小麥-近緣物種染色體系耐鹽性鑒定及分子標(biāo)記篩選

韓 冉，宮文萍，宋健民，李豪圣，李根英，劉愛峰，曹新有，程敦公，趙振東，劉 成，劉建軍

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/小麥玉米國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100)

小麥-近緣物種染色體系耐鹽性鑒定及分子標(biāo)記篩選

韓 冉，宮文萍，宋健民，李豪圣，李根英，劉愛峰，曹新有，程敦公，趙振東，劉 成，劉建軍

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/小麥玉米國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100)

為挖掘小麥-近緣物種耐鹽種質(zhì)，對215份小麥-近緣物種染色體系進(jìn)行了耐鹽性篩選與鑒定。結(jié)果表明，小麥-高大山羊草6Sl附加系和小麥-纖毛披堿草1Yc附加系的萌發(fā)期耐鹽性顯著優(yōu)于普通小麥中國春(CS)，但僅后者的幼苗期耐鹽性顯著優(yōu)于CS，說明纖毛披堿草1Yc染色體上可能含有耐鹽基因。為了獲得1Yc染色體特異標(biāo)記，以小麥-纖毛披堿草1Yc附加系及CS為材料，篩選染色體第一同源群PLUG引物，結(jié)果顯示，TNAC1007、TNAC1028和TNAC1034為耐鹽小麥-纖毛披堿草1Yc附加系的特異引物，擴(kuò)增條帶大小分別為500 bp、700 bp和500 bp。利用上述3對引物對一套小麥-纖毛披堿草附加系進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述3個(gè)多態(tài)性PLUG片段為纖毛披堿草1Yc和1Sc染色體共有的分子標(biāo)記，可用于輔助篩選與鑒定小麥-纖毛披堿草1Yc或1Sc染色體重組體。

小麥；耐鹽性；近緣物種染色體系；分子標(biāo)記

我國有鹽堿化耕地約930萬hm2[1]，提高其生產(chǎn)水平對全國糧食增產(chǎn)具有十分重要意義[2-3]。

小麥近緣物種中含有豐富的耐鹽基因，是小麥育種的優(yōu)異基因源。沙融山羊草(Aegilopssharonensis)、二角山羊草(Ae.bicornis)、窄穎賴草(Leymusangustus)、披堿草(Elymusdahuricus)、彭提卡偃麥草(Thinopyrumponticum)、智利大麥(Hordeumchlense)等物種均具有較好的耐鹽性[4]。通過遠(yuǎn)緣雜交可將這些物種中的優(yōu)良基因?qū)肫胀ㄐ←淸5]。小麥-近緣物種染色體系(包括附加系、代換系和易位系等)是向小麥轉(zhuǎn)育近緣物種優(yōu)異基因的良好載體和中間橋梁[6-7]。鑒定清楚小麥-近緣物種染色體系的耐鹽性是定位耐鹽基因所在小麥近緣物種染色體(片段)的基礎(chǔ)。作物萌發(fā)期和苗期鑒定能有效反映其綜合耐鹽性[8]，利用該方法已篩選出了部分耐鹽小麥種質(zhì)[9-13]。本研究利用萌發(fā)期和幼苗期耐鹽性鑒定對引進(jìn)的215 份小麥-近緣物種染色體系進(jìn)行了耐鹽性鑒定，并對鑒定出耐鹽性較好的染色體系進(jìn)行了分子標(biāo)記開發(fā)，以期為篩選和鑒定耐鹽小麥-近緣物種染色體易位系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料總計(jì)224份，包括215份小麥-近緣物種染色體系和9份普通小麥。小麥-近緣物種染色體系來源見文獻(xiàn)[6-7]。普通小麥包括中國春(CS)、濟(jì)南17(JN17)、濟(jì)麥19(JM19)、濟(jì)麥20(JM20)、濟(jì)麥21(JM21)、濟(jì)麥22(JM22) 、濟(jì)麥23(JM23)、濟(jì)麥262(JM262)和濟(jì)麥229(JM229)。中國春由電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院楊足君教授提供，濟(jì)麥系列品種由本研究團(tuán)隊(duì)育成。

1.2 萌發(fā)期耐鹽小麥鑒定

大多研究均以1.5%～2.0%的NaCl溶液對小麥萌發(fā)期耐鹽性進(jìn)行鑒定[9,11-12]。本研究的預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用1.8%～2.0%的NaCl溶液處理中國小麥和小麥-近緣物種染色體系，其相對耐鹽指數(shù)差異不顯著，在2.2%的鹽濃度下可以對材料耐鹽性進(jìn)行有效鑒定(結(jié)果未給出)。因此，本研究用2.2%的NaCl溶液處理215份小麥-近緣物種染色體系和普通小麥中國春。試驗(yàn)設(shè)1個(gè)對照組(無鹽脅迫)和1個(gè)處理組(2.2% NaCl脅迫)，重復(fù)3次。每個(gè)重復(fù)均挑選 50 粒飽滿無損傷的種子用0.1% HgCl2消毒10 min，滅菌水沖洗2次后置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中。對照組每個(gè)培養(yǎng)皿加入10 mL滅菌去離子水，處理組每個(gè)培養(yǎng)皿中加入10 mL滅菌去離子水配置的2.2% NaCl溶液。置于溫度25 ℃的恒溫箱中，在光、暗時(shí)間各12 h下培養(yǎng)7 d。相對鹽害指數(shù)為對照與鹽處理種子平均發(fā)芽率的差值占對照種子平均發(fā)芽率的百分比，相對鹽害指數(shù)越大，表示耐鹽性越小。

1.3 幼苗期耐鹽性鑒定

根據(jù)萌發(fā)期鑒定結(jié)果，選擇相對鹽害指數(shù)小于中國春的材料，參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行幼苗期耐鹽性鑒定，方法略作改動(dòng)。為了保證幼苗期種子的生長一致，先將種子在蒸餾水中吸漲催芽2 d，挑選發(fā)芽情況一致的15粒種子置于20目的篩網(wǎng)上。篩網(wǎng)四周粘有塑料泡沫，使篩網(wǎng)能懸浮在液體表面。將篩網(wǎng)放入與其配套的塑料盒中。在塑料盒中加入含鹽2.2%的Hoagland營養(yǎng)液，處理7 d；對照組中加入Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)條件為25 ℃，光、暗時(shí)間各 12 h。每個(gè)處理和對照均隨機(jī)選取9株測量芽長、根長。計(jì)算不同材料的相對生長量，相對芽長=處理芽長/對照芽長；相對根長=處理根長/對照根長。

1.4 PLUG-PCR分析與分子標(biāo)記建立

以萌發(fā)期和幼苗期耐鹽性均顯著優(yōu)于中國春的小麥-近緣物種染色體系和中國春為材料篩選PLUG (PCR-based landmark unique gene)引物。相比中國春，選擇能在小麥-近緣物種染色體系中擴(kuò)增出多態(tài)性的引物，并用于擴(kuò)增供試的濟(jì)麥系列品種和所涉及近緣物種的整套染色體系分析。反應(yīng)體系(20 μL)包含2.0 μL 10 × PCR buffer(Mg2+)、2.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTP、上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)、0.2 μL 5 U·μL-1Taq酶、50～100 ng基因組DNA，加ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物分別用TaqⅠ和HaeⅢ酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對供試材料萌發(fā)期耐鹽性的影響

鑒定結(jié)果顯示，中國春的相對鹽害指數(shù)為62%；供試材料中相對鹽害指數(shù)低于中國春的有11份，相對鹽害指數(shù)為39%～61% (表1)。在這11份材料中，僅中國春-高大山羊草6Sl#2(6B)代換系(TA6516)和中國春-纖毛披堿草1Yc附加系(TA7584)的相對鹽害指數(shù)與中國春差異顯著(P<0.05)，說明TA6516和TA7584芽期耐鹽性顯著高于中國春。

2.2 供試材料幼苗期的耐鹽性

幼苗期耐鹽性鑒定結(jié)果表明，在11份中國春-近緣物種染色體系中，僅中國春-纖毛披堿草1Yc附加系(TA7584)的相對根長顯著高于中國春(圖1)，而中國春-高大山羊草6Sl#2(6B)代換系(TA6516)、中國春-帝國黑麥5R附加系(TA3606)、中國春-卵穗山羊草1Ug#1附加系(TA7662)、中國春-卵穗山羊草3Mg#1附加系(TA7657)和中國春-希爾斯山羊草5Ss#1附加系(TA3584)的相對根長顯著或極顯著低于中國春。

表1 萌發(fā)期相對鹽害指數(shù)低于中國春的材料

Table 1 Materials with higher relative salt-tolerance than CS at germination stage

*P<0.05表示供試材料與中國春的差異顯著。

* indicates significant difference between tested materials and CS.

*和**分別表示供試材料與中國春在0.05和0.01水平上差異顯著。

* and ** indicate significant difference between tested materials and CS at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

圖1 中國春-近緣物種染色體系幼苗根和芽的相對長度

Fig.1 Relative length seedling root and shoot of salt tolerance of wheat-alien species chromosome lines under salt stress

相對芽長顯著高于中國春的有中國春-希爾斯山羊草6Ss#1(6D)代換系(TA6566)和中國春-卵穗山羊草1Ug#1附加系(TA7662)。中國春-帝國黑麥5R附加系(TA3606)的相對芽長顯著低于中國春。

2.3 耐鹽性分子標(biāo)記的篩選結(jié)果

利用染色體第一同源群的53對PLUG引物對中國春-纖毛披堿草1Yc附加系(其萌發(fā)期和幼苗期耐鹽性均顯著高于中國春)、中國春和濟(jì)麥系列品種進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，引物TNAC1007、TNAC1028和TNAC1034能在中國春-纖毛披堿草1Yc附加系中分別擴(kuò)增出(或PCR酶切出)分子量約為500 bp、700 bp和500 bp的多態(tài)性條帶，而中國春和濟(jì)麥系列品種均未擴(kuò)增出這些條帶(圖2)，說明這三個(gè)DNA片段是纖毛披堿草1Yc染色體特異片段，即可以作為分子標(biāo)記檢測小麥背景中的1Yc染色體。3個(gè)多態(tài)性標(biāo)記相關(guān)信息見表2。

圖2 引物TNAC1007(A)、TNAC1028(B)和TNAC1034(C)的擴(kuò)增結(jié)果

Table 2 PLUG markers specific for group 1 homoeologous chromosome ofE.ciliaris

標(biāo)記名稱Markername引物序列(5′?3′)Primersequence(5′?3′)所在小麥染色體位置Wheatchromosomallocation所在纖毛鵝冠草染色體位置LocationonE．ciliarischromosome所用限制性內(nèi)切酶Enzyme標(biāo)記長度Fragmentsize/bpTNAC1007?PLUGF：AGCTCGTGTGCTGAGAAGAAAR：GAAAGGTTGCCCTAGGATCTG1A1Yc1ScTaqI500TNAC1028?PLUGF：GTCGTATGTTGTCGTGGGATTR：TGCCAGTAGTTCTTTGCTTTCA1A1D1Yc1ScTaqI700TNAC1034?PLUGF：CGGTCGACCAACAAGTCAGTAR：TGCTAGTTATCGATCCAATGC1D1Yc1Sc-500

2.4 耐鹽性分子標(biāo)記的特異性

用TNAC1007、TNAC1028和TNAC1034分別對中國春-纖毛披堿草2Sc、3Sc、7Sc、5Yc和7Yc附加系(TA7705-TA7709)和中國春-纖毛披堿草1Sc附加系(TA7583)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，三對引物均能在中國春-纖毛披堿草1Sc附加系(TA7583)和中國春-纖毛披堿草1Yc附加系(TA7584)中擴(kuò)增出分子量大小一致的多態(tài)性帶，而其余供試材料擴(kuò)增不出對應(yīng)多態(tài)性帶(圖3)，說明上述3對引物所擴(kuò)增出的多態(tài)性帶不僅是纖毛披堿草1Yc染色體特異標(biāo)記，也是1Sc染色體特異標(biāo)記。

3 討 論

在小麥近緣物種耐鹽性鑒定方面，Colmer等[14]認(rèn)為，偃麥草(Thinopyrumspp.)和海濱大麥(H.marinum)的耐鹽性顯著好于栽培小麥。Gorham等[15]發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下小傘山羊草和頂芒山羊草的葉片鈉離子含量較其他物種低得多，因此具有更好的耐鹽性。馬小廷對中間偃麥草(Th.intermedia)、長穗偃麥草及兩者正反交F1代進(jìn)行耐鹽性鑒定，四者的耐鹽性：長穗偃麥草>反交種F1>正交種F1>中間偃麥草[16]。Mahmood和Quarrie[17]認(rèn)為，長穗偃麥草3E染色體和百薩偃麥草5J染色體具有降低小麥葉片鈉離子含量的作用。Forster等[18]研究表明，百薩偃麥草2J染色體具有降低小麥葉片鈉離子含量的作用。Omielan等[19]發(fā)現(xiàn)，長穗偃麥草3E染色體導(dǎo)入小麥后，其葉片鈉離子含量確實(shí)有所降低即增強(qiáng)了小麥的耐鹽性。本研究中，中國春-長穗偃麥草3E染色體附加系的相對鹽害指數(shù)與中國春沒有顯著差異(表1)，該結(jié)果和Omielan等[19]的研究結(jié)果并不沖突，因?yàn)樾←湻N子發(fā)芽是一個(gè)復(fù)雜過程，僅依據(jù)鈉離子含量一個(gè)性狀尚不足以說明長穗偃麥草3E染色體導(dǎo)入中國春后會(huì)顯著影響其相對鹽害情況。

箭頭所指為多態(tài)性條帶。 Arrows indicate polymorphic bands.

在小麥-近緣物種耐鹽種質(zhì)創(chuàng)制方面，Islam等[20]合成了小麥-海濱大麥(H.marinum)雙二倍體，但未見后續(xù)向小麥轉(zhuǎn)育其耐鹽性的報(bào)道。張 蕾等[2]鑒定了小麥-中間偃麥草(Th.intermedium)耐鹽種質(zhì)。Yuan和Tomita創(chuàng)制了耐鹽堿的小麥-彭提卡偃麥草(Th.ponticum)染色體易位系[5]。夏光敏將長穗偃麥草(E.elongata)的染色體小片段整合到普通小麥品種濟(jì)南177基因組中，獲得了一系列的細(xì)胞雜種漸滲系，并從中選育出耐鹽高產(chǎn)新品種山融3號(hào)[21]。截至目前，未見有關(guān)小麥-纖毛披堿草種質(zhì)的耐鹽報(bào)道。本研究對包括小麥-纖毛披堿草附加系在內(nèi)的215 份小麥-近緣物種染色體系進(jìn)行耐鹽性篩選和鑒定，結(jié)果表明，中國春-纖毛披堿草1Yc染色體附加系的萌發(fā)期和幼苗期耐鹽性均顯著高于對照材料中國春，說明在纖毛披堿草1Yc染色體上存在耐鹽基因，因此該材料值得通過染色體工程進(jìn)行開發(fā)利用。

在披堿草物種染色體分子標(biāo)記建立方面，魯玉柱[22]建立了披堿草(E.rectisetus)染色體RAPD標(biāo)記。Wang等[23]和Cainong等[24]先后建立了筑紫披堿草(Elymustsukushiensis)染色體RFLP和CAPS標(biāo)記。Okito等[25]建立了披堿草屬物種Y基因組的STS標(biāo)記。劉 成等[26]建立了披堿草屬物種St基因組SCAR標(biāo)記。宮文萍等[27]建立了粗穗披堿草1HtS染色體特異CAPS標(biāo)記。然而未見纖毛披堿草1Yc染色體分子標(biāo)記建立的報(bào)道。本研究建立了纖毛披堿草1Yc染色體PLUG分子標(biāo)記3個(gè)。由于RAPD標(biāo)記的可重復(fù)性差，RFLP標(biāo)記涉及放射性，CAPS和SCAR標(biāo)記建立的前提是需要預(yù)先對相應(yīng)序列進(jìn)行測定，而PLUG方法具有重復(fù)性好、不涉及放射性、不依賴序列測定和可用于分析不同物種染色體上的基因共線性(即將標(biāo)記定位于染色體相應(yīng)區(qū)段)等優(yōu)點(diǎn)，可以被廣泛地應(yīng)用于育種選擇。本研究建立的纖毛披堿草1Yc染色體PLUG分子標(biāo)記為后續(xù)篩選和鑒定耐鹽小麥-纖毛披堿草1Yc染色體易位系打下了基礎(chǔ)。

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Salt Tolerance Identification and Molecular Markers Screening of Wheat-Alien Species Chromosome Lines

HAN Ran,GONG Wenping,SONG Jianmin,LI Haosheng,LI Genying,LIU Aifeng,CAO Xinyou,CHENG Dungong,ZHAO Zhendong,LIU Cheng,LIU Jianjun

(Crop Research Institute,Shandong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Improvement in the North Yellow & Huai River Valley,Ministry of Agriculture/National Engineering Laboratory for Wheat & Maize,Jinan,Shandong 250100,China)

In order to explore salt tolerant wheat-alien species germplasm,a total of 215 wheat-alien species chromosome lines were screened and identified. The results showed that the salt tolerance at germination stage of wheat-Aegilopslongissima6Sladdition line and wheat-Elymusciliaris1Ycaddition line are significantly superior to wheat control. However,only the salt tolerance at seedling stage of the latter addition line is significantly superior to wheat control. Therefore,chromosome 1YcofE.ciliarismay possess salt tolerant gene. In order to develop molecular markers specific for chromosome 1Yc,PCR were performed on wheat-E.ciliaris1Ycaddition line and wheat controls by screening group 1 homoeologous chromosome with PLUG primers. The results showed that primers TNAC1007,TNAC1028 and TNAC1034 could generate polymorphic bands at about 500 bp,700 bp and 500 bp,respectively. Subsequently,the above three primer pairs were used to amplify a set of wheat-E.ciliarisadditions to locate the polymorphic bands. The result indicates that three polymorphic PLUG segments are not only located on chromosome 1Yc,but also on chromosome 1ScofE.ciliaris. Therefore,these markers can be used in screening and identifying wheat-E.ciliarischromosome recombinants with 1Ycor 1Scinvolved.

Wheat; Salt tolerance; Wheat-alien species chromosome line; Molecular marker

時(shí)間：2017-03-07

2016-09-08

2016-10-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201203)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-03-1-8)；山東農(nóng)科院青年拔尖人才計(jì)劃項(xiàng)目(1-18-024)；泰山學(xué)者種業(yè)計(jì)劃和山東省自主創(chuàng)新重大關(guān)鍵技術(shù)項(xiàng)目(1-5-12,2-5-68)

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劉 成(E-mail: lch6688407@163.com)；劉建軍(E-mail: ljjsaas@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)03-0301-06

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