反相高效液相色譜法同時(shí)測定黃酒中4種游離嘌呤

劉鎮(zhèn)，王靈芝，章姍姍，葛樂勇，諸葛慶，曾紅燕

（紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家黃酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，浙江紹興312000）

反相高效液相色譜法同時(shí)測定黃酒中4種游離嘌呤

劉鎮(zhèn)，王靈芝，章姍姍，葛樂勇，諸葛慶，曾紅燕

（紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家黃酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，浙江紹興312000）

建立了一種簡單、快捷的黃酒中4種游離嘌呤含量的高效液相色譜分析方法。在0.5～20mg/L濃度范圍內(nèi)，各嘌呤的響應(yīng)值與其相應(yīng)濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.9990，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.8%～1.5%，檢出限在0.02～0.17mg/L，加標(biāo)回收率在89%～105%，符合分析測試要求。實(shí)驗(yàn)黃酒中游離腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤及黃嘌呤的含量分別為4.30mg/L、1.29mg/L、2.93mg/L與3.92mg/L。

嘌呤；黃酒；高效液相色譜

嘌呤是一種生物堿，由一個(gè)嘧啶環(huán)和一個(gè)咪唑環(huán)稠合而成，主要包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤及其衍生物等。在人體內(nèi)嘌呤代謝會變成尿酸，其中黃嘌呤是尿酸的直接來源，而次黃嘌呤和鳥嘌呤是尿酸的間接來源，二者均是在黃嘌呤氧化酶的作用下被氧化為黃嘌呤，最后黃嘌呤被氧化為尿酸。尿酸是人體內(nèi)一些有害活性物質(zhì)的有效清除劑，包括羥自由基、超氧負(fù)離子、單態(tài)氧及高鐵血紅素等[1]，因此嘌呤代謝正常的人食用含嘌呤較高的食物對機(jī)體是有益的。但是經(jīng)常進(jìn)食高嘌呤類食物，使腎臟不能將過多的嘌呤代謝物經(jīng)尿液排出，會造成血液尿酸的濃度超過正常值，尿酸鹽晶體可沉積于關(guān)節(jié)、軟組織、骨骼和腎臟等處，從而引發(fā)一系列疾病，如痛風(fēng)病、高尿酸血癥、腎臟疾病等等[2-3]。

目前關(guān)于酒類食物中嘌呤的研究主要集中在啤酒上[4]，其他酒類中嘌呤的研究則罕見報(bào)道。黃酒屬于非蒸餾酒，也含有一定量的嘌呤。對黃酒中嘌呤的檢測研究可為補(bǔ)充完善我國食物成分?jǐn)?shù)據(jù)庫提供數(shù)據(jù)，為痛風(fēng)等嘌呤代謝障礙性疾病患者的健康飲酒提供參考。

反相色譜是目前嘌呤最常用的分離模式[5-6]。微粒填料技術(shù)、化學(xué)鍵合技術(shù)以及合適的流動相使反相色譜系統(tǒng)能有效、快速分離許多化合物。本實(shí)驗(yàn)通過反相高效液相色譜法同時(shí)測定黃酒中游離的腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤及黃嘌呤，建立了一種方便、快捷的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品：市售某品牌黃酒。

試劑：腺嘌呤（BR）、鳥嘌呤（BR）、黃嘌呤（BR）、次黃嘌呤（BR）、85%磷酸（AR）、KH2PO4（AR）、NaOH（AR），所有試劑均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

儀器：高效液相色譜儀（Agilent1260），精密電子天平（梅特勒-托利多，ME204E），酸度計(jì)（梅特勒-托利多，S220）。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm× 250 mm，5μm）；柱溫：25℃；流動相：0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液（pH4.0）；流速：1m L/m in；進(jìn)樣量：20μL；檢測器：紫外檢測器（UV）；檢測波長：254 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤標(biāo)樣25mg，分別用超純水定容至25m L，配制濃度為1mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（嘌呤不易溶于水，可加入NaOH溶液助溶）。將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度：0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L。在上述色譜條件下進(jìn)行分析，以每種物質(zhì)的峰面積與標(biāo)樣濃度做線性回歸曲線。

1.4 樣品測定

將待測黃酒樣品用0.45μm針式過濾頭過濾，濾液進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果分析

2.1 色譜分析條件的確認(rèn)

嘌呤為弱極性堿性化合物，可采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱分析。柱溫、流動相組分、流動相pH值和流速等對4種嘌呤的分離效果均有一定的影響，參考他人的研究成果[7-8]發(fā)現(xiàn)，以0.02mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液（pH4.0）為流動相，在1m L/m in流速下，25℃柱溫時(shí)，4種嘌呤在15m in內(nèi)可達(dá)到完全分離（見圖1），出峰順序依次為鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。

圖1 4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤均有共軛雙鍵，在紫外區(qū)有強(qiáng)烈的吸收，其吸收峰在220～300 nm之間。用二極管陣列檢測器（DAD）對嘌呤標(biāo)樣進(jìn)行檢測，并保存全光譜，結(jié)果見圖2。綜合考慮各種嘌呤的吸收峰，選擇以254 nm作為檢測波長。

圖2 4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的全光譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)

在上述方法條件下，分別將配制的各組分濃度為0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入液相色譜儀進(jìn)行分離測定，以峰面積與標(biāo)樣濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見表1。由表1可知，在0.5～20mg/L濃度范圍內(nèi)，4種嘌呤的峰面積響應(yīng)值與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2大于0.9990。

2.3 精密度和檢出限

同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，在相同的條件下進(jìn)行色譜分析，根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果顯示RSD值均小于2%（見表2）。說明本方法重復(fù)性良好，符合分析檢測試驗(yàn)的要求。以信噪比3∶1為檢出限，信噪比10∶1為定量限計(jì)算其檢測限，結(jié)果見表2。

表1 各嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 嘌呤的精密度及檢測限

2.4 加標(biāo)回收率

向已知嘌呤含量的黃酒樣品中加入一定量的嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

2.5 黃酒中4種游離嘌呤的測定結(jié)果

對市售某品牌黃酒中的游離嘌呤進(jìn)行測定，采用保留時(shí)間與光譜圖定性，外標(biāo)法定量。測得游離鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤分別為1.29mg/L、2.93mg/L、3.92mg/L和4.30mg/L。

3 結(jié)論

反相高效液相色譜法同時(shí)測定黃酒中4種游離嘌呤的條件為：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL，0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液（pH4.0）為流動相，流速1.0 m L/m in，檢測波長254 nm。4種嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2大于0.9990，檢出限在0.02～0.17mg/L。鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤以該方法測定時(shí)的精密度分別為0.8%、0.6%、1.4%和1.5%，加標(biāo)回收率分別為89.9%，105%、92.1%和94.1%，符合分析檢測試驗(yàn)的要求。通過該方法測得市售某品牌黃酒中游離鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤分別為1.29mg/L、2.93mg/L、3.92mg/L和4.30mg/L。

[1]張昌穎.核酸生物化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1993：307-330.

[2]FUKUUCHIT,YAMAOKAN,KANEKO K.Analysisof intra-and extracellular levelsof purinebases, nucleosides,and nucleotides in HepG2Cellsby highperformance liquid chromatography[J].Analytical sciences,2015,31(9)：895-901.

[3]陳偉,方衛(wèi)綱,顧蘋,等.富嘌呤食物攝入及肥胖、飲酒等因素與高尿酸血癥的相關(guān)性[J].中國臨床營養(yǎng)雜志,2007, 15(2)：70-74.

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SimultaneousDeterm ination of Four Free Purines in Yellow RiceW ine by Reversed Phase HPLC

LIU Zhen,WANG Lingzhi,ZHANG Shanshan,GELeyong,ZHUGEQing and ZENGHongyan
(NationalQuality Supervision&Testing Center for Yellow RiceWine,Shaoxing Instituteof Food and Drug Testing,Shaoxing,Zhejiang 312000,China)

A simplemethod for simultaneous determination of four free purines in yellow ricew ine by RP-HPLC had been developed. Within the range of 0.5mg/L to 20mg/L,the response of each purine showed a good linear relationship w ith its correlation coefficient R above 0.9990,RSD w ithin 0.8%to 1.5%,detection lim its between 0.02mg/L to 0.17mg/L,and the recoveries between 89%to 105%.The determ ination results suggested that the contentof free adenine,guanine,hypoxanthine and xanthine in yellow rice w ine were4.30mg/L,1.29mg/L,2.93mg/L and 3.92mg/L respectively.

purine;yellow ricew ine;high performance liquid chromatography

TS262.4；TS261.7

A

1001-9286（2017）04-0100-03

10.13746/j.njkj.2016347

2016-11-23

劉鎮(zhèn)(1986-)，女，工程師，博士，主要從事食品檢測。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-01-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170125.0851.008.htm l。