體外受精-胚胎移植反復(fù)種植失敗與抗磷脂抗體的相關(guān)性研究

唐 君，毛增輝，劉人杰，黃 啟，文 壹

（湖南省計(jì)劃生育研究所生殖醫(yī)學(xué)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

體外受精-胚胎移植反復(fù)種植失敗與抗磷脂抗體的相關(guān)性研究

唐 君，毛增輝，劉人杰，黃 啟，文 壹

（湖南省計(jì)劃生育研究所生殖醫(yī)學(xué)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

目的 研究抗磷脂抗體（APA）與體外受精-胚胎移植（IVF-ET）胚胎反復(fù)種植失敗（RIF）的相關(guān)性。方法 選取本生殖中心2013年3月～2015年7月IVF-ET后RIF者100例為研究對(duì)象，作為研究組，同期第一次接受體外受精-胚胎移植妊娠者100例為對(duì)照組，研究組納入之前，接受≧5個(gè)同期胚胎移植。采用APA金標(biāo)法定性及ELISA定量法檢測(cè)IgG、IgM抗心磷脂抗體、抗磷脂酰乙醇胺抗體、抗磷脂酰肌醇抗體、抗磷脂酰酸抗體、抗磷脂酰甘油抗體、抗磷脂酰膽堿抗體和抗磷脂酰絲氨酸抗體。結(jié)果 （1）研究組IVF-ET反復(fù)種植失敗者中有23例檢測(cè)到陽性特異性抗磷脂抗體，陽性率為23%；對(duì)照組中僅有4例檢測(cè)到陽性特異性抗磷脂抗體，陽性率4%，研究組陽性率顯著高于對(duì)照組。（2）研究組IVF-ET反復(fù)種植失敗者7種特異性抗磷脂抗體IgG、IgM定量檢測(cè)平均值顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 IVF-ET反復(fù)種植失敗者7種特異性抗磷脂抗體IgG、IgM定性檢測(cè)陽性率及定量檢測(cè)平均值均顯著高于同期第一次接受體外受精-胚胎移植妊娠者，抗磷脂抗體與IVF-ET后RIF呈正相關(guān)，提示抗磷脂抗體可能是導(dǎo)致反復(fù)著床失敗的原因之一。

抗磷脂抗體；體外受精-胚胎移植；反復(fù)種植失敗

人類輔助生殖技術(shù)應(yīng)用以來，為廣大不孕夫婦帶來了福音，而其高效的培養(yǎng) 系統(tǒng)、良好的胚胎選擇方法和手段以及完善的胚胎移植技術(shù)使得目前的體外受精胚胎移植妊娠率已經(jīng)達(dá)到甚至超過了自然妊娠[1]，試管嬰兒在世界各地不斷誕生，但仍然存在不可忽視的RIF現(xiàn)象，給患者帶來了經(jīng)濟(jì)和精神上的打擊，那么其發(fā)生機(jī)制的研究和如何改變這類患者的治療結(jié)局來提高種植成功率，成為了生殖生物學(xué)和輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。自1985年國外Gleicher[2]等人定義了抗磷脂抗體與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)以及不明原因不孕癥和子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系以來，APA被廣泛用于描述與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性。早期有國外研究報(bào)道認(rèn)為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不明原因不孕癥和子宮內(nèi)膜異位癥女性受試者中存在抗磷脂抗體，則診斷有生殖免疫衰竭綜合征（RAFS）[3]。雖然我國醫(yī)學(xué)上目前對(duì)于RIF的病因尚不明確，但普遍認(rèn)為其可能與配子和胚胎、子宮內(nèi)膜以及自身免疫調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)。遺憾的是目前國內(nèi)尚無APA與IVF-ET后的胚胎反復(fù)種植失敗的研究報(bào)道。本研究采用APA定性和定量對(duì)100例IVF-ET反復(fù)種植失敗者血清中7種特異性抗磷脂抗體進(jìn)行檢測(cè)，并將此結(jié)果與100例同期第一次接受體外受精-胚胎移植妊娠者進(jìn)行了比較，全面分析APA與RIF的相關(guān)性，同時(shí)也為RIF患者是否需要藥物干預(yù)及治療后再次助孕妊娠結(jié)局分析提供可行性依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本生殖中心2013年3月～2015年7月IVF-ET后RIF者100例為研究對(duì)象，RIF定義為移植5個(gè)或以上胚胎無著床跡象。納入標(biāo)準(zhǔn)：胚胎移植周期數(shù)≥ 2周期，移植胚胎總數(shù)≥5個(gè)，移植后第12天β-HCG＜3 mIU/mL；排除男女方染色體、病毒感染、自然流產(chǎn)史及子宮內(nèi)膜因素。另選100例同期第一次IVF-ET妊娠者為對(duì)照組。兩組年齡、不孕年限、既往妊娠史、胚胎移植數(shù)、胚胎評(píng)分、胚胎時(shí)期，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 標(biāo)本采集

取兩組外周血新鮮標(biāo)本，在室溫下靜置1～2 h后，以2000 r/min的速度，分離血清上清液，置-70度深低溫冰箱中待測(cè)；采用APA金標(biāo)法定性及ELISA定量法完成7種磷脂-心磷脂（CL）、磷脂酰酸（PA）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酰膽堿（PC）檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以“x ±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組陽性率的比較

研究組有23例檢測(cè)到陽性特異性抗磷脂抗體，陽性率為23%；對(duì)照組中僅有4例檢測(cè)到陽性特異性抗磷脂抗體，陽性率4%，研究組陽性率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組APA陽性率檢測(cè)結(jié)果 [n（%）]

2.2 研究組7種特異性抗磷脂抗體（抗心磷脂抗體ACA、抗磷脂酰乙醇胺抗體APE、抗磷脂酰肌醇抗體API、抗磷脂酰酸抗體APA、抗磷脂酰甘油抗體APG、抗磷脂酰膽堿抗體APC和抗磷脂酰絲氨酸抗體（APS）IgG、IgM定量檢測(cè)平均值高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、表3。

表2 兩組APA-IgG定量檢測(cè)平均值結(jié)果

表3 兩組APA-IgM定量檢測(cè)平均值結(jié)果

3 討 論

妊娠是一個(gè)復(fù)雜而又協(xié)調(diào)的過程，胚胎作為一種半同種移植物之所以能夠維持取決于母胎間免疫關(guān)系的平衡，稱之為免疫耐受狀態(tài)或妊娠免疫耐受，而母體蛻膜組織和胎盤滋養(yǎng)層組織共同構(gòu)成的母胎界面是妊娠免疫耐受的基礎(chǔ)，一旦此免疫耐受遭到破壞將會(huì)導(dǎo)致RIF。早在2006年，Margalioth等[4]提出經(jīng)過2～6個(gè)周期，移植≥10個(gè)高質(zhì)量胚胎仍未妊娠者定義為RIF，美國反復(fù)種植失敗發(fā)生率約19%。近年有研究發(fā)現(xiàn)體外受精-胚胎移植反復(fù)種植失敗與自身免疫因素相關(guān)，而在各種自身抗體中，APA在反復(fù)種植失敗過程中起著不可忽視的作用[5]。

磷脂普遍存在于動(dòng)物體內(nèi)，形成脂類雙分子層骨架，是合成機(jī)體細(xì)胞膜的主要成分，也是構(gòu)成胎盤絨毛膜的必需成分。磷脂在著床過程中作為粘著分子起修飾的作用。帶負(fù)電荷的磷脂是抗磷脂抗體的靶抗原，它與中性磷脂類不同，一般位于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)層。在生理狀態(tài)下帶負(fù)電荷的磷脂并不暴露于細(xì)胞膜外表，從而不能被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別，只有在病理狀態(tài)下帶負(fù)電荷的磷脂才暴露于細(xì)胞膜的外表，一旦暴露于機(jī)體免疫系統(tǒng)即可產(chǎn)生抗磷脂抗體，抗磷脂抗體是一組針對(duì)各種帶負(fù)電荷磷脂的異質(zhì)性自身抗體的總稱，APA不僅僅包括抗心磷脂抗體，而且還包括磷脂酰酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油及磷脂酰膽堿[6]。國外有研究顯示APA與IVF-ET后的胚胎反復(fù)種植失敗相關(guān)，其發(fā)生機(jī)制可能為：（1）血管栓塞導(dǎo)致胚胎種植部位的血供減少，導(dǎo)致胎盤功能不全；（2）APA直接與滋養(yǎng)層細(xì)胞相結(jié)合影響滋養(yǎng)層細(xì)胞功能，如抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)化為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入、HCG的生成及種植。而滋養(yǎng)層細(xì)胞位于母胎界面，其特定的解剖學(xué)分布與獨(dú)特的生物學(xué)功能是妊娠建立和維持的基礎(chǔ)，是母體免疫識(shí)別和應(yīng)答的直接靶細(xì)胞；（3）改變內(nèi)皮細(xì)胞容受性[7-8]。

膜聯(lián)蛋白V結(jié)合到滋養(yǎng)層細(xì)胞表面，通過防止凝血酶原復(fù)合物的形成和抑制促凝活性達(dá)到抗凝作用，從而防止血栓形成來維持正常妊娠，而APA影響了膜聯(lián)蛋白V在滋養(yǎng)層細(xì)胞表面的表達(dá)，妊娠合并APAS陽性者，胎盤表面膜聯(lián)蛋白V減少。Rote[9]的研究提示，APA能清除滋養(yǎng)細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V，并且能增強(qiáng)與凝血酶原的結(jié)合。在體外，膜聯(lián)蛋白Ⅴ能與人凝血酶原結(jié)合。APA能清除凝血酶原上的膜聯(lián)蛋白V且阻止正常的胚胎種植。以往研究也表明APA能識(shí)別受精卵并且對(duì)胚胎前期的發(fā)育有著不利影響。目前國內(nèi)有研究報(bào)道反復(fù)種植失敗患者外周血Foxp3及免疫抑制因子TGF-β1的表達(dá)降低、Treg細(xì)胞數(shù)目明顯減少以及功能相關(guān)基因Foxp3的表達(dá)降低、白細(xì)胞介素-17表達(dá)明顯增多、自然殺傷細(xì)胞的變化均可能是體外受精-胚胎移植反復(fù)種植失敗的原因[10]。而本研究組共納入100例IVF-ET后RIF者，其中23%檢測(cè)有陽性抗磷脂抗體。此發(fā)生率與國外早期接受體外受精胚胎移植周期者以及體外受精治療失敗者抗磷脂抗體的陽性率一致[11]。研究組IgG、IgM陽性率分別為20%、3%，抗磷脂抗體的兩種亞型IgG和IgM中，IgG容易引起死胎和血栓，而IgM主要導(dǎo)致流產(chǎn)[12]，而本研究組IgG和IgM同種型抗體比例較高，亦提示了抗磷脂抗體與IVF-ET后RIF的相關(guān)關(guān)系。而其他研究發(fā)現(xiàn)輸卵管因素、男性因素和不明原因不孕癥者的自身抗體發(fā)生率無顯著差異。

以往僅評(píng)價(jià)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者中的抗心磷脂抗體具有顯著危害，如果僅檢測(cè)抗心磷脂抗體，將會(huì)導(dǎo)致僅檢測(cè)到4%著床失敗者具有陽性特異性抗磷脂抗體，漏診81%與生殖免疫衰竭綜合征相關(guān)的著床失敗者[13]。而本研究結(jié)果表明其他磷脂抗體對(duì)女性IVF-ET后RIF的評(píng)估具有重要意義，抗磷脂抗體定性與定量測(cè)定與IVF-ET后RIF呈正相關(guān)，其為IVF-ET反復(fù)種植失敗患者可經(jīng)藥物干預(yù)改善助孕妊娠結(jié)局提供了理論依據(jù)。

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本文編輯：劉帥帥

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B

ISSN.2095-8803.2017.01.048.03

湖南省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目：2014SK3155

唐君（1979-），女，碩士研究生，研究方向：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及人類輔助生殖技，E-mail：742976265@qq.com