IL-22經(jīng)Wnt/β-catenin通路抑制肝星狀細(xì)胞致纖維化作用①

石 城 雷榮娥 胡榜利 張沛玲 覃山羽 姜海行

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,南寧530021)

IL-22經(jīng)Wnt/β-catenin通路抑制肝星狀細(xì)胞致纖維化作用①

石 城 雷榮娥 胡榜利 張沛玲 覃山羽 姜海行

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,南寧530021)

目的：研究IL-22抑制HSC致肝纖維化的作用和機(jī)制，探索Wnt/β-catenin通路在肝星狀細(xì)胞(HSC)激活過程中的作用。方法：采用TGF-β1激活HSC，熒光定量PCR和Western blot檢測細(xì)胞激活過程中β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)變化情況。應(yīng)用不同濃度和不同時(shí)間的重組大鼠IL-22刺激大鼠HSC，CCK8法檢測細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。采用TGF-β1預(yù)處理HSC，再用最適濃度IL-22干預(yù)，對比干預(yù)前后HSC增殖情況，并檢測β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)變化情況。結(jié)果：TGF-β1激活HSC后，β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。IL-22以濃度依賴性和時(shí)間依賴性抑制HSC增殖(P<0.05)，并降低β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，但對HSC凋亡率無顯著影響(P>0.05)。IL-22可以顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC激活，并顯著降低β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論：Wnt/β-catenin參與了HSC激活和分泌α-SMA過程， IL-22以濃度依賴性和時(shí)間依賴性抑制HSC活性，這種作用可能是通過抑制Wnt/β-catenin通路實(shí)現(xiàn)的。

肝星狀細(xì)胞；白介素-22；Wnt/β-catenin通路

肝硬化是臨床常見重大疾病之一，目前仍未有較好的治療方法。肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和必經(jīng)途徑，肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)的激活在肝纖維化的發(fā)生中起中心環(huán)節(jié)作用[1]。多種免疫因素通過激活HSC，促使其大量表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和膠原蛋白，進(jìn)而形成膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

Wnt/β-catenin通路是機(jī)體調(diào)控器官發(fā)育，細(xì)胞增殖、遷移、分化、極化等過程中的重要通路之一，其中β-catenin是該通路的關(guān)鍵因子[2]。研究表明，異常激活的Wnt/β-catenin通路參與多種疾病發(fā)生過程，且Wnt/β-catenin通路的β-catenin在HSC激活過程中也發(fā)揮重要作用，抑制β-catenin表達(dá)可以降低HSC活性，減少膠原纖維的合成與分泌[3,4]。

IL-22是IL-10家族的成員，多種免疫細(xì)胞可以分泌IL-22。有研究表明IL-22通過抑制HSC活性減輕肝纖維化，用IL-22干預(yù)小鼠肝纖維化模型可以降低肝纖維化形成以及加速肝纖維降解[5]。然而IL-22抗肝纖維化的機(jī)制目前研究甚少。本研究將探索Wnt/β-catenin通路在IL-22抑制HSC的作用機(jī)制，為IL-22在抗肝纖維化的應(yīng)用提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6購自ATCC(American Type Culture Collection)公司并液氮保存使用；重組大鼠白介素-22(rrIL-22)、重組大鼠TGF-β1(rrTGF-β1)購買自R&D公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購買自寶生物工程(大連)有限公司；引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司設(shè)計(jì)合成；低溫高速離心機(jī)(Eppendrof公司)；流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD公司)；流式細(xì)胞儀FACS Calibur(BD公司)；蛋白裂解液RIPA和BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；PMSF蛋白酶抑制劑(Sigma公司)；單克隆β-catenin山羊抗兔一抗、單克隆α-SMA山羊抗兔一抗(Abcam公司)；GAPDH內(nèi)參抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)；0.45 μm PVDF膜(Merck Millipore公司)；熒光二抗(Li-COR公司)；Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)(Li-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 HSC用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，每2 d傳代一次。

1.2.2 CCK8法檢測細(xì)胞增殖率 HSC細(xì)胞懸液(1×105ml-1)接種至96孔板(100 μl/孔)，不同濃度或不同時(shí)間的IL-22處理，每孔加CCK8試劑10 μl，37℃避光孵育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值，細(xì)胞增殖率按公式計(jì)算：細(xì)胞增殖率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(未加藥)-A(空白)]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 HSC經(jīng)不同濃度IL-22處理后，使用不含EDTA胰酶消化收集細(xì)胞，4℃ 1 000 r/min離心5 min，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，1×Binding buffer重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106ml-1，取100 μl細(xì)胞懸液至Falcon流式管中，加5 μl FITC Annexin V和5 μl PI，室溫(25℃)避光孵育15 min后加400 μl 1×Binding buffer，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測，用CellQuest軟件分析1×105個(gè)細(xì)胞樣品。

1.2.4 q-PCR檢測mRNA表達(dá)水平 HSC經(jīng)不同濃度IL-22處理以及TGF-β1激活后IL-22處理，PBS洗滌細(xì)胞2次，按總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR-Green熒光定量試劑盒檢測目的基因mRNA表達(dá)水平，基因引物序列見表1。ABI公司StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測，采用兩步法PCR標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增程序：95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT計(jì)算目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 HSC經(jīng)不同濃度IL-22處理以及TGF-β1激活后再予IL-22處理，含EDTA胰酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，RIPA裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑按100∶1預(yù)混，25 cm2貼壁細(xì)胞加 300 μl 預(yù)混液冰上裂解15 min，4℃ 14 000 r/min離心 15 min 后取上清。BCA法測蛋白濃度，4份蛋白溶液與一份5×蛋白上樣緩沖液混勻后95℃ 10 min。等量蛋白(20 μg)上樣于10%SDS-PAGE膠中電泳90 min 分離，分離后的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫下(25℃)5%脫脂牛奶封閉1 h，4℃一抗孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次。室溫下(25℃)熒光二抗孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，熒光信號用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)檢測，蛋白灰度分析用Odyssey軟件進(jìn)行。

表1 目的基因引物序列

Tab.1 Primers for target gene

TargetgenesForwardReverseβ?catenin5′?CTTACGGCAATCAGGAAAGC?3′5′?GACAGACAGCACCTTCAGCA?3′α?SMA5′?CCGAGATCTCACCGACTACC?3′5′?TCCAGAGCGACATAGCACAG?3′GAPDH5′?ACAGCAACAGGGTGGTGGAC?3′5′?TTTGAGGGTGCAGCGAACTT?3′

2 結(jié)果

2.1 HSC激活過程中Wnt/β-catenin通路和α-SMA改變 分別使用0、2.5、5 ng/ml濃度的TGF-β1干預(yù)HSC 48 h，檢測干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)β-catenin和α-SMA的mRNA和蛋白水平變化，結(jié)果顯示β-catenin 和α-SMA的mRNA和蛋白水平均隨著TGF-β1濃度增加而升高，見圖1A、B，提示HSC激活過程中伴隨著Wnt/β-catenin通路激活和α-SMA表達(dá)改變。

圖1 TGF-β1促進(jìn)肝星狀細(xì)胞β-catenin和α-SMA表達(dá)Fig.1 TGF-β1 promotes HSC to secret β-catenin and α-SMANote：A.mRNA levels；B.Protein levels；There was a significant differences of mRNA and protein levels between the 5 ng/ml and 0 ng/ml of TGF-β1 group，*.P<0.05.

圖2 IL-22抑制肝星狀細(xì)胞增殖Fig.2 IL-22 inhibits proliferation of HSCNote：A.Concentration dependent manner；B.Time dependent manner；The cell proliferation rates was significantly decreased in 750 pg/ml and 1 000 pg/ml group compared with 0 pg/ml group，and also remarkably decreased in 48 h group compared with 12 h group after IL-22 intervention，*.P<0.05.

2.2 IL-22抑制HSC的增殖能力 分別使用0、250、500、750、1 000 pg/ml濃度IL-22干預(yù)HSC 48 h后，觀察細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示HSC增殖率隨著IL-22濃度增加呈下降趨勢，到750 pg/ml時(shí)的細(xì)胞增殖率顯著大于0 pg/ml(P<0.05)，見圖2A；再以1 000 pg/ml濃度IL-22分別干預(yù)HSC 12、24、36、48 h，觀察細(xì)胞的增殖和凋亡情況，結(jié)果顯示HSC增殖率隨IL-22濃度增加呈下降趨勢，在干預(yù)后48 h最顯著(P<0.05)，見圖2B。

HSC凋亡率隨著IL-22濃度增加呈升高趨勢，但各個(gè)濃度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3A；且IL-22干預(yù)的各時(shí)間段之間細(xì)胞凋亡率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3B。

2.3 IL-22抑制TGF-β1激活的HSC的增殖 以1 000 pg/ml 濃度IL-22 干預(yù)HSC 48 h后，與未干預(yù)的HSC相比，干預(yù)后HSC增殖率顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；采用5 ng/ml濃度的TGF-β1預(yù)處理HSC 24 h，再給予1 000 pg/ml濃度的IL-22干預(yù)HSC 48 h，結(jié)果顯示(見圖4)，TGF-β1干預(yù)HSC后細(xì)胞激活，細(xì)胞增殖率明顯升高； 激活后的HSC再予IL-22干預(yù)，細(xì)胞增殖受到抑制，與未進(jìn)行IL-22干預(yù)的HSC相比，干預(yù)后的HSC增殖率被顯著抑制(P<0.05)。

圖3 IL-22不影響肝星狀細(xì)胞凋亡Fig.3 IL-22 has no significant effect on apoptosis of HSCNote：A.Different concentration；B.Different time.

圖4 不同TGF-β1/IL-22組合干預(yù)HSC后細(xì)胞增殖率變化情況Fig.4 Cell proliferation rates of HSC treated with different combination of TGF-β1 and IL-22Note：IL-22 significantly inhibits proliferation of HSC in both TGF-β1 negative and positive group，*.P<0.05.

圖5 不同TGF-β1/IL-22組合干預(yù)HSC后β-catenin/α-SMA表達(dá)情況Fig.5 Expression levels of β-catenin,α-SMA mRNA and protein of HSC treated with different combination of TGF-β1 and IL-22Note：A.mRNA levels；B.protein levels；C.WB figure；IL-22 significantly inhibits the expression of β-catenin/α-SMA mRNA of HSC both in TGF-β1 negative and positive group,*.P<0.05.

2.4 IL-22抑制HSC和TGF-β1激活后HSC內(nèi)的β-catenin、α-SMA表達(dá)水平 以1 000 pg/ml濃度IL-22 干預(yù)HSC 48 h后，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用5 ng/ml濃度的TGF-β1預(yù)處理HSC 24 h，再給予1 000 pg/ml濃度的IL-22干預(yù)HSC 48 h，發(fā)現(xiàn)與未干預(yù)的HSC相比，干預(yù)后HSC的β-catenin、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。提示IL-22可以抑制HSC細(xì)胞活性，進(jìn)而抑制α-SMA的表達(dá)及Wnt/β-catenin信號通路的激活，并且對于TGF-β1激活后的HSC，IL-22同樣具有抑制細(xì)胞活性作用，見圖5。

3 討論

肝臟自身是一個(gè)巨大的免疫器官，肝組織內(nèi)有多種免疫細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與機(jī)體的多種生理、病理過程，且免疫因素在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用。IL-22是IL-10家族的成員，多種免疫細(xì)胞可以分泌IL-22。IL-22在促進(jìn)抗微生物免疫及組織修復(fù)過程中扮演重要角色，通過與細(xì)胞表面受體IL-10R2和IL-22R1結(jié)合，進(jìn)而激活胞漿內(nèi)的多條信號通路來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[6]。既往有研究表明，IL-22可以通過激活STAT3信號通路抑制HSC活性，降低HSC分泌細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而改善肝臟纖維化狀態(tài)，促進(jìn)肝纖維的好轉(zhuǎn)[7]。

Wnt/β-catenin通路屬于新興研究的細(xì)胞通路，近年來的研究也表明該通路亦參與到組織器官纖維化過程中，但其參與組織器官纖維化的機(jī)制并沒有被明確[8]。目前國內(nèi)外均有研究證實(shí)Wnt/β-catenin通路與HSC的活化、肝纖維化的形成存在著一定關(guān)系。有學(xué)者使用帶有商陸抗病毒蛋白的質(zhì)粒，通過尾靜脈注射對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，觀察到商陸抗病毒蛋白可以通過下調(diào)β-catenin表達(dá)來減輕肝纖維化的發(fā)生[9]。最近，研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p可以經(jīng)誘導(dǎo)激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)HSC激活，促進(jìn)膠原纖維和α-SMA的合成與分泌，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[10]。

TGF-β1是較強(qiáng)的HSC激活因子[11]，本研究中，我們使用TGF-β1刺激HSC，發(fā)現(xiàn)HSC激活過程中，β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)均隨著TGF-β1刺激增大而升高，表明HSC激活可以激活Wnt/β-catenin通路，并分泌大量的致纖維化因子。因此，通過抑制相關(guān)通路的激活可以抑制HSC活性，進(jìn)而減少肝纖維化的進(jìn)展。我們還發(fā)現(xiàn)，IL-22可以以濃度依賴性和時(shí)間依賴性抑制HSC增殖，并降低HSC表達(dá)α-SMA的水平；此外，IL-22還可以拮抗TGF-β1誘導(dǎo)HSC的激活，降低其活性，提示IL-22是一個(gè)較強(qiáng)的抗纖維化因子，深入研究其作用機(jī)制可為抗肝纖維化的研究提供新的思路。

在IL-22抑制HSC的作用機(jī)制方面，本研究發(fā)現(xiàn)IL-22可以降低β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并且抑制TGF-β1誘導(dǎo)HSC中β-catenin的表達(dá)，提示IL-22可能經(jīng)抑制Wnt/β-catenin通路來發(fā)揮抗纖維化作用。然而，本研究發(fā)現(xiàn)IL-22僅抑制HSC增殖，對其凋亡沒有顯著影響，我們推測這可能與Wnt/β-catenin通路的作用有關(guān)。有研究表明，細(xì)胞漿內(nèi)的β-catenin被IL-22抑制后，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(T cell factor/Lymphoid enhancer-binging factor,TCF/LEF)結(jié)合下降，而TCF/LEF可以調(diào)控細(xì)胞的增殖過程，對細(xì)胞的凋亡并無顯著影響[12]。

總之，本研究表明，Wnt/β-catenin參與了HSC激活和分泌α-SMA過程，而IL-22可以以濃度依賴性和時(shí)間依賴性抑制HSC活性，這種抑制作用是通過抑制Wnt/β-catenin通路實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果深化了IL-22抗肝纖維化作用的認(rèn)識，為今后研發(fā)新的抗肝纖維化藥物提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[收稿2016-08-30 修回2016-11-08]

(編輯 倪 鵬)

IL-22 inhibits liver fibrosis induced by hepatic stellate cells via Wnt/β-catenin signal pathway

SHICheng,LEIRong-E,HUBang-Li,ZHANGPei-Ling,QINShan-Yu,JIANGHai-Xing.

DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China

Objective:To investigate the effects and mechanisms of interleukin-22(IL-22) on inhibiting liver fibrosis induced by HSC,and explore the role of Wnt/β-catenin pathway in the activation of hepatic stellate cells(HSC).Methods：Rat HSC was activated by TGF-β1,and the mRNA and protein levels of β-catenin and α-SMA were detected by q-PCR and Western blot,respectively.HSC was treated with different hours and concentration of recombinant rat protein IL-22.The cell proliferation rates were detected by CCK8,cell apoptosis rates were tested by flow cytometry.HSC were treated with optimal concentration of IL-22 after activated by TGF-β1,the cell proliferation rates,mRNA and protein levels of β-catenin and α-SMA were compared of before and after intervention.Results：The mRNA and the protein levels of β-catenin and α-SMA were significantly increased after activated by TGF-β1(P<0.05).IL-22 inhibiting the proliferation of HSC in a dose-and time-dependent manner (P<0.05) and decreased the mRNA and the protein expression level of β-catenin and α-SMA(P<0.05),but had no significant effect on apoptosis rates(P>0.05).IL-22 significantly inhibited the activation of HSC induced by TGF-β1 and remarkably decreased the mRNA and the protein expression level of β-catenin and α-SMA(P<0.05).Conclusion：The Wnt/β-catenin pathway may participates in the process of HSC activation and α-SMA secretion,and IL-22 inhibits biological function of HSC in a dose- and time-dependent manner.This effect probably via inhibited the Wnt/β-catenin signal pathway.

Hepatic stellate cells;Interleukin-22;Wnt/β-catenin signal pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.005

①本文受國家自然基金(81260083)和廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(YCBZ2015025)資助。

石 城(1990年-)，男，碩士，主要從事肝纖維化免疫方面的研究。

及指導(dǎo)教師：姜海行(1963年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肝病臨床與基礎(chǔ)方面的研究， E-mail：gxjianghx@163.com。

R575.2

A

1000-484X(2017)04-0502-05