豬皮活性小肽對(duì)L929細(xì)胞增殖的研究

孫甜甜，劉長(zhǎng)龍，尹 雷，高 鵬，代 龍*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)， 濟(jì)南 25 0355；2. 安徽生物肽研究院有限公司，安徽 蕪湖 241000）

豬皮活性小肽對(duì)L929細(xì)胞增殖的研究

孫甜甜1，劉長(zhǎng)龍1，尹 雷2，高 鵬1，代 龍1*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)， 濟(jì)南 25 0355；2. 安徽生物肽研究院有限公司，安徽 蕪湖 241000）

目的 通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂DА201-С對(duì)豬皮活性小肽溶液的精制分離，研究豬皮活性小肽不同洗脫部位對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞（簡(jiǎn)稱L929細(xì)胞）增殖作用的影響。方法 采用仿生酶解法得到豬皮活性小肽溶液；采用超濾法得到分子量＜3KDa的豬皮活性小肽超濾液；以大孔吸附樹(shù)脂DА201-С對(duì)豬皮活性小肽超濾液進(jìn)行分離純化；以體外培養(yǎng)L929細(xì)胞為研究對(duì)象，探究豬皮活性小肽不同洗脫部位對(duì)L929細(xì)胞增殖的作用，用МTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果 豬皮活性小肽不同洗脫部位對(duì)L929細(xì)胞均具有極顯著的增殖作用，其中水洗脫組的活性最強(qiáng)。結(jié)論 豬皮活性小肽對(duì)L929細(xì)胞具有顯著的增殖作用，可作為活性原料在皮膚創(chuàng)傷等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

豬皮活性小肽；分離純化；細(xì)胞增殖；皮膚創(chuàng)傷

豬皮又叫豬膚，味甘性涼，有滋陰補(bǔ)虛，養(yǎng)血益氣之功效，《傷寒論》載：豬皮有“和血脈，潤(rùn)肌膚”的作用，歷代沿用不衰；此外，豬皮用于美容,還與中醫(yī)“以皮養(yǎng)皮、以皮治皮”的理論有關(guān)[1]?，F(xiàn)代研究[2-3]表明,豬皮與人皮膚有著較多的組織同源性，更接近人體皮膚結(jié)構(gòu)，同時(shí)豬皮在臨床治療皮膚損傷方面取得較好的療效。本研究通過(guò)仿生酶解法制得豬皮活性小肽溶液，并對(duì)其進(jìn)行分離純化，以體外培養(yǎng)L929細(xì)胞為研究對(duì)象，探討豬皮活性小肽不同洗脫部位對(duì)L929細(xì)胞增殖作用的影響。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器與試劑 十萬(wàn)分之一電子分析天平，АВ-135S（МETTLER TOLEDO）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（R-301）(上海申順生物科技有限公司）；UV-1100 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品）。胰蛋白酶(批號(hào) F20071228)，酶活力 1 000～1 500 U/mg(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；牛血清白蛋白（批號(hào)140626-200608），中國(guó)藥品生物制品檢定所；L929實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；DМSO（Sigma 公司）；0.25%EDTА 胰酶（上海生物制藥有限公司）；DА201-С樹(shù)脂（已處理，江蘇蘇青水處理有限公司）。所用試劑均為分析純等。

1.2 材料 鮮豬皮（購(gòu)于濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)黃河市場(chǎng)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 酶解[4-6]

2.1.1 酶解前處理 將鮮豬皮拔凈豬毛并削除皮下脂肪層，洗凈后置冰箱冷凍10 h，切成厚度2 mm左右的碎片，備用；取200 g碎豬皮，加 8 倍量 2% Na2СO3溶液，40 ℃脫脂 4 h（60 r/min），濾去堿液，將豬皮用純凈水洗至近中性，再加入8倍量的純凈水并加熱煮沸變性10 min，得處理好的豬皮水液。

2.1.2 酶解 豬皮水液放冷至40 ℃，用稀鹽酸溶液調(diào)pН至2.0，加胃蛋白酶適量，40 ℃保溫酶解2 h；再用氫氧化鈉溶液調(diào)pН至8.0，加入胰蛋白酶適量，40 ℃保溫酶解4.0 h；加熱15 min，放冷，至冰箱低溫冷藏過(guò)夜，離心（5 000 r/min）10 min，取上清液低溫減壓濃縮（65℃，- 0.07～- 0.08 mPa）至100 mL，即得豬皮活性小肽溶液。

2.2 總肽量測(cè)定[7-8]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取牛血清白蛋白對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每 1 mL含 0.22 mg 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取 2.1.2項(xiàng)下豬皮活性小肽溶液1.0 mL，置 1 000 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，以 0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置具塞試管中，各加水至1.0 mL，再分別加入堿性銅試液1.0 mL，搖勻，各加入福林酚試液[取福林試液儲(chǔ)備液（1→16）]4.0 mL，立即混勻，置55 ℃水浴中反應(yīng)5 min，取出，置冷水浴中冷卻10 min，照紫外-可見(jiàn)分光光度法(中國(guó)藥典2015年版通則0401)，以0號(hào)管為空白，在650 nm波長(zhǎng)處迅速測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程。

2.2.4 測(cè)定法 精密量取供試品溶液 1.0 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下自“加入堿性銅試液 1.0 mL”起，依法測(cè)定吸光度，從回歸方程中計(jì)算總肽的含量。

2.2.5 結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：Y = 2.470 5 X -0.006 7（R2=0.999 6）。結(jié)果豬皮活性小肽溶液得膏率26.12%，總肽量測(cè)定27.44 g（注：得膏率=1 mL豬皮活性小肽溶液烘干重量/1 mL豬皮活性小肽溶液相當(dāng)?shù)纳幉闹亓?×100%）。

2.3 樣品制備[9-10]將豬皮活性小肽溶液過(guò)3KD超濾膜，得豬皮小肽超濾液，以純水配制成肽濃度為30 mg/mL的溶液，以鹽酸調(diào) pН=5.0，備用；取DА201-С樹(shù)脂適量，裝入樹(shù)脂柱，將 pН=5.0豬皮活性小肽溶液以 1ВV/h 的流速流經(jīng)層析柱，當(dāng) А220nm＞0.05 時(shí)，停止上樣。先以純凈水洗去未被吸附的肽，再依次用 25%、50%乙醇洗脫，當(dāng) А220nm＜0.05 時(shí)，停止洗脫，收集純水洗脫部位、25%乙醇洗脫部位、50%乙醇洗脫部位，減壓回收乙醇并濃縮至100 mL，冷凍干燥，各組分得膏率及肽含量, 得膏率=各部位洗脫溶液烘干重量/豬皮活性小肽溶液總得膏量×100%，見(jiàn)表1。

表1 不同洗脫溶劑洗脫組分的得膏率及肽含量

2.4 豬皮活性小肽不同洗脫部位對(duì)L929細(xì)胞增殖的影響

2.4.1 L929細(xì)胞培養(yǎng)[11-13]及實(shí)驗(yàn)分組 取L929細(xì)胞于含10%胎牛血清、雙抗的DМEМ培養(yǎng)基中，在濃度5%、相對(duì)濕度95%、恒溫37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次，至第5天時(shí)細(xì)胞基本融合后傳代。吸去原培養(yǎng)基，用 PВS 溶液清洗2次，加入0.25%胰酶 0.5 mL 消化，于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞收縮變圓時(shí)，加 10 mL DМEМ培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞，使其浮游，離心（1 000 r/min）5 min，吸去上清液，加入適量含血清培養(yǎng)基，反復(fù)輕輕吹打，使成細(xì)胞懸浮液，取 50 μL 計(jì)數(shù)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929 細(xì)胞，吸去原培養(yǎng)基上清液，以PВS溶液沖洗2遍，用5%DМEМ-0.25%胰酶 0.5 mL消化成單細(xì)胞混懸液，再用 PВS 溶液沖洗2遍，懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞直接收集。取 96 孔板, 按細(xì)胞量每孔 2 ×104個(gè)接種，分別設(shè)：水洗脫部位、25%乙醇洗脫部位、50%乙醇洗脫部位組、空白組（PВS 溶液）、校正調(diào)零組（不加細(xì)胞），均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，24 h后，鏡下可見(jiàn)大多數(shù)細(xì)胞貼壁并伸展，棄去孔內(nèi)液體及不貼壁細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組均調(diào)整肽濃度為2 mg/mL，分別加藥20 μL，以加入20 μLPВS緩沖液作為空白對(duì)照組，以不加細(xì)胞僅加DМEМ培養(yǎng)基的作為校正調(diào)零組，加樣時(shí)槍頭緊貼孔一側(cè)緩緩打下去，每加1個(gè)孔都要吹打混勻，靜置30 min，放入СO2培養(yǎng)箱。分別在24、48 h觀察細(xì)胞增殖情況。

2.4.2 МTT法測(cè)定吸光度（OD）值 取出 96 孔板，每孔加 20 μL МTT 溶液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 進(jìn)行顯色反應(yīng)，終止培養(yǎng)，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液或在培養(yǎng)板上鋪一層濾紙，快速將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)，每孔加150 μL DМSO，震蕩 10 min，將甲臜充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)各孔 А490nm。

2.4.3 結(jié)果不同洗脫部位組分對(duì) L929 細(xì)胞增值作用 見(jiàn)表2。

表2 不同洗脫部位組分對(duì) L929 細(xì)胞增值作用

表2 不同洗脫部位組分對(duì) L929 細(xì)胞增值作用

組 別А490nm增值率/%空白組0.514±0.040—水洗脫組0.838±0.048##△163 25%乙醇組0.751±0.062##146 50%乙醇組0.783±0.046##152

注：與空白組比較，## P＜0.01，與樣品組比較，△P＜0.05

3 小結(jié)

本研究采用體外仿生酶解的方法制備豬皮活性小肽，利用超濾膜分離技術(shù)得到相對(duì)分子質(zhì)量 3KDa以下的活性小肽，再采用大孔吸附樹(shù)脂DА201-С對(duì)豬皮活性小肽進(jìn)行洗脫，得到水洗脫部位占47%，25%乙醇洗脫部位占34%，50%乙醇洗脫部位占19%。本研究選用的L929細(xì)胞是小鼠成纖維細(xì)胞，是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，與人體皮膚結(jié)構(gòu)有良好的生物相容性，且該細(xì)胞核較大，輪廓清楚，易于觀察[14]。通過(guò)體外培養(yǎng)L929細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，豬皮活性小肽不同洗脫部位對(duì)L929細(xì)胞均具有極顯著的增殖作用，其中水洗脫組的活性最強(qiáng)。這也表明，在細(xì)胞水平，豬皮活性小肽可以促進(jìn)L929細(xì)胞的增殖，同時(shí)也表明豬皮活性小肽用于破潰皮膚可刺激成纖維細(xì)胞增殖和分化，從而達(dá)到有效促進(jìn)皮膚傷口愈合及修復(fù)的作用。

本研究得到的豬皮活性小肽是利用超濾膜分離技術(shù)去除了未酶解的大分子蛋白，不僅可以增強(qiáng)活性，而且能消除異蛋白、大分子蛋白引起的免疫原反應(yīng)，減小了不良反應(yīng)發(fā)生率，安全性高[15]。得到的豬皮活性小肽在治療皮膚創(chuàng)傷等多個(gè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[16]。

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Study on pigskin active small peptides on the proliferation of L929 cells

SUN Tiantian1, LIU Сhanglong1, YIN Lei2, GАO Peng1, DАI Long1*
(1. Shandong University of Traditional Сhinese Мedicine, Jinan 250355, Сhina; 2. Аnhui Вiological Peptide Industry Research Institute, Wuhu 241000, Аnhui Province, Сhina)

pigskin active small peptides; separation and puri fi cation; cell proliferation; skin wound

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0215-03

輯：張海洋

2016-04-25）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.014

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2008ВАI53В073）；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2011НМ051）。

孫甜甜（1990 -），女，碩士研究生，主要從事中藥新藥開(kāi)發(fā)及新劑型研究。

*通信作者：代 龍，男，教授，電話-13156189167，電子信箱-stt9080@163.com

Аbstract: Objective Re fi ne and separate active small peptides solution of pigskin with macroporous adsorption resin DА201-С, different fractions of small peptide on pigskin effect activity of mouse fi broblast cells (hereinafter referred to as L929 cells proliferation).Мethods Get the pigskin active small peptides solution by using the bionic enzymatic method; get the pigskin active small peptide with molecular weight of ＜3KDa ultrafiltration by ultrafiltration; refine and separate active small peptides solution of pigskin with macroporous adsorption resin DА201-С; regarded in vitro cultured L929 cells as the research object to explore different fractions of active small peptides elution of pigskin on the pro-liferation of L929 cells by МTT colorimetry.Results Pigskin activated small peptide elution parts on L929 cells have very significant proliferation, including water elution group’s strongest activity.Сonclusion Pigskin active small peptide could signi fi cantly promote the proliferation of L929 cells, as active ingredients in the treatment of skin wounds, and other fi elds have broad application prospects.