甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體的制備工藝研究

周 容，周莉莉，鐘思雨，袁 禮，周 瑋，李 朝，夏新華*（湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體的制備工藝研究

周 容，周莉莉，鐘思雨，袁 禮，周 瑋，李 朝，夏新華*
（湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 制備甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體。方法 采用化學(xué)合成甘珀酸十八醇酯(18-GA-Suc)作為兩親性導(dǎo)向分子，從穩(wěn)定性、包封率等方面考察制備甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體的最佳方法，單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)選甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體的處方和工藝。結(jié)果 根據(jù)優(yōu)化工藝制備的甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體外觀為乳白色，帶有淡藍(lán)色乳光，無(wú)絮凝現(xiàn)象，包封率為41.75%。結(jié)論 甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體制備成功,并以包封率為指標(biāo)對(duì)其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，可為其肝靶向研究奠定基礎(chǔ)，有望成為肝腫瘤靶向的新型載體。

甘草次酸；黃芩苷；脂質(zhì)體

黃芩苷是從唇形科植物黃芩中分離的一種黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[1]。黃芩苷及其制劑存在口服吸收差、生物利用度低、水溶性及脂溶性差、體內(nèi)半衰期短等不足，限制了黃芩苷類(lèi)制劑在臨床上的應(yīng)用。

脂質(zhì)體近年來(lái)廣泛用作抗癌藥物的載體，能提高藥物的生物利用度，降低藥物毒性，靶向釋藥。已有研究證實(shí)，肝細(xì)胞膜上存在大量的甘草次酸（GA）特異性結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)能與GA特異性結(jié)合，通過(guò)肝細(xì)胞內(nèi)吞作用，可將其配體運(yùn)送至溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解[2]。以該受體為靶點(diǎn)，可將藥物特異性導(dǎo)入治療乙型肝炎和原發(fā)性肝癌。文獻(xiàn)表明，甘草次酸修飾的脂質(zhì)體具有更好的肝靶向性[3]。本研究以甘草次酸為原料，合成甘珀酸十八醇酯（18-GA-Suc）作為兩親性導(dǎo)向分子修飾黃芩苷脂質(zhì)體[4]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相系統(tǒng) (美國(guó)安捷倫公司)；色譜柱 Kromasil C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 （鞏義市予華有限公司）；TE-214S分析天平 (北京賽多利斯天平有限公)；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；Zetasizer 3000HSA型粒徑分析儀 （英國(guó)Malvern）；JEM-1200EX電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

1.2 藥品與試劑

黃芩苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%，批號(hào)110715-201318，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；大豆磷脂Lipoid S PC-3（德國(guó)Lipoid公司）；膽固醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；葡聚糖凝膠G-50（美國(guó)GE公司）；磷酸鹽緩沖劑（粉劑，0.01 M，pH 7.4，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；甘草次酸（新疆天山制藥有限公司）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、N,N-二環(huán)己基碳酰亞胺（DCC）（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；4-二甲氨基吡啶（DMAP）（上海展方化工有限公司）；石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯（成都市科龍化工試劑廠(chǎng)）；甲醇（色譜純，美國(guó)Spectrum公司）；無(wú)水乙醇、甲醇（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 導(dǎo)向分子18-GA-Suc的制備

2.1.1 甘草次酸十八醇酯（18-GA）的制備 取甘草次酸1.0 g溶于20 mL DMF中，加入DCC 0.44 g、硬脂醇0.75 g以及DMAP 0.26 g，80℃水浴加熱2 h至反應(yīng)完全，將反應(yīng)液緩緩滴入水中，產(chǎn)生沉淀，抽濾，得淡黃色固體，55℃干燥即得。對(duì)產(chǎn)物過(guò)柱純化并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)有 [M-1]-m/z=721的峰存在，即目標(biāo)產(chǎn)物18-GA的分子離子峰。

2.1.2 18-GA-Suc的制備 取18-GA 0.5 g，加10 mL吡啶溶解，加入DMAP 0.25 g、丁二酸酐0.5 g，116℃油浴下加熱反應(yīng)12 h，往反應(yīng)液中加少許水，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去吡啶，得褐色固體。對(duì)產(chǎn)物過(guò)柱純化并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，有[M-1]-m/z=821強(qiáng)峰存在，可以證明為目標(biāo)產(chǎn)物18-GA-Suc。

2.2 黃芩苷含量及包封率的測(cè)定

2.2.1 色譜條件[5]Kromasil C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm,5 μm），流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸水（47∶53），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫30℃。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 對(duì)照品溶液的配制：分別配置濃度為 0.003 04、0.006 08、0.015 2、0.030 4、0.045 6、0.060 8 mg/mL的系列對(duì)照品溶液，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程Y= 3×107X-12 189（r=0.999 5），結(jié)果表明黃芩苷在0.03 04～0.608 μg與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取5.598、11.196、55.98 μg/mL 3個(gè)高、中、低濃度的黃芩苷溶液，按“2.2.1”色譜條件測(cè)定，一日內(nèi)各進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d各濃度重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算日間精密度。結(jié)果表明，日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%。

2.2.4 洗脫曲線(xiàn)的繪制 精密吸取脂質(zhì)體樣品0.25 mL，加于Sephadex G-50凝膠柱頂部（直徑1.5 cm，柱床高25 cm），以純水洗脫，洗脫流速0.5 mL/min。每2 mL洗脫液為一管，收集洗脫液，分別用色譜甲醇破膜，超聲使其澄清后，HPLC進(jìn)樣分析，測(cè)定每管樣品中黃芩苷的含量。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線(xiàn)，脂質(zhì)體與藥物的洗脫峰有明顯的分界，可實(shí)現(xiàn)良好的分離,見(jiàn)圖1。

圖1 黃芩苷脂質(zhì)體葡聚糖凝膠G-50純水洗脫曲線(xiàn)

2.2.5 柱回收率 配制低、中、高三種不同濃度的黃芩苷甲醇溶液，分別加入空白脂質(zhì)體混合均勻，得標(biāo)準(zhǔn)混合液，精密吸取混合液0.5 mL上柱，按以上洗脫條件進(jìn)行分離，收集洗脫液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，HPLC進(jìn)樣分析，測(cè)定藥物的濃度，計(jì)算柱回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.6 上樣量 精密吸取黃芩苷脂質(zhì)體溶液，分別上柱1.0、0.5、0.25 mL，用純水以0.5 mL/min流速進(jìn)行洗脫，其他操作同上“洗脫方法”。以脂質(zhì)體與游離藥物的分離效果、包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，上樣量為0.25 mL時(shí)，脂質(zhì)體與游離藥物分離良好。

2.2.7 包封率的測(cè)定 精密吸取脂質(zhì)體樣品0.25 mL，加于Sephadex G-50凝膠柱頂部（直徑1.5 cm，柱床高25 cm），以純水洗脫，洗脫流速0.5 mL/min。每2 mL洗脫液為一管，收集脂質(zhì)體流出液，用色譜甲醇破膜，超聲使其澄清后，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，HPLC進(jìn)樣分析。計(jì)算包封率。

表1 黃芩苷溶液的柱回收率 （n=3）

表2 不同上樣量的比較

包封率=系統(tǒng)中包封的藥量/系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量×100%

2.3 脂質(zhì)體制備方法的研究

2.3.1 乙醇注入法 精密稱(chēng)取磷脂∶膽固醇（4∶1）、黃芩苷、10%的甘草次酸配體，按一定比例溶于無(wú)水乙醇中（45℃水浴加熱），所得的類(lèi)脂溶液用細(xì)孔徑注射器緩慢勻速地注入到恒溫55℃ pH 7.0的30 mL磷酸鹽緩沖液中，注入過(guò)程中用磁力攪拌器攪拌，通氮?dú)獬ヒ掖?，繼續(xù)攪拌30 min，45℃孵育20 min，冰浴超聲8 min，過(guò)0.45、0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3.2 薄膜分散法[6]精密稱(chēng)取磷脂、膽固醇、10%的甘草次酸配體，按一定比例，加三氯甲烷30 mL充分溶解，55℃減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，形成均勻脂質(zhì)膜，再按磷脂：黃芩苷（10∶1）取適量黃芩苷，溶于30 mL pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，加入脂質(zhì)膜中進(jìn)行洗膜，55℃水化1 h，超聲30 min，過(guò)0.45、0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3.3 兩種制備方法的比較 按“2.3.1”及“2.3.2”方法制備脂質(zhì)體，觀察外觀性狀、測(cè)定包封率、粒徑、Zeta電位，薄膜分散法粒徑較乙醇注入法小，且分布更均勻，包封率更高，且Zeta電位絕對(duì)值更大，因此確定用薄膜分散法制備黃芩苷脂質(zhì)體。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 兩種黃芩苷脂質(zhì)體制備方法的比較

2.4 處方及制備工藝單因素考察

2.4.1 溶劑的選擇 薄膜分散法中所用溶劑為三氯甲烷，但三氯甲烷毒性大，因此對(duì)比考察二氯甲烷、三氯甲烷作為有機(jī)溶劑對(duì)類(lèi)脂膜形成的影響。結(jié)果表明，二氯甲烷作為溶劑時(shí)所形成的脂質(zhì)膜有很多氣泡且不均勻，而三氯甲烷作為有機(jī)溶劑時(shí)所形成的類(lèi)脂膜薄而均勻，因此確定三氯甲烷作為有機(jī)溶劑。

2.4.2 水相的選擇 按“2.3.2”項(xiàng)下條件制備均勻脂質(zhì)膜，再按一定比例取適量黃芩苷，溶于三種水相中（pH 6.0、pH 6.8、pH 7.0的PBS緩沖液），其余操作同“2.3.2”項(xiàng)下。比較三種水相制得的脂質(zhì)體外觀，測(cè)定其包封率，結(jié)果見(jiàn)圖2。以pH 6.8的PBS緩沖液制備的脂質(zhì)體包封率最佳。

圖2 不同pH值的水相對(duì)包封率的影響

2.4.3 藥量 固定磷脂、膽固醇、黃芩苷、甘草次酸配體的比例，分別稱(chēng)取黃芩苷5、8、10、15、20 mg，其余操作同“2.3.2”項(xiàng)下，比較不同黃芩苷用量所制得的脂質(zhì)體的外觀，測(cè)定其包封率，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，黃芩苷用量為10 mg時(shí)，所制備的脂質(zhì)體包封率最好。

2.4.4 膽脂比 固定磷脂、黃芩苷、甘草次酸配體的比例，分別取膽脂比1∶10、1∶4、1∶2.5的膽固醇量，其余操作同“2.3.2”項(xiàng)，比較不同膽脂比所制得的脂質(zhì)體的外觀，測(cè)定其包封率，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，膽脂比為1∶4時(shí)，所制備的脂質(zhì)體包封率最好。

2.4.5 水化時(shí)間 按“2.2.2項(xiàng)”下條件制備脂質(zhì)體后，55℃分別水化30 min、1 h、2 h，其余操作同“2.2.2”項(xiàng)，考察不同水化時(shí)間對(duì)包封率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，當(dāng)水化時(shí)間為1 h，脂質(zhì)體包封率最佳。

圖3 不同藥量對(duì)包封率的影響

圖4 不同膽固醇量對(duì)包封率的影響

圖5 不同水化時(shí)間對(duì)包封率的影響

2.5 處方的正交優(yōu)選

在單因素考察的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選黃芩苷肝靶向脂質(zhì)體處方。固定18-GA-Suc的比例為混合類(lèi)脂的10%，選擇藥物與磷脂的質(zhì)量比（A）、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比（B）、水合時(shí)間（C）三個(gè)主要因素為變量，各因素分別設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選處方。用L9(34)正交表安排試驗(yàn)方案，所選因素水平見(jiàn)表4，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

從表6的結(jié)果可知，包封率的影響因素大小為A＞B＞C，最佳組合為A2B2C3，即藥物與磷脂的質(zhì)量比為1∶10，磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4∶1，水化時(shí)間90 min。按照以上優(yōu)選的條件制備3批脂質(zhì)體樣品，每批樣品測(cè)定3次，以驗(yàn)證處方的穩(wěn)定性，驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表7。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 正交試驗(yàn)方差分析表

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 （±s，n=3）

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 （±s，n=3）

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驗(yàn)證結(jié)果表明，按最佳處方制備的3批樣品總平均包封率為41.75%，RSD為1.94%。說(shuō)明基于正交設(shè)計(jì)優(yōu)化的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，工藝合理可行。

黃芩苷肝靶向脂質(zhì)體的制備工藝為：精密稱(chēng)取一定量的磷脂∶膽固醇 （4∶1）、10%的甘草次酸配體，加三氯甲烷30 mL充分溶解，55℃減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，形成均勻脂質(zhì)膜，再按磷脂∶黃芩苷（10∶1）取適量黃芩苷，溶于30 mL pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，加入脂質(zhì)膜中進(jìn)行洗膜，55℃水化90 min，超聲30 min，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得，產(chǎn)品冷藏保存。

3 討論

3.1 肝靶向材料的合成

甘草次酸與硬脂醇反應(yīng)生成18-GA-Suc的過(guò)程為成酯反應(yīng)，該反應(yīng)是可逆反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中需嚴(yán)格保持容器及溶劑無(wú)水。文獻(xiàn)報(bào)道的第一步反應(yīng)產(chǎn)物處理方法為旋蒸除去溶劑，但DMF沸點(diǎn)較高，一般旋蒸蒸發(fā)難以除去。根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物不溶于水而DMF與水互溶的特點(diǎn)，將反應(yīng)液倒入水中，再抽濾即可得到反應(yīng)產(chǎn)物。這樣可以簡(jiǎn)化反應(yīng)過(guò)程。第二步反應(yīng)中所用溶劑為吡啶，反應(yīng)結(jié)束要除去吡啶需較高溫度且所需時(shí)間較長(zhǎng)，故采用少許水與吡啶形成共沸物再減壓除去，可縮短旋蒸時(shí)間。

3.2 脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

脂質(zhì)體的包封率是脂質(zhì)體質(zhì)量控制的一個(gè)重要指標(biāo)，選擇合適的測(cè)定方法是脂質(zhì)體制備前的一項(xiàng)重要考察內(nèi)容。采用葡聚糖凝膠柱層析法測(cè)定包封率時(shí)，通常是收集未被脂質(zhì)體包封的游離藥物來(lái)進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，被包封的脂質(zhì)體在16～40 mL便可被洗脫出來(lái)，且肉眼可直觀判斷脂質(zhì)體的流出過(guò)程，因此最后確定收集包封的脂質(zhì)體部分來(lái)測(cè)定包封率，既節(jié)省測(cè)定所需時(shí)間，也更加簡(jiǎn)便節(jié)約。

本實(shí)驗(yàn)中所制備的修飾脂質(zhì)體包封率較低，其原因可能有:a脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差，藥物在過(guò)柱過(guò)程中發(fā)生了泄漏；b脂質(zhì)體粒徑較大，容易沉降聚集，導(dǎo)致在過(guò)柱時(shí)被截留在凝膠柱頂端。

3.3 脂質(zhì)體的制備

脂質(zhì)體的制備方法很多，不同藥物的理化性質(zhì)有差異，采用的制備方法也不同。脂質(zhì)體的內(nèi)水相可以包封水溶性藥物，外層的雙層膜可包封脂溶性藥物，首先應(yīng)對(duì)藥物的性質(zhì)有充分的了解。

脂質(zhì)體制備的關(guān)鍵在于磷脂的水化及藥物的包載，根據(jù)藥物包載的機(jī)制不同，通?？煞譃楸粍?dòng)載藥和主動(dòng)載藥兩類(lèi)。被動(dòng)載藥即先將藥物溶于水相或有機(jī)相中，然后采用注入法、分散法、蒸發(fā)法等制備方法得到含藥脂質(zhì)體。主動(dòng)載藥法是通過(guò)內(nèi)外水相的不同離子或化合物梯度進(jìn)行載藥。由于黃芩苷在水及有機(jī)溶劑中的溶解性均不好，因此不能直接采用被動(dòng)載藥法[7]，需通過(guò)磷酸鹽緩沖液增強(qiáng)黃芩苷在水溶液中的溶解性，使黃芩苷成為“水溶性”好的藥物，因此本試驗(yàn)選用薄膜分散法，制得的脂質(zhì)體粒徑分布均勻，且操作工藝簡(jiǎn)單。

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（本文編輯 蘇 維）

The Study on Preparation of Baicalin Liposomes Modified by Glycyrrhetinic Acid

ZHOU Rong,ZHOU Lili,ZHONG Siyu,YUAN Li,ZHOU Wei,LI Chao,XIA Xinhua*
(School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To prepare baicalin liposomes modified with glycyrrhetinic acid.Methods The carbenoxolone eighteen alcohol ester（18-GA-Suc）by chemical synthesis method was as amphiphilic guidance molecule.The optimal method was investigated from its stability,encapsulation efficiency.The single factor and orthogonal test was used to optimize the prescription and process.Results According to the optimized process,the appearance of the baicalin liposomes modified by the glycyrrhetinic acid was milky white,with pale blue light and no flocculation,and the encapsulation efficiency was for 41.75%.Conclusion The preparation technology of baicalin was successfully prepared,and the process was optimized by the index of encapsulation efficiency,which could provide the basis for liver targeted research.

glycyrrhetinic acid;baicalin;liposomes

R283

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.04.007

2016-07-30

湖南省“十二五”中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（湘教通[2011]76號(hào)）;2016年湖南省創(chuàng)新課題（CX2016B346）。

周 容，女，在讀碩士研究生，研究方向:中藥新制劑及制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

*夏新華，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：xiaxinhua001@163.com。

本文引用：周 容，周莉莉，鐘思雨，袁 禮，周 瑋，李 朝，夏新華.甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體的制備工藝研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（4）：373-377.