帶固相萃取功能索氏提取裝置提取紫蘇揮發(fā)性成分的方法分析

許 永，黃海濤，李 晶，劉 欣，王 晉，楊葉昆，孔維松

（云南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，昆明 650106）

紫蘇（Perilla frutescens）是唇形科一年生草本自花授粉植物，具有特異芳香［1］，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有重要的開發(fā)價值［2］。紫蘇具有抗氧化、抗癌、抗腫瘤、抗艾滋病等多種生理活性［3，4］。紫蘇揮發(fā)油是紫蘇葉的主要活性成分，含紫蘇醛、紫蘇酮等成分，已廣泛用于食品、皂用香精及化妝品加香，在煙草中加入紫蘇配方可改善煙草的吸味、增加煙草甜香，改善干、澀、苦口感，滿足消費者要求。紫蘇葉是制備芳香揮發(fā)油的主要器官部分［5］，近年來，紫蘇葉揮發(fā)性成分也已成為食品、醫(yī)療等領(lǐng)域研究的熱點之一。因此，研究紫蘇葉的揮發(fā)性成分具有重要意義。

紫蘇揮發(fā)物提取多采用水蒸氣蒸餾法［6-8］、同時蒸餾萃取法［9］、超臨界 CO2提取法［10，11］、固相微萃?。?2，13］、吹掃捕集［14］等方法，多數(shù)采用氣相色譜質(zhì)譜［7，14］對揮發(fā)物組成進行測定，有的也采用電子鼻［15］、全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜［16］等。水蒸氣蒸餾提取法和超臨界CO2提取法二者都存在樣品用量大、費時及提取成本高等缺點，同時蒸餾萃取可導致某些欠穩(wěn)定組分長期和熱水反應分解，造成小分子揮發(fā)物損失，結(jié)果重現(xiàn)性差。固相微萃取法和吹掃捕集無需溶劑與前處理，從樣品中直接采集揮發(fā)性成分，能更好地體現(xiàn)被檢測揮發(fā)物的真實組成［17］，但重現(xiàn)性較差。溶劑萃取法操作簡單、經(jīng)濟實用、提取效率高。對固體物質(zhì)的萃取通常采用冷浸法或熱浸法（索氏提取器），冷浸法是靠溶劑長時間的浸潤溶解從而將溶劑中的可溶物質(zhì)浸提出來；熱浸法是利用溶劑回流及虹吸原理，使固體物質(zhì)被純?nèi)軇┏掷m(xù)提取，但在提取過程中大量雜質(zhì)會隨揮發(fā)性成分一起溶出，影響分析結(jié)果，而且在提取過程中很難避免揮發(fā)性成分損失。

現(xiàn)有的方法均無法滿足紫蘇揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分準確分析和客觀評價的要求。本研究對樣品前處理方法進行改進，設(shè)計了如圖1所示的帶固相萃取功能的索氏提取裝置，該裝置于密閉環(huán)境進行加熱萃取，集萃取、凈化和濃縮為一體，中途不需要轉(zhuǎn)移樣品，大大簡化了樣品前處理操作，有效縮短了樣品前處理周期。該方法的建立為紫蘇揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分提供了快速、可靠的分析方法，為紫蘇葉精油質(zhì)量控制提供參考，并可對卷煙生產(chǎn)企業(yè)日常調(diào)香工作的開展起參考作用。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：紫蘇葉原料購自云南鴻翔一心堂藥業(yè)（集團）股份有限公司。

儀器：高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Agilent 6890-5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；ME414S型電子天平，德國Sarto?rius公司，感量0.000 1 g；自主研發(fā)的帶固相萃取功能的索氏提取裝置（圖1）。

試劑：二氯甲烷，色譜純，美國Dicma公司；柱色譜硅膠，200～300目，青島海洋化工廠；無水硫酸鈉，AR，天津化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

1）紫蘇葉樣品處理。將購買的紫蘇葉經(jīng)高速萬能粉碎機粉碎，過孔徑為450 μm的標準檢驗篩，得均勻粉末。

2）樣品提取。在固相萃取柱中加入10 g硅膠（200～300目），稱取20 g紫蘇葉樣品于樣品筒中，在樣品上方覆蓋一層無水硫酸鈉后，夾緊密封，將色譜進樣瓶與圓底燒瓶的螺紋接口密封連接，并在燒瓶中加入200 mL二氯甲烷溶劑，然后將燒瓶置于水浴鍋中，50℃加熱，冷凝回流3 h后，切換三通閥，使其與外界空氣導通，不斷揮發(fā)的溶劑通過三通閥流出并回收，達到濃縮的目的，當色譜進樣瓶中的樣品溶液蒸發(fā)至約1 mL后，旋下色譜進樣瓶即可進行GC-MS分析。

1.2.2 氣相色譜條件 DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣量 1.0 μL；柱流量 1.0 mL/min；分流比 10∶1；進樣口溫度 260℃；程序升溫條件：50℃保持 2 min再以 5℃/min升至 220℃，再以10℃/min升至250℃，保持10 min。

1.2.3 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源E1；離子化電離能70 eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度280℃；質(zhì)量掃描范圍 50～350 amu；WILEY、NIST 譜庫進行檢索。

2 結(jié)果與分析

2.1 帶固相萃取功能的索氏提取裝置設(shè)計及工作原理

樣品前處理裝置結(jié)構(gòu)見圖1。工作原理：啟動水浴鍋加熱，溶劑蒸發(fā)后經(jīng)密閉冷凝管冷凝回流到樣品筒中，溶劑先經(jīng)無水硫酸鈉層干燥，然后對樣品進行提取，提取液經(jīng)過硅膠柱凈化后回流至燒瓶中。經(jīng)過一段時間的回流提取后，調(diào)整三通閥與外界空氣導通，不斷揮發(fā)的溶劑通過三通閥流出并回收，此時燒瓶中的溶液不斷被濃縮，當濃縮至約1 mL時停止加熱，卸下色譜進樣瓶即可進行分析。

帶固相萃取功能的索氏提取裝置可在密閉條件下對樣品進行分離、提純、濃縮，無需多次轉(zhuǎn)移、濃縮的操作步驟，大大提高了提取效率。此外，本裝置采用全封閉的冷凝管，有效避免了提取溶劑的揮發(fā)損失，大大降低了樣品前處理過程對實驗室環(huán)境造成的污染，密閉冷凝器帶有泄壓閥，壓力過高時可自動泄壓，有效避免因壓力過高對提取裝置造成的損壞；裝置在溶劑回流管中設(shè)置三通閥，通過切換閥門可直接切換樣品回流提取和濃縮，整個操作流程不需轉(zhuǎn)移樣品。裝置還設(shè)計了連接色譜進樣瓶接口的圓底燒瓶，樣品濃縮完成后，旋下色譜進樣瓶即可直接進行分析，避免常規(guī)樣品尾管濃縮燒瓶濃縮完后，需用吸管將尾管中的溶液取出并洗滌尾管和吸管的步驟，進一步簡化了樣品前處理操作。

2.2 樣品前處理條件的確定

2.2.1 提取試劑優(yōu)化 采用本研究設(shè)計的帶固相萃取功能的索氏提取裝置提取紫蘇樣品，分別用正己烷和二氯甲烷進行提取，分析對比提取液GC-MS總離子流。結(jié)果表明，2種提取試劑中，二氯甲烷溶劑萃取得到的化學成分種類更多，色譜峰面積較大，故選用二氯甲烷作為提取溶劑。

2.2.2 提取時間優(yōu)化 按照樣品前處理方法，采用本研究設(shè)計的帶固相萃取功能的索氏提取裝置分別提取紫蘇樣品 1、2、3、4、5 h，分析對比不同提取時間得到的提取液GC-MS總離子流。結(jié)果表明，提取3 h后，總離子流中化學成分種類及色譜峰面積基本保持不變，為保證目標物提取完全，選擇提取時間為3 h。

2.2.3 固相萃取填料用量優(yōu)化 索氏提取過程中大量雜質(zhì)會隨揮發(fā)性成分一起溶出，因此本研究對傳統(tǒng)索氏提取裝置進行了改進，于索氏提取裝置中增設(shè)了固相萃取柱，采用硅膠作為固相萃取填料吸附提取液中的雜質(zhì)，并對硅膠用量進行優(yōu)化。在固相萃取柱中分別加入 5、10、20、30 g硅膠顆粒（200～300目），在樣品筒中加入20 g紫蘇樣品，以二氯甲烷為提取溶劑，50℃加熱，冷凝回流3 h，分析對比提取液GC-MS總離子流。結(jié)果表明，硅膠用量為5 g時，提取液總離子流中化學成分種類較多，經(jīng)檢索后各物質(zhì)匹配度均不高，且色譜峰面積明顯小于另外3種硅膠用量，可能是由于硅膠用量較少，沒有達到明顯的凈化效果；硅膠用量為10和20 g時，提取液總離子流中化學成分種類及色譜峰面積沒有明顯變化；硅膠用量為30 g時，提取液總離子流中化學成分種類及色譜峰面積略低于10和20 g的硅膠用量，可能是由于硅膠用量較大時吸附了部分揮發(fā)性成分。為了實現(xiàn)提取液的有效凈化，選擇10 g硅膠作為填充量。

2.3 紫蘇揮發(fā)性成分分析

紫蘇提取液進行GC-MS分析，相應的質(zhì)譜總離子流如圖2所示，揮發(fā)性成分用WILEY、NIST譜庫進行檢索，相對含量利用峰面積歸一法進行計算。以二氯甲烷為溶劑，采用自制的帶固相萃取功能的索氏提取裝置從紫蘇葉中提取揮發(fā)性成分，經(jīng)GCMS分析，共鑒定出75種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括烯烴類、醇類、酮類等（表1）。由表1可以看出，檢出烯烴類化合物最多（28種），總含量為14.63%，含量較高的成分主要有石竹烯（8.38%）、Z，E-α-法尼烯（1.40%）、律草烯（1.19%）、1，3-二異丙基-1，3-環(huán)戊二烯（1.01%）等；醇類化合物次之（13種，含量4.90%），含量最高的成分是芳樟醇（1.94%）；酮類化合物有12種，含量高達65.75%，含量較高的成分主要有紫蘇酮（56.16%）、異脫氫紫蘇酮（8.11%）等；有機酸有4種，含量為1.87%，含量最高的成分是棕櫚酸（1.41%）；其他還有少量酚類化合物（2種）、醛類化合物（3種）、酯類化合物（3種）、醚類化合物（1種）、烷烴類物質(zhì)（3種）、其他物質(zhì)（6種）等。

圖2 紫蘇揮發(fā)性化學成分總離子流

從表1中還可以看出，從紫蘇葉提取物中得到45種香味成分，占揮發(fā)性物質(zhì)相對含量的88.66%。這些香味成分協(xié)調(diào)配伍，賦予了紫蘇特殊的香氣。

紫蘇提取物中部分揮發(fā)性物質(zhì)還具有一定的藥用活性，如含量最高的紫蘇酮不僅具有特異的芳香氣味，還能通過干擾細菌的代謝達到抗菌抑菌效果，同時還能增加小腸推進力起到解魚蟹毒的作用［18］；紫蘇醛具有獨特的藥用效果，如抗衰老、降血脂、抗過敏炎癥等功能；子丁香酚具有抗菌、健胃、降血壓的作用；D-檸檬烯作為特征香氣成分之一，不僅能

廣泛應用于食用香精中，還能通過抑制蛋白質(zhì)異戊烯化來預防和抑制腫瘤的發(fā)生，具有抗癌作用；芳樟醇具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、抗腫瘤、抗菌等藥理活性［19］；欖香烯是一種抗癌成分，用于治療腦癌、肺癌和消化道腫瘤等［20］；洋芹醚有催眠、鎮(zhèn)靜和抑菌作用［21］；石竹烯廣泛應用于食品香料方面，同時還兼?zhèn)潇钐抵箍?、消毒殺菌的藥用價值，是治療老年支氣管炎的有效成分［22］。

表1 紫蘇揮發(fā)性化學成分分析結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

2.4 方法重復性

為了考察該方法的精密度，對紫蘇樣品進行了7次日內(nèi)重復測定，同時進行了7 d的重復性試驗，選取紫蘇酮、石竹烯、異脫氫紫蘇酮、石竹烯氧化物、棕櫚酸、芳樟醇作為標記物，考察重復性，結(jié)果見表2，日內(nèi)測定的相對標準偏差為2.5%～4.3%，日間測定的相對標準偏差在2.8%～4.8%，測定結(jié)果具有很好的重現(xiàn)性，表明該方法的日內(nèi)和日間精密度較好。

3 結(jié)論

針對目前索氏提取前處理操作復雜、萃取過程大量雜質(zhì)會隨揮發(fā)性成分一起溶出影響檢測等問題，本研究設(shè)計開發(fā)了一種新型的集提取、凈化、濃縮及轉(zhuǎn)移功能為一體的帶固相萃取功能索氏提取裝置，中途不用轉(zhuǎn)移樣品，密閉環(huán)境進行加熱萃取，大大簡化了樣品前處理操作，有效縮短了樣品前處理周期，為紫蘇揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分提供了快速、可靠的分析方法。

表2 方法重復性試驗結(jié)果（n=7）

利用自主設(shè)計的帶固相萃取功能的索氏提取裝置提取紫蘇中的揮發(fā)性成分，采用GC/MS聯(lián)用技術(shù)分析鑒定出75種揮發(fā)性組分，其中具有香味的成分有45種，這些成分具有的特征香氣，可用于香精、香料及制藥，具有很高的開發(fā)利用價值。