電針內關穴預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠線粒體膜電位、腺苷A1受體的影響

宋 瑾,王 超*,陽仁達,馮 果,譚成富,劉薇薇,嚴 潔（湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208）

電針內關穴預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠線粒體膜電位、腺苷A1受體的影響

宋 瑾,王 超*,陽仁達,馮 果,譚成富,劉薇薇,嚴 潔
（湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208）

目的 觀察電針內關預處理對心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI）大鼠心肌線粒體膜電位、腺苷A1受體的影響，探討電針預處理防治MIRI的可能作用機制。方法 40只SD雄性大鼠隨機分為假手術、缺血再灌注組（模型組）、電針內關穴組、電針環(huán)跳穴組，每組10只。采用冠脈結扎法造模，電針內關組和電針環(huán)跳穴組在造模前，給予電針刺激 20 min/d，共7 d。采用熒光技術測定心肌細胞線粒體膜電位變化，免疫組化法測腺苷A1受體的表達。結果模型組線粒體膜電位及腺苷A1受體較假手術組明顯下降（P＜0.01）；電針內關穴組線粒體膜電位較模型組、電針環(huán)跳穴組及假手術組明顯升高（P＜0.05）；電針內關組腺苷A1受體較模型組、電針環(huán)跳穴組和假手術組明顯升高（P＜0.01）；模型組與電針環(huán)跳組間無明顯差異（P＞0.05）。結論 電針內關穴預處理可以誘導腺苷A1受體的表達，升高線粒體膜電位，對心肌細胞產生保護作用。

心肌缺血再灌注損傷；電針；內關穴；線粒體膜電位；腺苷A1受體

心肌缺血再灌注損傷 （myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI）是指較長時間心肌缺血的基礎上，恢復血流灌注，即復灌后缺血和組織損傷并不減輕，反而加重甚至發(fā)生不可逆性損傷的現象。中醫(yī)針灸作為一種傳統(tǒng)的治療方法，也是治療冠心病的手段之一。本課題組大量的實驗及臨床研究證明電針內關穴對心肌缺血有明顯的改善作用[1-5]。腺苷是一種重要的神經調質主要分布于神經系統(tǒng)中，主要有四種亞型（A1，A2，A3，A4），對保護組織發(fā)揮重要的作用，腺苷的神經調節(jié)作用主要是通過腺苷A1受體實現的[6]。線粒體是真核生物細胞中非常重要的細胞器，線粒體介導的凋亡過程是重要的細胞凋亡途徑之一。本試驗以心肌缺血再灌注大鼠為模型，分析電針內關穴預處理對大鼠MIRI后腺苷A1受體和線粒體膜電位的作用，為經脈臟腑相關理論及針刺“治未病”，“胸脅內關謀”理論在臨床的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取SPF級雄性SD大鼠，250～300 g，共40只，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(SYXK湘2013-0005，SCXK湘2013-0004)。隨機分為4組，假手術組、缺血再灌注組、針刺內關穴組、針刺環(huán)跳穴組，每組10只。

1.2 主要試劑與設備

細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；免疫組化檢測腺苷A1受體試劑盒:腺苷A1受體抗體規(guī)格1mL (美國Santacruz公司)，圖像分析軟件為IPP（Image-Pro-Plus），顯微鏡（MOTIC BA210T）；華佗牌SDZ-Ⅴ型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司）；漢醫(yī)牌一次性使用無菌針灸針（0.25 mm×13 mm，100支/盒）（長春愛泉醫(yī)療器械有限公司）；H1850醫(yī)用離心機臺式高速離心機 （湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；ECG-1106G數字式心電圖機（深圳市凱沃爾電子有限公司）；ALCV108動物呼吸肌 （上海奧爾科特生物科技有限公司）；BDLSRⅡ型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3 造模方法

造模參照汪謙[7]的方法。大鼠以10%水合氯醛麻醉0.3 mL/100 g腹腔注射。行氣管插管后，接動物人工呼吸機，（頻率70～80次/min，潮氣量5～6 mL/ 100 g），然后沿左側第四、五肋骨間開胸，輕輕剪破心包膜，提起左心耳，在冠狀動脈左前降支1/3處穿4“0”號線，置一硅膠管結扎，以心電圖T波高尖及冠脈左前降支結扎下段血管膨出或供血心肌發(fā)紺為造模成功標志，結扎40 min后，剪開/取下硅膠管恢復左前降支灌流60 min，腹主動脈取血 3～5 mL，摘取心臟。

1.4 穴位定位及處理方法

1.4.1 穴位定位 “內關”“環(huán)跳”、穴定位參照林文注、王佩主編《實驗針灸學》并結合解剖學定位。內關：前肢內側、離腕關節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間。環(huán)跳穴位于股骨大轉子后上緣凹陷處。

1.4.2 處理方法 參照汪謙[7]，假手術組和缺血再灌注組飼養(yǎng)至第7天，其中假手術組開胸，左冠狀動脈前降支上、中1/3交界處穿線不結扎，40 min后，再灌注60 min，記錄心電圖，缺血再灌注組左冠狀動脈前降支上、中1/3交界處穿線結扎，結扎40 min后，再灌注60 min，記錄心電圖。電針內關穴組和電針環(huán)跳穴組在進行MIRI造模之前7 d，每天給予電針刺激，分別針刺雙側“內關”和“環(huán)跳”連接SDZ-V型電子針療儀 （10 Hz，疏密波），時間20 min，1次/d，共針刺7次后再行造模。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 JC-1染色法測線粒體膜電位 取500 μl JC-1工作液將細胞均勻懸浮，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15～20 min；室溫離心（200 rpm/min，5 min）收集心肌細胞，用500 μL JC-1×染色結合液洗2次；吸取500 μL JC-1×染色結合液重新懸浮細胞，用流式細胞儀進行流式檢測。

1.5.2 免疫組化法檢測心肌組織腺苷A1受體含量 將取材的心肌組織切成2～3 mm厚的小塊后用0.9%氯化納溶液洗凈,濾紙吸凈后迅速浸入4%多聚甲醛中固定,溫度4℃。60℃烤片30～60 min，先將切片置于二甲苯中10 min，2次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇，每級放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min，將切片浸入0.01 M 枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5～10 min后，反復1～2次。冷卻后0.01 M PBS （pH 7.2～7.6）洗滌3 min×3次；PBS沖洗3 min×3次；滴加適當稀釋的一抗 （腺苷A1受體），4℃過夜。PBS沖洗5 min×3次；滴加50～100 μL抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加預制好的顯色劑DAB工作液50～100 μL，室溫孵育1～5 min，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌；蘇木素復染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍；各級酒精（60%～100%）脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

1.6 數據統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 電針內關穴對大鼠心電圖T波的影響

各組大鼠術前T波比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明各組大鼠術前齊同可比。造模后各時段其余三組與假手術組比較差異非常顯著 （P＜0.01或P＜0.05），表明造模成功。結扎后40 min與再灌注后60 min：與缺血再灌注組比較，電針內關穴組T波均明顯下降（P＜0.01），而電針環(huán)跳穴組與缺血再灌注組之間無明顯差異（P＞0.05），與電針內關穴組比較，電針環(huán)跳穴組T波均明顯升高 （P＜0.01）。以上結果提示：電針內關穴預處理能改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心電圖T波。見表1。

表1 各組大鼠結扎后T波電壓的比較 （mv，n=10，±s）

表1 各組大鼠結扎后T波電壓的比較 （mv，n=10，±s）

注：與假手術組比較◆P＜0.01，◆◆P＜0.05；與缺血再灌注組比較△P＜0.01；與電針內關穴組比較*P＜0.01。

?

2.2 電針內關穴對MIRI大鼠腺苷A1受體的影響

腺苷A1受體陽性染色信號為黃色或棕黃色 （深的可至褐色）染色 ,定位于細胞漿內。計算平均 IOD值，即視野下的陽性表達部位的累積光密度和視野下樣品面積的比值，得出陽性染色強度。實驗主要采用平均IOD值作為腺苷A1受體組織化學染色陽性的參數。發(fā)現缺血再灌注組平均IOD較假手術組明顯下降（P＜0.01），電針內關穴組平均IOD較缺血再灌注組明顯升高（P＜0.01），與電針環(huán)跳穴組相比電針內關穴組平均IOD明顯升高（P＜0.01）,而電針環(huán)跳電針穴組與缺血再灌注組間無明顯差異（P＞0.05）,環(huán)跳穴組與假手術組間無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

2.3 電針內關對MIRI大鼠線粒體膜電位的影響比較

當線粒體膜電位較高時JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，可以產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，形成單體，產生綠色熒光，用流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況，綠色熒光通過FITC通道通常為FL1來檢測，紅色熒光通過PI通道通常為FL2來檢測。正常細胞{FL-1亮，FL-2亮；R1}，凋亡細胞{FL-1亮，FL-2暗；R2}，流失檢驗結果如圖1，R1（右上限）代表正常細胞，R2（右下限）代表凋亡細胞。流式細胞儀檢測到的顯綠色熒光的細胞數（凋亡細胞）可間接反映細胞線粒體膜電位的大小，凋亡細胞值越大，線粒體膜電位就越低。如表3所示缺血再灌注組凋亡細胞較假手術組有所升高（P＜0.01），則線粒體膜電位就越低；電針內關穴組凋亡細胞較缺血再灌注組和電針環(huán)跳穴組明顯下降（P＜0.05），則線粒體膜電位越高;而電針環(huán)跳穴組與缺血再灌注組間無明顯差異（P＞0.05）。以上結果提示電針內關穴預處理可以使MIRI大鼠線粒體膜電位升高。

表2 各組大鼠腺苷A1受體的平均IOD比較結果 （n=10，±s）

表2 各組大鼠腺苷A1受體的平均IOD比較結果 （n=10，±s）

注：與假手術組相比，◆P＜0.01；與缺血再灌注組相比，△P＜0.01；與電針環(huán)跳穴組相比，▼P＜0.01。

?

表3 各組大鼠心肌凋亡細胞（線粒體膜電位）的比較 （n=10，±s）

表3 各組大鼠心肌凋亡細胞（線粒體膜電位）的比較 （n=10，±s）

注：與假手術組相比，◆P＜0.05,◆◆P＜0.01；與缺血再灌注組相比，△P＜0.05；與電針環(huán)跳穴組相比，▼P＜0.05。

?

圖1 各組流式檢驗凋亡細胞結果

3 討論

冠狀動脈左前降支是左心供血最主要的血管，通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支造心肌缺血再灌注模型是觀察心肌保護最常用的模型。心肌缺血再灌注損傷是指在心肌血供中斷一定時間后恢復血供，原缺血心肌發(fā)生較血供恢復前更為嚴重的損傷，表現為閉塞的冠狀動脈再通、梗死區(qū)血液灌流重建后一段時間內，出現血壓驟降、心功能不全、心律失常甚至卒死等現象[8]。針灸預處理，是指預先采用針灸的方法對機體的某些腧穴進行刺激，增強機體的抗病與應變能力，并產生阻抑或減輕隨后疾病損傷的方法，研究表明針灸預處理能啟動機體的內源性保護機制，調動各種自我反饋和調節(jié)機制以維持內環(huán)境穩(wěn)定，進而產生防病減病的保護作用。

腺苷是人體組織內產生的一種內源性核苷，是一種抗炎物質，對心臟功能有多方面的作用。腺苷A1受體與腺苷的親和力最高，主要分布于心肌細胞內，通過調節(jié)增加細胞內K+和降低慢通道Ca2+內流量而抑制竇房結自律性和降低房室結傳導性[9]。有研究表明，腺苷A1受體激動劑（CCPA）通過與細胞膜上的A1受體結合，激活PKC，導致KATP通道開放，穩(wěn)定線粒體膜電位和減少ROS生成，從而抑制mPTP開放，保護心肌細胞[10]。本實驗中缺血再灌注組平均IOD較假手術組明顯下降（P＜0.01）,說明缺血再灌注損傷會抑制腺苷A1受體的表達；電針內關組平均IOD較缺血再灌注組明顯升高 （P＜0.01），與電針環(huán)跳組相比電針內關組平均IOD明顯升高（P＜0.01），電針內關組腺苷A1受體陽性率表達明顯高于模型組和電針環(huán)跳穴組。以上結果說明電針內關穴預處理可以激活心肌細胞腺苷A1受體的表達，與環(huán)跳穴相比，內關穴對保護心肌細胞具有特異性作用。

線粒體是介導細胞凋亡的重要細胞器，線粒體膜電位是維持線粒體功能和結構的根本，它的改變將會造成線粒體膜發(fā)生一系列的功能和狀態(tài)的變化。線粒體膜電位的喪失是心肌細胞凋亡早期的一個顯著的特征。針灸可以調節(jié)線粒體能量代謝，介導線粒體的功能而抑制細胞凋亡，維持細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)，以及發(fā)揮對線粒體DNA的影響等方面的作用[11]。本研究結果顯示，與假手術組比，缺血再灌注組出現大量凋亡細胞，且差異具有統(tǒng)計學意義，說明缺血再灌注損傷會導致線粒體膜電位下降，破壞線粒體膜的完整性；同時與缺血再灌注組比，電針內關組凋亡細胞數明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義。結果說明電針內關穴預處理可以提高心肌細胞線粒體膜電位，減少心肌細胞凋亡，從而保護心??；與電針環(huán)跳組相比，電針內關穴組心肌細胞凋亡數明顯減少，差異具有統(tǒng)計意義，說明內關穴作為手厥陰心包經之絡穴，對保護心肌具有特異性作用。

以上結果說明電針內關穴預處理可以誘導MIRI大鼠腺苷A1受體的表達，減少心肌細胞線粒體膜電位下降，其可能作用機制是針灸內關預處理通過誘導腺苷A1受體的表達，從而穩(wěn)定線粒體膜電位，保護心肌細胞線粒體膜的完整，抑制心肌細胞凋亡，減輕心肌細胞損傷程度，從而對心肌缺血再灌注起到保護作用，同時也進一步說明了內關治療胸脅部疾病的特異性，內關穴為手厥陰心包經之絡穴，又為八脈交會穴之一，通于陰維脈，手厥陰心包經起于胸中，出屬心包絡，向下通過橫膈，從胸至腹依次聯絡上、中、下三焦，為經脈臟腑相關理論及針灸“治未病”，“胸脅內關謀”理論在臨床的應用提供依據，從而更好的指導我們臨床上應用電針內關治療心血管疾病。

[1]陽晶晶,嚴 潔,王 超,等.針灸內關預處理對心肌缺血再灌注損傷兔血清NO、NOS及腺苷含量的影響[J].中國中醫(yī)急癥,2014,23 （7）:1209-1211，1227.

[2]嚴 潔,田岳鳳,劉健華,等.電針內關穴對心肌缺血再灌注損傷中心肌組織一氧化氮及一氧化氮合酶的影響(英文)[J].中國臨床康復,2004,8（36）:8400-8401.

[3]楊孝芳,王 超,易受鄉(xiāng),等.電針內關穴對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌鈣泵活性及其基因表達的影響[J].世界中西醫(yī)結合雜志, 2007，2（3）:137-140.

[4]楊孝芳,王 超,易受鄉(xiāng),等.電針內關對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞內鈣離子濃度的調節(jié)[J].中國組織工程研究與臨床康復, 2007，11（34）:6759-6761.

[5]沈 菁,王 超,張佳麗,等.電針內關穴對心肌缺血再灌注損傷家兔SOD與線粒體膜電位的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報,2015,35 (7):47-49,53.

[6]夏洪蓮,陳 猛,蘆相玉,等.腺苷A1受體拮抗劑對異丙酚誘導腦缺血再灌注損傷大鼠細胞凋亡的影響[J].中國臨床藥理學與治療學,2015,20（7）:727-731.

[7]汪 謙.現代醫(yī)學實驗方法[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1997:106.

[8]周建美.腺苷A_1受體激動劑預處理延遲相心肌保護作用的蛋白質組學研究[D].長沙：中南大學,2007.

[9]王 韻,曹 旭,高山紅,等.腺苷對家兔心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國醫(yī)科大學學報,2006,35(6):568-570.

[10]向 飛.腺苷A1受體對缺氧心肌細胞線粒體通透性轉換孔開放的影響及調控機制[D].重慶：第三軍醫(yī)大學,2007.

[11]熊 萍.針灸治療線粒體功能異常引起阿爾茨海默病的實驗研究進展[J].湖北中醫(yī)藥大學學報,2014,16(1):106-109.

（本文編輯 匡靜之）

Effects of Electroacupuncture at Neiguan Point on Mitochondrion Membrane Potential and Adenosine A1 Receptor in Rats with Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury

SONG Jin,WANG Chao*,YANG Renda,FENG Guo,TAN Chengfu,LIU Weiwei,YAN Jie
(College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To explore the cardioprotective mechanisms of electroacupuncture (EA)at Neiguan point and observe the effect of mitochondrial membrane potential and adenosine A1 receptors in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods The 40 SD male rats were randomly divided into the sham-operation group,ischemia reperfusion (model group),EA Neiguan group and EA Huantiao group,10 rats in each group.The models were established by ligating the coronary artery.The EA Neiguan group and EA Huantiao group were given electroacupuncture stimulation pretreatment 20 min every day lasting for 7 days before establishing MIRI model respectively.The mitochondrial membrane potential was tested by fluorescent technique.The expression of adenosine A1 receptor was determined by Immunohistochemical method.Results The mitochondrial membrane potential and adenosine A1 receptor contents of model group decreased significantly than those of control sham-operation group with obviously statistical difference (P＜0.01).The mitochondrial membrane potential of EA Neiguan group increased than those of model group,control sham-operation group and EA Huantiao group (P＜0.05).The adenosine A1 receptor increased significantly than model group,EA Huantiao group and control sham-operation group (P＜0.01).But there was no significandy difference between model group and EA Huantiao group(P＞0.05).Conclusion The EA at Neiguan point preconditioning could induce the expression of adenosine A1 receptor,increase mitochondrial membrane potential,and have a protection on myocardial cells.

MIRI;eletroacupuncture;Neiguan point;mitochondrial membrane potential;adenosine A1 receptor

R245.9

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.04.016

2016-09-11

國家自然科學基金項目（81574080）；湖南省中醫(yī)藥管理局課題（2015211）；湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金項目(15k093)；2015年針灸推拿學湖南省“十二五”重點學科開放基金資助項目（06）。

宋 瑾，女，在讀碩士研究生，研究方向：經脈-臟腑相關規(guī)律與機制研究。

*王 超,女,醫(yī)學碩士，副教授,碩士研究生導師，E-mail：592436380@qq.com。

本文引用：宋 瑾,王 超,陽仁達,馮 果,譚成富,劉薇薇,嚴 潔.電針內關穴預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠線粒體膜電位、腺苷A1受體的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（4）：402-405.