HPLC法測(cè)定人血清伏立康唑濃度

李 輝，趙宇蕾，周?chē)?guó)華，芮建中

HPLC法測(cè)定人血清伏立康唑濃度

李 輝，趙宇蕾，周?chē)?guó)華，芮建中

目的 建立高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定人血清中伏立康唑的方法，為臨床伏立康唑的個(gè)體化用藥提供方法學(xué)基礎(chǔ)。 方法 采用7%高氯酸直接沉淀血清蛋白，色譜柱采用漢邦Hedera ODS?2（4.6 μm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈?20 mmol／L磷酸二氫鈉緩沖液（pH＝6.0）（60∶40，v／v），流速為1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。 結(jié)果 伏立康唑在0.367～23.5 μg／mL間線性良好（r＝0.9964），批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度偏差＜±5.0%，批內(nèi)、批間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）＜11.1%，在室溫放置、冰凍、反復(fù)凍融條件下考察樣品穩(wěn)定性，伏立康唑均保持穩(wěn)定，偏差＜±12.5%。 結(jié)論 建立的HPLC測(cè)定人血清伏立康唑濃度的方法具有操作簡(jiǎn)便、特異性高、靈敏度高、成本低的特點(diǎn)，更適合臨床中常規(guī)應(yīng)用。

伏立康唑；高效液相色譜；血清濃度

真菌細(xì)胞膜中含有麥角甾醇，三唑類(lèi)抗真菌藥通過(guò)抑制細(xì)胞色素氧化酶P450介導(dǎo)的14α?羊毛甾醇去甲基化而抑制麥角甾醇的合成，從而使真菌細(xì)胞膜合成受阻，破壞其穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡［1］。伏立康唑作為第二代抗真菌藥，在第一代氟康唑結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)丙基骨架引入一個(gè)甲基顯著增強(qiáng)其對(duì)CYP450依賴性羊毛甾醇14α?去甲基酶的親和力，并在嘧啶環(huán)引入一個(gè)氟原子提高其體內(nèi)抗真菌活性，因此被廣泛應(yīng)用于侵襲性真菌感染，并成為侵襲性曲霉菌感染的一線用藥［2］。

伏立康唑治療侵襲性曲霉病的Ⅲ期臨床試驗(yàn)證實(shí)，其血藥谷濃度與藥?時(shí)曲線下面積正相關(guān)［3］；Meta分析證實(shí)，患者伏立康唑穩(wěn)態(tài)血藥谷濃度＜0.5 μg／mL時(shí)，感染預(yù)防失敗率增加，而＞3 μg／mL時(shí)，肝毒性發(fā)生率隨濃度上升而顯著增加，并有可能出現(xiàn)神經(jīng)毒性和視覺(jué)障礙［4］；多個(gè)研究顯示，伏立康唑谷濃度在個(gè)體內(nèi)及個(gè)體間存在較大差異［5?6］。 以上結(jié)果均提示，在臨床實(shí)踐中十分有必須監(jiān)測(cè)伏立康唑血藥濃度，穩(wěn)態(tài)血藥谷濃度更能準(zhǔn)確反映伏立康唑使用的有效性和安全性。本文建立臨床適用的快速、準(zhǔn)確的血清伏立康唑高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定方法，并成功協(xié)助臨床科室開(kāi)展真菌感染相關(guān)治療，為伏立康唑的合理使用提供有效的方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)（G1322A在線脫氣機(jī)，G1312A泵，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測(cè)器，Agilent ChemStation化學(xué)工作站，Agilent），電子分析天平（XS205DU，Mettler Tole?do），低速離心機(jī)（2?6E，Sigma），高速離心機(jī)（1?13，Sigma），渦旋振蕩器（WH?3，上海滬西分析儀器廠），pH計(jì)（PHS?3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）等。

1.1.2 藥品與試劑 伏立康唑?qū)φ掌罚兌龋?9%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：201402），乙腈（色譜純，Tedia，批號(hào)：609697），二水合磷酸二氫鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130502），其它試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Hedera ODS?2（4.6 μm ×250 mm，5 μm），江蘇漢邦科技有限公司；流動(dòng)相：乙腈?20 mmol／L磷酸二氫鈉緩沖液（pH＝6.0）（60∶40，v／v）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫40℃；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.2.2 血清樣本處理 取血清樣本200 μL置于新的EP管中，加入100 μL 7%高氯酸，渦旋混合15 s，13 000 r／min離心10 min后，取上清進(jìn)樣分析。

1.2.3 方法專(zhuān)屬性試驗(yàn) 在本試驗(yàn)所采用的色譜條件下，按1.2.2項(xiàng)下方法操作，分別記錄空白血清、空白血清＋伏立康唑、伏立康唑患者血清色譜圖，確定分析方法的專(zhuān)屬性，排除雜質(zhì)干擾。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?.7 mg置于5 mL容量瓶中，加少量乙腈完全溶解后加適量水定容，配成濃度為940 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。加水稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依次配成3.67、7.34、14.69、29.38、58.75、117.5、235.0 μg／mL的系列工作液。分別在180 μL空白血清中加入20 μL工作液，使血清中藥物濃度依次為 0.367、0.734、1.469、2.938、5.875、11.75、23.5 μg／mL；按1.2.2項(xiàng)下方法操作，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限。

1.2.5 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 加水稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依次配成5.4、37.8、188.8 μg／mL的系列工作液。分別于180 μL空白血清中加入20 μL工作液，精確配制成含低、中、高（0.54、3.78、18.88 μg／mL）3種不同伏立康唑濃度的血清樣品，每種濃度5份。按1.2.2項(xiàng)下方法處理，記錄色譜圖。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算伏立康唑的血清濃度，考察批內(nèi)準(zhǔn)確度、批內(nèi)精密度；連續(xù)3 d同法操作，考察批間準(zhǔn)確度、批間精密度。

1.2.6 提取回收率試驗(yàn) 分別于180 μL空白血清中加入20 μL 2.5項(xiàng)下的工作液，精確配制成含低、中、高（0.54、3.78、18.88 μg／mL）3種不同伏立康唑濃度的血清樣品，每種濃度5份。用水代替空白血清配置對(duì)照品溶液，每種濃度5份。按1.2.2項(xiàng)下方法處理，記錄色譜圖。以每一濃度兩者峰面積之比計(jì)算提取回收率。

1.2.7 樣本穩(wěn)定性考察 血清樣品分別在室溫放置8 h、凍融3次、－20℃放置15 d以及處理好室溫放置24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察樣本的穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 方法的專(zhuān)屬性 在本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件下，伏立康唑保留時(shí)間在5.5 min左右，樣品峰形良好，無(wú)雜峰干擾測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程：Y＝4.600X－0.052（r＝0.9964）。結(jié)果表明，伏立康唑血藥濃度在0.367～23.5 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。伏立康唑在血清中的定量下限為：0.367 μg／mL。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度 批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度和精密度見(jiàn)表1。批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度偏差＜±5.0%，批內(nèi)、批間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜11.1%，符合生物樣品分析要求。

圖1 伏立康唑色譜圖

表1 不同濃度批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度和精密度（n＝5）

2.4 提取回收率 提取回收率結(jié)果見(jiàn)表2。絕對(duì)回收率＞95.6%。

表2 不同濃度回收率比較（n＝5）

2.5 樣本穩(wěn)定性 樣本穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表3。在室溫放置8 h、凍融3次、－20℃放置15 d以及處理好后室溫放置24 h條件下，伏立康唑均保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯變化，偏差均＜±12.5%，符合生物樣品分析要求。

表3 不同條件下樣品穩(wěn)定性（n＝5）

2.6 臨床應(yīng)用 本方法成功用于口服伏立康唑患者的血藥濃度監(jiān)測(cè)。我院呼吸內(nèi)科送樣患者主要目的為抗真菌感染。某患者服用常規(guī)劑量的伏立康唑后，穩(wěn)態(tài)血藥谷濃度為12.22 μg／mL，高于推薦有效濃度1～5.5 μg／mL；主治醫(yī)生將劑量減半后，重新測(cè)定穩(wěn)態(tài)血藥谷濃度為5.49 μg／mL，成功調(diào)整至有效濃度范圍。

3 討 論

伏立康唑作為一線抗真菌藥物，在臨床中受到廣泛應(yīng)用。已有研究證實(shí)，伏立康唑的有效性和安全性與穩(wěn)態(tài)血藥谷濃度密切相關(guān)［3?4］，因此，對(duì)其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)十分必要。利用藥物在流動(dòng)相和固定相中分配系數(shù)的差別而分離藥物與雜質(zhì)的色譜法是臨床常用的測(cè)定方法［7?10］，與近年興起的LC?MS／MS方法相比，HPLC方法操作簡(jiǎn)便、成本低、基質(zhì)效應(yīng)小，因此更易于在臨床實(shí)際應(yīng)用中得到推廣。

目前已有多篇文章采用HPLC方法分析血漿、血清中伏立康唑的濃度［11?12］，但仍存在一定問(wèn)題。血漿、血清所含蛋白會(huì)造成色譜柱堵塞，降低其壽命，因此在色譜分析之前去除蛋白十分必要。已有文獻(xiàn)中多采用3倍體積乙腈方法沉淀血漿、血清蛋白［13?14］，但因加入體積過(guò)大而使樣本中伏立康唑濃度成倍下降，方法靈敏度顯著降低；如加入乙腈沉淀蛋白后吹干再用流動(dòng)相溶解，會(huì)部分解決靈敏度問(wèn)題，但處理步驟繁瑣，并容易帶來(lái)較大的操作誤差，影響測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度；本文采用0.5倍體積7%高氯酸方法沉淀蛋白，在不影響伏立康唑結(jié)構(gòu)和色譜行為的前提下，對(duì)樣本的稀釋作用較少，且可直接離心后上樣分析，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。流動(dòng)相中濃度過(guò)高的緩沖液易造成色譜柱堵塞，本文將文獻(xiàn)中常用的50～100 mmol／L磷酸二氫鈉調(diào)整為20 mmol／L［14?15］，在不影響伏立康唑色譜行為的前提下，顯著降低了色譜柱堵塞風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)色譜柱使用壽命，節(jié)約了試劑和測(cè)定成本。

綜上所述，本文所采用的伏立康唑HPLC測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、特異性高、靈敏度高、成本低且色譜柱使用壽命長(zhǎng)，更適合臨床實(shí)際應(yīng)用。目前，該方法已在我院被廣泛用于監(jiān)測(cè)伏立康唑的臨床應(yīng)用，為其使用的有效性和安全性提供有力的技術(shù)保障。

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The determination of voriconazole concentration in human serum by HPLC

LI Hui，ZHAO Yu?lei，ZHOU Guo?hua，RUI Jian?zhong

（Department of Pharmacology，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region，PLA，Nanjing210002，Jiangsu，China）

Objective To establish an high performance liquid chromatography（HPLC） method to determine the voriconazole concentration in human serum，that will provide methodological foundation for individual medicine. Methods After the precipitation of serum proteins with 7%perchloric acid，the voriconazole concentration was determined by HPLC on a reversed phase Hedera ODS?2 column（4.6 μm×250 mm，5 μm）.The mobile phase was a mixture of acetonitrile and 20 mmol／L sodium dihydrogen phosphate buffer adjusted to pH 6.0，with the mix ratio 60∶40，and was delivered at a flow rate of 1.0 mL／min.The UV detection was set at 254 nm. Results The peak area for voriconazole was linearly related to its concentrations，which ranged from 0.367 to 23.5 μg／mL（r＝0.9964）.The intra?and inter?assay variations were within±5.0%and their relative standard deviation values were within 11.1%.The serum samples were stable when stored at room temperature，after frozen for 15 days and after 3 cycles of freeze and thaw processes；deviations were within±12.5%. Conclusion The established HPLC method is simple and fast with high specificity，high sensitivity and low cost.The improved method is more suitable for clinical routine use.

Voriconazole；High Performance Liquid Chromatography；Serum concentration

R969.3

A

1672?271X（2017）01?0030?04

10.3969／j.issn.1672?271X.2017.01.008

2016?07?05；

2016?07?26）

（本文編輯：張仲書(shū)； 英文編輯：王建東）

210002 南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥理科

芮建中，E?mail：ruijianzhong＠126.com

李 輝，趙宇蕾，周?chē)?guó)華，等.HPLC法測(cè)定人血清伏立康唑濃度［J］.東南國(guó)防醫(yī)藥，2017，19（1）：30?33.