新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離鑒定及其生長代謝特性

凌空，翟磊,，姚粟，宋振，楊玉新，程池*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100015) 2(新疆中亞食品研發(fā)中心(有限公司),新疆 烏魯木齊,830001)

新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離鑒定及其生長代謝特性

凌空1，翟磊1,2，姚粟1，宋振2，楊玉新2，程池1*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100015) 2(新疆中亞食品研發(fā)中心(有限公司),新疆 烏魯木齊,830001)

從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駱駝奶、馬奶子和辣椒醬中分離篩選得到13株乳酸菌，通過16S rRNA基因序列和pheS基因序列系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)合表型特征確定乳酸菌的分類學(xué)地位。通過測定耐酸耐鹽特性、產(chǎn)酸特性、降解亞硝酸鹽能力、氨基酸脫羧酶活力及抑菌能力，篩選獲得了3株具有潛在生產(chǎn)應(yīng)用價值的乳酸菌，即LactobacilluspentosusCPC1 (CICC 6283)、LactobacilluspentosusCPC2 (CICC 6294)和LactobacilluskefiranofaciensCC3 (CICC 6287)，為乳酸菌在果蔬發(fā)酵中的應(yīng)用奠定了菌種基礎(chǔ)。

新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品；乳酸菌；分離鑒定；生長代謝特性

新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品的制作和食用歷史悠久，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，而經(jīng)過長時間的自然馴化，這些傳統(tǒng)發(fā)酵食品中一些具有優(yōu)良特性的乳酸菌保留了下來，在發(fā)酵食品過程中起到了重要作用[1]。乳酸菌因其對人體有獨特的健康功效[2-4]引起了科學(xué)研究者們的廣泛關(guān)注。對于乳酸菌的應(yīng)用、益生功能和作用機制及其代謝組學(xué)、基因組學(xué)的研究是當(dāng)前研究熱點。在發(fā)酵蔬菜應(yīng)用方面，乳酸菌被用來生產(chǎn)富含γ-氨基丁酸、B族維生素和乳酸鈣的產(chǎn)品，而且其新功能不斷被揭示[5-7]。

本研究采用分子生物學(xué)鑒定技術(shù)結(jié)合表型特征對新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駱駝奶、馬奶子和辣椒醬中分離的乳酸菌進行鑒定，明確其分類學(xué)地位。在此基礎(chǔ)上，從耐酸耐鹽特性、產(chǎn)酸能力、抑菌能力、降解亞硝酸鹽能力和氨基酸脫羧酶能力等方面對乳酸菌的生長代謝特征進行測定分析，篩選得到了3株具有潛在生產(chǎn)應(yīng)用價值的乳酸菌，為乳酸菌在果蔬發(fā)酵中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品包括新疆烏魯木齊市烏魯木齊縣南山地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵駱駝奶和馬奶子，新疆巴音郭楞蒙古自治州博湖縣發(fā)酵辣椒醬及新疆中亞食品研發(fā)中心發(fā)酵辣椒醬。

1.1.2 實驗菌株

EscherichiacoliO157:H7 CICC 10907，Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphiCICC 10871，StaphylococcusaureusCICC 10790和ListeriamonocytogenesCICC 21635。

1.1.3 實驗試劑及設(shè)備

MRS培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(Trypticase Soy Agar，TSA)、革蘭氏染色試劑盒和生理生化鑒定管均購自北京陸橋技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于OMEGA公司；GoldView購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；溶菌酶購自Sigma公司、蛋白酶購自Merk公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000 marker購自天為時代生物有限公司；其他化學(xué)藥品均為分析純產(chǎn)品。

光學(xué)顯微鏡Olympus BH-2購于奧林巴斯有限公司；pH計FE20購于梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；紫外分光光度計7200購于尤尼科(上海)儀器有限公司；溫度梯度PCR儀購于Biometra公司；恒溫培養(yǎng)箱BHG-8082型購于上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

利用梯度稀釋涂布法對樣品中乳酸菌進行分離，分別取25 mL的駱駝奶、馬奶子和25 g的辣椒醬加入到225 mL無菌生理鹽水中，用渦旋振蕩器搖勻，制得10-1的稀釋液，再從中吸取1 mL稀釋液到9 mL無菌生理鹽水中形成10-2的稀釋液，依次制得10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液。分別取100 μL稀釋液涂布于添加了2% CaCO3的MRS培養(yǎng)基，置于37 ℃下培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的單菌落進行平板劃線純化[8-9]，重復(fù)分離純化3次，挑取單個菌落進行革蘭氏染色，于100倍光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)學(xué)特征并記錄。再挑取單菌落，在其表面滴加20%的過氧化氫溶液，觀察有無氣泡產(chǎn)生，并記錄結(jié)果。分離純化后菌株在斜面上連續(xù)傳代2代后加入20%甘油進行保藏并編號。

1.2.2 乳酸菌分子生物學(xué)鑒定

通過分子生物學(xué)(16S rRNA基因序列測定及pheS基因序列分析)對分離純化的菌株進行鑒定。

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取乳酸菌的基因組。利用引物27f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)對16S rRNA基因進行擴增。PCR反應(yīng)體系為：模板10×PCR buffer 5 μL、dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL、模板 2 μL、TaqDNA 聚合酶1 μL、引物各1 μL，補充去離子水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，33個循環(huán)，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物送交北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。

利用引物21f (5’-CAYCCNGCHCGYGAYATGC-3’)和23r(5’-GGRTGRACCATVCCNGCHCC-3’)對pheS基因序列進行擴增。PCR反應(yīng)體系同上，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，46 ℃ 2 min 15 s，72 ℃ 1 min 15 s，3個循環(huán)；95 ℃ 1 min 15 s，46 ℃ 1 min 15 s, 72 ℃ 1 min 15 s，30個循環(huán)，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物送交北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。

將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，以確定其與模式菌種的同源關(guān)系。確定并下載各模式菌種的有效序列后，采用ClustalX 1.83進行多序列比對后,使用MEGA 5.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)進行系統(tǒng)發(fā)育分析[10]。

1.2.3 乳酸菌耐酸試驗

保藏的菌株經(jīng)過甘油管轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基并傳代2次后，按1%接種量分別接入pH2、3、4、5、6和pH7的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，測定620 nm下吸光值(OD620)，并記錄結(jié)果[11]。

1.2.4 乳酸菌耐鹽試驗

保藏的菌株經(jīng)過甘油管轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基并傳代2次后，按1%接種量接入分別含2%、4%、6%、8%和10%(w/v)NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，測定620 nm下吸光值(OD620)，并記錄結(jié)果[12]。

1.2.5 乳酸菌生長曲線及產(chǎn)酸能力測定

保藏的菌株經(jīng)過甘油管轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基并傳代2次后，按1%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以不接種培養(yǎng)基作為對照，每隔2 h取樣測定620 nm下吸光值(OD620)。同時每隔4 h取出部分發(fā)酵液通過pH計直接測定pH值[7, 13]。

1.2.6 乳酸菌亞硝酸鹽降解能力測定

保藏的菌株經(jīng)過甘油管轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基并傳代2次后，按1%接種量接種于含125 μg/mL NaNO2的200 mL MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，每隔24 h定時取樣測定NaNO2含量。參考GB/T 5009.33—2003中的鹽酸萘乙二胺法進行測定，不接種的MRS培養(yǎng)基(含125 μg/mL NaNO2)作為空白對照[14]。

1.2.7 乳酸菌氨基酸脫羧酶試驗

保藏的菌株經(jīng)過甘油管轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基并傳代2次后，接種于MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取MRS培養(yǎng)基上生長的單菌落于3 mL無菌生理鹽水中研磨，制備成0.5 McFarland懸液，分別滴入氨基酸脫羧酶試驗的安培瓶中，每瓶3滴，并加無菌液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)18～24 h后，觀察試驗管與對照管顏色變化，試驗管為紫色，對照管為黃色，結(jié)果為陽性；試驗管與對照管均為黃色，結(jié)果為陰性。

1.2.8 乳酸菌抑菌性研究

參考張佳等[15]的方法并作少許修改，采用濾紙片法測定目標(biāo)菌株的抑菌性能。挑取新鮮培養(yǎng)的指示菌株(EscherichiacoliO157:H7 CICC 10907，Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphi CICC 10871，StaphylococcusaureusCICC 10790和ListeriamonocytogenesCICC 21635)，將菌懸液濃度調(diào)至0.5 McFarland并均勻涂布在TSA培養(yǎng)基上，然后用無菌鑷子夾取無菌濾紙片放入已培養(yǎng)48 h的乳酸菌發(fā)酵上清液中，充分浸泡后，置于上述培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從MRS平板上挑取13個有溶鈣圈且外觀不同的菌落，純化后獲得的菌株分別命名為CM1、CM2、CM3、CM4、CC1、CC2、CC3、CPC1、CPC2、CP1、CP2、CPZ1和CPZ2。革蘭氏染色以及接觸酶實驗表明13株菌株均為革蘭氏陽性，接觸酶陰性菌株，符合乳酸菌的特征(表1)。

2.2 乳酸菌分子生物學(xué)鑒定

16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明13株菌株均屬于乳酸菌，其中菌株CC2和CC3與產(chǎn)馬乳酒乳桿菌的同源性為99.86%，且與其他近種的同源性均在98.65%以下，則菌株CC2和CC3可鑒定為Lactobacilluskefiranofaciens。菌株CPZ2與消化乳桿菌的同源性為99.93%，且與其他近種的同源性均在98.65%以下，則菌株CPZ2可鑒定為Lactobacillusalimentarius，其余10株菌株只能鑒定到屬水平(圖1-A)。對于16S rRNA基因序列只能鑒定到屬水平的菌株進行pheS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明菌株CPZ1、CP1、CPC1和CPC2與戊糖乳桿菌的同源性為100%，可鑒定為Lactobacilluspentosus，CC1、CM1、CM2、CM3和CM4與瑞士乳桿菌的同源性為100%，可鑒定為Lactobacillushelveticus，而菌株CP2與耐乙酸片球菌的同源性為100%，鑒定為Pediococcusethanolidurans(圖1-B)。分離鑒定的13株乳酸菌均已保藏于中國工業(yè)菌種保藏管理中心(CICC)(表1)。

表1 分離鑒定的乳酸菌信息統(tǒng)計

A-16S rRNA基因;B-pheS基因圖1 分離鑒定的乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic trees of isolated and identified lactic acid bacteria采用MEGA5.0軟件，鄰位連接法顯示菌株與相關(guān)模式種系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1000次的相似度重復(fù)計算，圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50%數(shù)值，上標(biāo)的“T”表示模式菌株

2.3 乳酸菌耐酸耐鹽實驗

耐酸試驗結(jié)果表明，隨著pH值降低，乳酸菌的生長受到明顯的抑制。其中菌株CC3、CPC1和CPC2展現(xiàn)了較強的耐酸能力，其中菌株CC1在pH 3條件下OD620值能達到0.16，而其他菌株只能達到0.05左右，其中菌株CPC2在pH 4的條件下的OD620值可以達到0.94。而菌株CP2耐酸能力最弱，不能在pH 4的環(huán)境下生長，在pH 5、6和pH7的環(huán)境中生長也較弱(圖2-A)。

耐鹽試驗結(jié)果表明，乳酸菌的生長與NaCl濃度成反比，即隨著NaCl濃度的升高，乳酸菌的生長受到明顯的抑制(圖2-B)。所有菌株在2%的NaCl下可以正常生長，但CM4、CP2和CPZ2的生長緩慢。而菌株CPC1的耐鹽能力最強，在8%的NaCl條件下，OD620值可以達到0.55。菌株CC1、CC3、CPC1、CPC2和CM1能夠耐受6%的NaCl。綜合分析乳酸菌的耐酸和耐鹽能力，選取菌株CC1、CC3、CPC1、CPC2和CM1進行后續(xù)生長代謝特性研究(圖2-B)。

A-耐酸特性;B-耐鹽特性圖2 分離鑒定的乳酸菌耐酸耐鹽特性 Fig.2 Acid and salt-resistance properties of isolated and identified lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌的生長曲線和產(chǎn)酸能力測定

A-生長特性;B-產(chǎn)酸特性圖3 分離鑒定的乳酸菌的生長和產(chǎn)酸特性 Fig.3 Growth and acid production of isolated and identified lactic acid bacteria

生長曲線測定表明，菌株CPC1、CC3和CPC2進入對數(shù)期較快，分別在8 h、10 h和10 h最早進入對數(shù)期，分別在16 h、32 h和34 h進入穩(wěn)定期，而CM1在16 h最晚進入對數(shù)期(圖3-A)。產(chǎn)酸能力測定結(jié)果表明，菌株CPC1產(chǎn)酸速度最快，產(chǎn)酸能力最大，pH值可以降到3.62，菌株CC3和CPC2產(chǎn)酸速度次之，pH值可以降到3.83(圖3-B)。由此可見，菌株進入對數(shù)期越快，其產(chǎn)酸速率也較快。

2.5 乳酸菌亞硝酸鹽降解能力測定

隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株降解的亞硝酸鹽越多。培養(yǎng)24 h后，CC3、CPC1和CPC2的降解率分別可達到92.61%、94.82%和98.84%，而CC1和CM1的降解率只有34.35%和24.26%。培養(yǎng)48 h后，除CC1和CM1的降解率達到82.73%和81.84%外，其余3株降解率均可以達到100%(表2)。

表2 分離鑒定的乳酸菌表型特性

注：“a”表示菌株培養(yǎng)24 h后的亞硝酸鹽降解率，“b”表示菌株培養(yǎng)48 h后的亞硝酸鹽降解率；“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.6 乳酸菌氨基酸脫羧酶試驗

經(jīng)過氨基酸脫羧酶試驗，菌株CM1對精氨酸雙水解和鳥氨酸脫羧酶活性顯陽性，剩余菌株對4種氨基酸脫羧酶活性均顯陰性(表2)。

2.7 乳酸菌抑菌能力測定

由抑菌能力實驗結(jié)果可知，5株乳酸菌均能夠抑制菌腸炎沙門氏菌和大腸桿菌，其中CPC1和CPC2的抑菌作用最大，對于腸炎沙門氏菌的抑菌直徑可達到24.2 mm和26.0 mm，對于大腸桿菌的抑菌直徑可達到16.3 mm和13.3 mm。僅CC1不能抑制金黃色葡萄球菌，其中CPC2抑制作用最大，抑菌直徑為19.4 mm，菌株對單增李斯特菌的抑菌作用較弱，而CC3對4種病原菌都有抑制作用(表2)。

3 結(jié)論

通過分子生物學(xué)鑒定，結(jié)合表型特征確定乳酸菌的分類學(xué)地位。從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品中共篩選到2個屬，13株乳酸菌。其中瑞士乳桿菌5株，戊糖乳桿菌4株，產(chǎn)馬乳酒乳桿菌2株，消化乳桿菌和耐乙酸片球菌各1株，并將這些乳酸菌資源保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，豐富了新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品的乳酸菌資源。從菌株來源看，新疆馬奶子中主要含有瑞士乳桿菌，而駱駝奶中既含有瑞士乳桿菌又含有產(chǎn)馬乳酒乳桿菌。其中瑞士乳桿菌也是由熊素玉等[10]從新疆酸馬奶中分離的主要乳酸菌，而產(chǎn)馬乳酒乳桿菌的研究報道較少，是今后研究的重點。辣椒醬中都含有戊糖乳桿菌，而博湖濃縮辣椒醬中還含有耐乙酸片球菌，來自中亞食品的辣椒醬除了戊糖乳桿菌外，還含有消化乳桿菌。由此可見，不同來源的辣椒醬中既含有相同乳酸菌又各具特色(圖4)。因此本研究對于新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌資源的收集積累具有重要意義。

圖4 分離鑒定的乳酸菌的種類和來源Fig.4 Classification and origin of isolated and identified lactic acid bacteria

乳酸菌對低酸環(huán)境和滲透壓的耐受性也是作為發(fā)酵劑和益生菌的必要條件[2]。紀(jì)曉燚[7]等以乳酸菌在不同pH條件下的適應(yīng)性為指標(biāo)，試驗篩選出耐酸較好的菌株在pH 4條件下的OD620在0.5左右，并將其應(yīng)用于發(fā)酵。BEGANOVIC[11]對篩選到的菌株進行4%～6% NaCl條件下的耐鹽試驗，認(rèn)為優(yōu)良菌株的OD600值在0.4～0.6之間。本研究中篩選得到的菌株CC3、CPC1和CPC2在pH 4條件下的OD620均在0.5以上，菌株CPC1在鹽濃度為6%條件下的OD620為1.09，展現(xiàn)了良好的耐酸和耐鹽能力，HWANHLEM[16]等認(rèn)為乳酸可以導(dǎo)致革蘭氏陰性病原菌外膜的損傷，引起病原菌LPS層的破壞從而導(dǎo)致的亞致死損傷，試驗選取降低pH能力作為篩選指標(biāo)，得到產(chǎn)酸可以使pH值降至pH4.3～4.6的菌株應(yīng)用于發(fā)酵中。AMMOR[17]等認(rèn)為乳酸菌快速產(chǎn)酸形成的低酸環(huán)境可以抑制有害菌群的繁殖從而提升產(chǎn)品的安全性及貨架期。而本實驗中篩選得到的菌株產(chǎn)酸后均可以使pH值降至4.30以下，為后續(xù)的果蔬發(fā)酵試驗奠定了基礎(chǔ)。

根據(jù)GB/T 2762—2012食品中污染物限量規(guī)定，蔬菜及其制品腌漬蔬菜的亞硝酸鹽(以NaNO2計)含量不大于20 mg/kg，攝取過量的亞硝酸鹽會引起致癌、抵抗甲狀腺素和引起智障等危害[18]。FRIEDRICH-KARL[19]等在關(guān)于德國常見傳統(tǒng)食品的安全挑戰(zhàn)研究中就提到生物胺的危害性，生物胺是菌株利用氨基酸在氨基酸脫羧酶的作用下產(chǎn)生的，如果健康人群攝入大量生物胺，或易感人群攝入少量生物胺，生物胺能進入機體各組織系統(tǒng)，導(dǎo)致腎上腺素和胃酸過量分泌、心跳加快、血糖含量增加或血壓升高等癥狀[20]。YOSEP[21]等在分離于韓國泡菜中乳酸菌的安全性評價中把是否產(chǎn)生生物胺作為考察指標(biāo)之一。所以果蔬發(fā)酵中亞硝酸鹽及生物胺的含量也是考慮的重要因素。因此篩選降解亞硝酸能力強和不產(chǎn)生物胺的菌株作為發(fā)酵劑能夠降低最終產(chǎn)品中亞硝酸鹽和生物胺的含量，提高產(chǎn)品的安全性。菌株CC3、CPC1和CPC培養(yǎng)48 h后亞硝酸鹽的降解率可達100%，高于目前報道的乳酸菌[22]。而且菌株CC3、CPC1和CPC2的4種氨基酸脫羧酶均為陰性，不會產(chǎn)生生物胺。同時對4種有害菌種均有抑菌作用，將其應(yīng)用在果蔬發(fā)酵中，能夠進一步提高產(chǎn)品的安全性。

綜上所述，本研究篩選得到了13株來自新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品的乳酸菌，對于新疆乳酸菌資源的收集和積累具有重要意義。通過功能篩選，獲得了3株具有潛在生產(chǎn)價值的乳酸菌，即LactobacilluspentosusCPC1 (CICC 6283)、LactobacilluspentosusCPC2 (CICC 6294)和LactobacilluskefiranofaciensCC3 (CICC 6287)，為乳酸菌在果蔬發(fā)酵中的應(yīng)用奠定了菌種基礎(chǔ)。

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Isolation, identification and characterization of lactic acid bacteria from traditionally fermented foods in Xinjiang

LING Kong1,ZHAI Lei1,2,YAO Su1,SONG Zhen2,YANG Yu-xin2,CHENG Chi1*

1(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100015, China) 2(Xinjiang Central Asia Food Research and Development Centre, Urumchi 830001, China)

Thirteen strains of lactic acid bacteria were isolated from traditionally fermented foods including camel milk, mare milk and chilli sauce in Xinjiang. These lactic acid bacteria were identified by phylogenetic analyses of 16S rRNA gene and pheS gene, combined with phenotypic characteristics. Based on the abilities of acid- and salt-resistance, acid production, nitrite degradation, activity of amino acids decarboxylase and antimicrobial properties, the lactic acid bacteria with potential for application were chosen. As a result, three lactic acid bacteria designated asLactobacilluspentosusCPC1 (CICC 6283),LactobacilluspentosusCPC2 (CICC 6294) andLactobacilluskefiranofaciensCC3 (CICC 6287) were obtained and laid a foundation for vegetable fermentation application.

naturally fermented food in Xinjiang; lactic acid bacteria (LAB); isolation and identification; growth metabolism

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703022

碩士研究生(程池教授為通訊作者,E-mail：cheng100027@163.com)。

國家微生物資源平臺專項(No. NIMR2016-4)；自治區(qū)科技支疆項目(2016E02021)；中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金(博士基金)項目(No. 2015KJFZ-BS-04)

2016-09-12，改回日期：2016-11-29