凹葉厚樸用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織的制備研究

謝燕燕，衛(wèi) 梅，謝德金，陳劍成，楊德明，榮俊冬，陳禮光，鄭郁善,*（.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 35000；.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福建 福州 35000）

凹葉厚樸用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織的制備研究

謝燕燕1，衛(wèi) 梅2，謝德金1，陳劍成1，楊德明1，榮俊冬1，陳禮光1，鄭郁善1,2*
（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福建 福州 350002）

目的 研究凹葉厚樸適用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織。方法 通過(guò)對(duì)基本培養(yǎng)基（B5、MS和1/2MS）、外植體（莖段、頂芽和葉片）、激素濃度及組合進(jìn)行篩選的方法進(jìn)行厚樸愈傷組織誘導(dǎo)和繼代研究。結(jié)果 B5為最適合厚樸愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基；頂芽是最佳誘導(dǎo)愈傷組織的材料；最適合厚樸愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為B5+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA；最佳繼代培養(yǎng)基為B5+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，愈傷組織生長(zhǎng)倍數(shù)達(dá)到2.87倍。結(jié)論 初步篩選出凹葉厚樸用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織，為凹葉厚樸細(xì)胞培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

凹葉厚樸；愈傷組織；懸浮培養(yǎng)

本文引用：謝燕燕，衛(wèi) 梅，謝德金，陳劍成，楊德明，榮俊冬，陳禮光，鄭郁善.凹葉厚樸用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織的制備研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（4）：365-368.

凹葉厚樸 Magnolia officinalis subsp.biloba （Rehd.et Wils.）Law，為木蘭科木蘭屬皺皮木蘭的植物[1-2]，集材用、藥用、觀賞于一體，為我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，也是國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[3]。厚樸以干燥樹(shù)皮和根皮入藥，主要用于治療食積氣滯、腹脹便秘、濕阻中焦、脘痞吐瀉、痰壅氣逆、胸滿喘咳等[4]。厚樸藥用有效成分主要為厚樸酚及和厚樸酚[5]。近年來(lái)，人們過(guò)度砍伐厚樸植株，使厚樸資源急劇減少。如今野生資源瀕臨枯竭，厚樸需 20年左右才能成材入藥，如何快速生產(chǎn)有用的植物藥物及代謝物質(zhì)成為熱點(diǎn)問(wèn)題。有相關(guān)研究表明植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)可批量生產(chǎn)有用的植物藥物及代謝物質(zhì)[6]，而用于培養(yǎng)厚樸懸浮細(xì)胞的愈傷組織的制備成為至關(guān)重要的一步。選擇生長(zhǎng)速度快、疏松易碎的愈傷組織是進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵[7]。故本研究通過(guò)優(yōu)化厚樸愈傷組織誘導(dǎo)體系，篩選出最適合用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織的培養(yǎng)條件，以期為今后培養(yǎng)厚樸細(xì)胞提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本次研究的試驗(yàn)材料由福建農(nóng)林大學(xué)工業(yè)原料林研究所提供的厚樸 （Magnolia officinalis）優(yōu)樹(shù)植株。選取幼嫩、生長(zhǎng)健壯而無(wú)病蟲(chóng)害的莖段、頂芽、葉片為外植體。愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)除取材部位試驗(yàn)外，均選用厚樸嫩葉為外植體。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 用洗衣粉清洗、漂洗厚樸外植體，在無(wú)菌條件下用75%乙醇消毒30 s,再用0.1%升汞溶液浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次。將消毒后的外植體接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上。繼代培養(yǎng)即將愈傷組織取出后，盡量除去粘附其上的培養(yǎng)基，并將愈傷組織切成多塊轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基中。

1.2.2 培養(yǎng)基及激素 以 B5（Gamborg，1968）、MS (Murashige&Skoog,1962)、和1/2MS(1/2MS大量元素，其他成分不變)為基本培養(yǎng)基(蔗糖30 g/L，瓊脂8 g/L，pH 5.8)，以2,4-D、6-BA、NAA和KT為誘導(dǎo)激素（注：除激素試驗(yàn)外，其他試驗(yàn)均添加NAA 2.0 mg/L+6-BA1.0 mg/L外源激素）。

1.2.3 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，濕度一般保持在60%～70%，在黑暗條件下培養(yǎng)。每種處理接種30瓶，每瓶接種1～2個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)收集 外植體接種后每天觀察一次，并記錄愈傷組織啟動(dòng)天數(shù)和啟動(dòng)效果。同時(shí)測(cè)定愈傷組織的誘導(dǎo)率、污染率、褐化率及生長(zhǎng)倍數(shù)，計(jì)算公式如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率=未污染外植體分化數(shù)/未污染的外植體數(shù)×100%

污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%褐化率=褐變的外植體塊數(shù)/接種的外植體塊數(shù)×100%

愈傷組織生長(zhǎng)倍數(shù)=（生長(zhǎng)后質(zhì)量-接種量）/接種量

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對(duì)厚樸愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以厚樸嫩葉為外植體進(jìn)行的愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果如表 1。由此可知，在激素種類和濃度相同的條件下，不同培養(yǎng)基對(duì)厚樸愈傷組織的誘導(dǎo)率及啟動(dòng)速度的影響亦不相同。方差分析表明差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01），見(jiàn)表2。在B5培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到75.00%；在1/2MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)率次之，為60.00%；而在MS培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最低，只有48.08%。在B5培養(yǎng)基中平均啟動(dòng)速度最快，而在1/ 2MS培養(yǎng)基上的外植體啟動(dòng)速度與MS培養(yǎng)基并無(wú)明顯差異（P＞0.05）。因此，選擇B5為誘導(dǎo)厚樸愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。

表1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2 啟動(dòng)速度方差分析表

表3 不同取材部位對(duì)外植體污染率、褐化率和愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.2 不同取材部位對(duì)外植體污染率、外植體褐化率和愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

由表3可知，以葉片為外植體的污染率最低，頂芽次之，莖段的污染率最高。方差分析表明差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01），見(jiàn)表4；從褐化率來(lái)看，頂芽褐化率最大，莖段次之，葉片褐化率最低，方差分析表明差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01），見(jiàn)表5，說(shuō)明植物不同部位含多酚類化合物存在差異；從誘導(dǎo)率來(lái)看，以莖段作為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，頂芽次之，葉片最低，方差分析表明差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01），見(jiàn)表6。

愈傷組織誘導(dǎo)率=發(fā)生愈傷組織外植體數(shù)/接種數(shù)×100%（接種數(shù)不包括污染和褐化材料）

頂芽褐化率雖高于莖段和葉片，但是頂芽誘導(dǎo)出的愈傷組織生長(zhǎng)迅速，質(zhì)地疏松，微黃色，繼代后也能較好生長(zhǎng)。而葉片污染率和褐化率雖然都是最低的，但其誘導(dǎo)出的愈傷組織較松散，繼代時(shí)易分散成顆粒狀，過(guò)幾天后開(kāi)始褐變死亡。莖段誘導(dǎo)的愈傷組織雖誘導(dǎo)率最高，生長(zhǎng)也較迅速，但是其污染率也是最高的，誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地較硬，不利于為后期的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系提供良好材料。因此認(rèn)為頂芽是最佳誘導(dǎo)厚樸愈傷組織的材料。見(jiàn)圖1。

表4 不同外植體污染率的方差分析表

表5 外植體不同部位褐化率方差分析表

表6 不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率的方差分析表

圖1 不同取材部位愈傷組織誘導(dǎo)情況

2.3 外源激素配比的篩選

從表7～9的試驗(yàn)結(jié)果中可以確定出最適合厚樸愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為B5+2.0 mg/L 2,4-D+ 1.0 mg/L 6-BA，啟動(dòng)時(shí)間最短，誘導(dǎo)率最高。NAA濃度在1.0～3.0 mg/L之間，啟動(dòng)天數(shù)和愈傷組織誘導(dǎo)率隨濃度的增加而增加。6-BA較KT對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響更大；2,4-D在誘導(dǎo)愈傷組織形成過(guò)程中，生理活性較NAA強(qiáng)，啟動(dòng)時(shí)間短，且誘導(dǎo)率更多，但試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，2,4-D不適合厚樸愈傷組織增殖培養(yǎng)，愈傷組織隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，顏色逐漸變得淡白，或是發(fā)生褐化死亡，原因可能是2,4-D本身具有一定的毒性，具有致癌活性[8]。因此，2,4-D有利于厚樸愈傷組織的誘導(dǎo)，但不適合愈傷組織的增殖培養(yǎng)。此外，從上述3個(gè)表中發(fā)現(xiàn)，有添加6-BA的培養(yǎng)基其誘導(dǎo)出的愈傷組織的生長(zhǎng)狀況大部分在4個(gè)“+”以上，而在無(wú)添加6-BA的培養(yǎng)基上的愈傷組織生長(zhǎng)狀況均在 2～3個(gè)“+”，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織顏色逐漸變得淡白，質(zhì)地松軟，甚至枯死，不適宜進(jìn)行繼代培養(yǎng)?？梢?jiàn)6-BA對(duì)于保持愈傷組織的活力起到關(guān)鍵的作用。

表7 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA和6-BA的激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表8 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA和KT的激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表9 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4-D和6-BA的激素組合對(duì)厚樸愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 厚樸愈傷組織增殖培養(yǎng)試驗(yàn)

由外源激素配比的篩選結(jié)果可知，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA和6-BA的激素組合較適合厚樸愈傷組織的繼代培養(yǎng)，故本試驗(yàn)添加了不同質(zhì)量濃度的NAA和6-BA，探索最適合厚樸愈傷組織生長(zhǎng)的激素組合濃度，由表10可知，從K1～K8愈傷組織增殖倍數(shù)的結(jié)果可以看出，當(dāng)NAA濃度小于或等于2.0 mg/L及6-BA濃度小于或等于1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的增殖倍數(shù)是與二者的濃度呈正相關(guān)的，隨著二者的濃度的增加而增加；K7與K8組增殖倍數(shù)均低于1.5倍，說(shuō)明NAA與 6-BA濃度太高會(huì)抑制愈傷組織的生長(zhǎng)。K6號(hào)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的愈傷組織生長(zhǎng)倍數(shù)最大，達(dá)到2.865倍，且生長(zhǎng)狀態(tài)較好，淡黃色、較疏松。愈傷組織越疏松，細(xì)胞的分散程度就越大，有利于進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。因此認(rèn)為K6號(hào)培養(yǎng)基為厚樸愈傷組織最佳繼代培養(yǎng)基，即適宜的培養(yǎng)基為B5+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA。

表10 愈傷組織增殖培養(yǎng)效果

3 討論

適宜的基本培養(yǎng)基對(duì)于植物組織培養(yǎng)起著關(guān)鍵的作用[9]。在本次試驗(yàn)中，厚樸外植體在B5培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最高，這與劉葉曼[2]、童再康[10]、馬英姿[11]的研究結(jié)果一致。比較3種培養(yǎng)基的離子濃度，可以看出，MS培養(yǎng)基中NH4+濃度較高，而較高NH4+濃度會(huì)造成對(duì)愈傷組織的毒害，不利于其分化生長(zhǎng)。

厚樸不同取材部位的愈傷組織污染率、褐化率和誘導(dǎo)率的高低順序分別為：（1）污染率：頂芽＞莖段＞葉片；（2）褐化率：頂芽＞莖段＞葉片；（3）誘導(dǎo)率：莖段＞頂芽＞葉片。頂芽污染率最高的原因是頂芽有鱗片，消毒難度肯定會(huì)大些。關(guān)于褐變機(jī)理，一般認(rèn)為是植物細(xì)胞中含有較多的酚類化合物而易被多酚氧化酶氧化成褐色的醌類物質(zhì)[12]。多酚類化合物含量越多越容易發(fā)生褐化。由本次試驗(yàn)研究結(jié)果可以得出厚樸頂芽、莖段和葉片含多酚類化合物的高低順序?yàn)椋喉斞浚厩o段＞葉片。誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生的影響因素較多且復(fù)雜，主要分為外因（培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和植物激素）和內(nèi)因（基因型、生長(zhǎng)狀況及內(nèi)源激素），其中內(nèi)源激素起主要作用[13]。馮質(zhì)雷研究表明內(nèi)源激素的含量及不同種類內(nèi)源激素間的濃度配比是決定玉米自交系愈傷組織誘導(dǎo)率的因素之一[14]。徐剛標(biāo)等[15]以銀杏的子葉、幼葉片和莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)子葉的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，葉片次之，莖段最低。該結(jié)果與本試驗(yàn)的研究結(jié)果不一致?？梢?jiàn)，不同植物體內(nèi)的內(nèi)源激素分布情況也不一樣。

最適合厚樸愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為B5+ 2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA；最佳繼代培養(yǎng)基為B5+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA?？梢?jiàn)適合誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基并不一定會(huì)適合愈傷組織的繼代培養(yǎng)。這一結(jié)果與張志強(qiáng)等[16]研究一致。張志強(qiáng)[16]等發(fā)現(xiàn)，將誘導(dǎo)出的海巴戟天愈傷組織放入最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，愈傷組織生長(zhǎng)極差甚至褐化死亡；而放入增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，愈傷組織增殖效果明顯。在愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2,4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)作用較NAA強(qiáng)，啟動(dòng)時(shí)間短，且誘導(dǎo)率更多，但不適合愈傷組織的增殖培養(yǎng)，愈傷組織結(jié)構(gòu)松散且容易發(fā)生褐化死亡。此外，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)剛誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織大部分質(zhì)地較硬，細(xì)胞間聯(lián)系緊密，需對(duì)其進(jìn)行3～4次的繼代、篩選后才能用于液體培養(yǎng)。本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化厚樸愈傷組織誘導(dǎo)體系，初步篩選出了最適合用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織的培養(yǎng)條件，以期為今后培養(yǎng)厚樸細(xì)胞研究提供參考。

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（本文編輯 楊 瑛）

Study on the Preparation of Callus of Magnolia officinalis Using on Cell Suspension Culture

XIE Yanyan1,WEI Mei2,XIE Dejin1,CHEN Jiancheng1,YANG Deming1,RONG Jundong1, CHEN Liguang1,ZHENG Yushan1,2*

(1.College of Forestry,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China；2.College of Landscape Architecture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China.)

Objective To study the callus of Magnolia officinalis suitable for cell suspension culture.Methods Callus induction and subculture study were carried out through the selection of basic mediums（B5,MS and 1/2MS）,explants（stems, phyllophores and leaves）and concentrations of hormone.Results The best basic medium for callus induction of Magnolia biloba was B5.Phyllophor is the best explant for callus induction of magnolia biloba.The best medium for callus induction of magnolia biloba was B5+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA.The best subculture medium for callus of Magnolia officinalis was B5+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA,callus growth rate reached 2.87 times.Conclusion The callus of Magnolia officinalis suitable for cell suspension culture has been preliminary screened,which laying the foundation for cell suspension culture of Magnolia officinalis.

Magnolia officinalis;callus;suspension culture

R282.2

B

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.04.005

2016-09-10

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI01B06）資助；福建省科技創(chuàng)新平臺(tái)(2008Y2001)資助。

謝燕燕，女，在讀碩士研究生，研究方向：從事藥用植物栽培與利用森林培育方面研究。

*鄭郁善，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zys1960@163.com。