)的原因，而我國(guó)每年因胃癌死亡病例占全球人口的47.8%[8]。本研究以PDCD5基因和BGC823胃癌細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建pcDNA3.1+-PDCD5重組真核表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究PDCD5基因的功能及進(jìn)行胃癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BGC823細(xì)胞株和pcDNA3.1+質(zhì)粒由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院邵淑麗教授惠贈(zèng)；DNA回收試劑盒及細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒由武漢金開瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；RPMI 1640培養(yǎng)基干粉購(gòu)于Gibco公司；胎牛血清、DNA Marker及各種工具酶購(gòu)于上海生工；ECM830型電穿孔儀購(gòu)于美國(guó)BTX公司。

1.2 方法

1.2.1 PDCD5基因和引物的合成 PDCD5基因序列由NCBI數(shù)據(jù)庫提供的資料確定，并在序列5端和3端分別添加EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)，序列全長(zhǎng)383bp，連同pcDNA3.1+表達(dá)載體通用引物（pcDNA3.1-F：CTAGAGAACCCACTGCTTAC；pcDNA3.1-R：TAGAAGGCACAGTCGAGG）均送交武漢金開瑞生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2015年6月～2016年6月。

1.2.2 重組載體的構(gòu)建 將pcDNA3.1+載體用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切37℃、3 h；80℃、20 min。用EcoRⅠ單酶切質(zhì)粒作比對(duì)，電泳回收線性載體片段。用T4 DNA連接酶連接雙酶切載體與PDCD5基因16℃，12 h，反應(yīng)體系中雙酶切載體和PDCD5基因的摩爾比為1∶3。

1.2.3 重組載體的轉(zhuǎn)化及鑒定 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，涂布于含60 μg/mL Amp的LB篩選平板上，37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取部分轉(zhuǎn)化單菌落，以pcDNA3.1+載體通用引物進(jìn)行菌落PCR：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸45 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸1 min，4℃保存。以未轉(zhuǎn)化的DH5α菌落作陰性對(duì)照，以pcDNA3.1+質(zhì)粒作陽性對(duì)照。將經(jīng)菌落PCR鑒定正確的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)序鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞 BGC823細(xì)胞于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中晚期細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至5×106 個(gè)/mL，取400 μL加入0.4 cm電轉(zhuǎn)杯，加入經(jīng)線性化的重組載體30 μg，冰浴10 min，于185 V、30 ms電擊，電擊后冰浴10 min，將細(xì)胞移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選和檢測(cè) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，以含500 μg/mL G418的培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)8 d，以含250 μg/mL G418的培養(yǎng)基維持培養(yǎng)16 d后，收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。根據(jù)試劑盒說明提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA，以載體通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 變性45 s，55℃ 退火45 s，72℃ 延伸45 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸3 min，4℃保存。以重組質(zhì)粒作陽性對(duì)照，以未經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組作陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 重組載體的構(gòu)建

pcDNA3.1+質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物電泳圖顯示（封三圖4），單酶切產(chǎn)物大小約為5500bp，雙酶切產(chǎn)物略小于單酶切產(chǎn)物，兩者的條帶位置基本一致，與預(yù)期結(jié)果相符。pcDNA3.1+質(zhì)粒的電泳結(jié)果表現(xiàn)為復(fù)制中間體、開環(huán)、超螺旋等2～3條與線性DNA Marker不完全相對(duì)應(yīng)的電泳條帶，見封三圖4。

2.2 重組載體的鑒定

轉(zhuǎn)化單菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)電泳分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出561bp大小的條帶，與期望條帶大小一致，未轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 菌落沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，pcDNA3.1+質(zhì)粒的引物擴(kuò)增片段大小為211bp。在檢測(cè)結(jié)果中隨機(jī)選擇3個(gè)陽性克隆重復(fù)擴(kuò)增，結(jié)果穩(wěn)定（封三圖5）。經(jīng)抗性平板和菌落PCR鑒定正確的陽性克隆的測(cè)序結(jié)果與合成序列一致，說明目的基因已正確插入載體，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒（圖1）。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PCR鑒定

提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組，以載體通用引物作PCR擴(kuò)增，電泳顯示，擴(kuò)增出561bp大小的條帶，與陽性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同，陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果一致。見封三圖6。

3 討論

胃癌是嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的惡性腫瘤之一，其早期確診率較低，死亡率較高是胃癌臨床診斷和治療的突出特點(diǎn)。采用手術(shù)切除胃癌組織的方法治療中晚期胃癌，往往難以達(dá)到滿意的治療效果，因此化療是中晚期胃癌的主要治療手段，但是化療藥物的臨床應(yīng)用常導(dǎo)致多藥耐藥等反應(yīng)，造成腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的不敏感而難免復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前，多種靶向關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的分子靶向療法越來越受到抗腫瘤研究人員的重視，其對(duì)于增強(qiáng)化療效果具有重要意義。

PDCD5基因是由北京大學(xué)人類疾病基因中心1999年在國(guó)際上首先報(bào)道的一個(gè)人類新基因，由白血病細(xì)胞株TF-1細(xì)胞中克隆得到。PDCD5的mRNA除了在造血系統(tǒng)外，在成人的心臟、腎臟、腎上腺、睪丸及胎盤中高度表達(dá)，其中胚胎組織的表達(dá)低于成年組織，腫瘤細(xì)胞的表達(dá)低于正常細(xì)胞[9]。PDCD5具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，其高表達(dá)在促細(xì)胞凋亡過程中有重要作用，并且研究發(fā)現(xiàn)PDCD5是凋亡促進(jìn)劑，而不是凋亡誘導(dǎo)劑[10，11]?；诖髽颖緮?shù)據(jù)的分析表明，PDCD5基因的表達(dá)變化與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其有可能成為一種胃癌診斷與治療的新靶點(diǎn)[12]。為進(jìn)一步研究PDCD5基因在胃癌細(xì)胞中的作用，本研究構(gòu)建PDCD5基因真核表達(dá)載體，并電轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞。

在重組載體構(gòu)建中，雙酶切pcDNA3.1+質(zhì)粒，獲得與設(shè)計(jì)的合成的PDCD5基因片斷具有相同粘性末端的線性載體，PDCD5基因片斷定向連接到載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并利用質(zhì)粒的Amp抗性基因篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑取抗性平板上的單菌落，直接進(jìn)行PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒，省去了質(zhì)粒提取的繁瑣操作，避免了DNA制備過程中的某種試劑對(duì)擴(kuò)增帶來的不良影響，能夠較為準(zhǔn)確、快速的篩選出陽性克隆[13，14]。

外源DNA可通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩種方式導(dǎo)入真核細(xì)胞。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以獲得目的基因暫時(shí)的高水平表達(dá)，轉(zhuǎn)染的DNA不必整合進(jìn)宿主染色體，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的基因則整合到染色體DNA中，并利用外源DNA上帶有的抗性基因篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)選用的pcDNA3.1+質(zhì)粒攜帶neo基因，能夠高效表達(dá)分解G418的抗性產(chǎn)物—氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，從而使細(xì)胞能在含有G418的篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

雖然環(huán)狀與線狀DNA均可電穿孔轉(zhuǎn)染，但線性DNA無論瞬時(shí)表達(dá)還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的水平都要高一些[15]。因此，本研究將構(gòu)建的pcDNA3.1+-PDCD5重組質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)染，經(jīng)G418篩選獲得重組質(zhì)粒隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，進(jìn)而為后續(xù)研究PDCD5基因在胃癌細(xì)胞中的功能，以及胃癌的診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2016-11-23）