紫外分光光度法測定辣木酒總黃酮含量

郎定常，盧斌，鄧亞紅，何昆，王用普，何翠容

（四川省酒類科研所，四川成都610017）

紫外分光光度法測定辣木酒總黃酮含量

郎定常，盧斌，鄧亞紅，何昆，王用普，何翠容

（四川省酒類科研所，四川成都610017）

建立紫外分光光度計測定辣木酒中總黃酮含量的方法。酒樣直接與NaNO2、A l(NO3)3、NaOH發(fā)生反應(yīng)，在波長510 nm處測定吸光度值。方法的平均回收率為104.38%，酒樣總黃酮含量測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.97%，該方法操作簡便，穩(wěn)定性好，可運用于辣木酒總黃酮含量的測定。

辣木酒；總黃酮；分光光度法

辣木（Moringa oleifera）來源于印度北部，是一種熱帶多功能植物，生長迅速，營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“生命之樹”“植物中的鉆石”，辣木的葉片含礦物質(zhì)[1]、維生素[2]、氨基酸[3]、黃酮[4]等多種物質(zhì)，其中黃酮類化合物具有重要的生物活性功能，如抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管[5]等。為促進(jìn)四川省白酒產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級，調(diào)整產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，四川省酒類科研所與峨眉雪芽酒業(yè)有限公司聯(lián)合研制開發(fā)辣木系列養(yǎng)生酒，黃酮類物質(zhì)的含量是此產(chǎn)品養(yǎng)生功能的重要指標(biāo)之一，本文對酒樣總黃酮的測定方法進(jìn)行深入探討。

目前鮮有關(guān)于辣木酒總黃酮測定的相關(guān)報道，本實驗以辣木酒為研究對象，確定檢測波長與顯色反應(yīng)的平衡時間點，研究不同樣品處理方法對測定結(jié)果的影響，通過測定回收率驗證方法的準(zhǔn)確度，建立辣木酒總黃酮含量的測定方法，為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：酒樣，市售。

儀器設(shè)備：INESA 752N紫外分光光度計，0.0001 g電子天平。

5%NaNO2溶液：稱取2.5 g NaNO2（分析純），加適量蒸餾水溶解并定容至50m L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

10%Al(NO3)3溶液：稱取5.0 g Al(NO3)3（分析純），加適量蒸餾水溶解并定容至50 m L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4%NaOH溶液：稱取4.0 g NaOH（分析純），加適量蒸餾水溶解并定容至100m L。

256μg/m L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取已烘至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）0.0128 g，加50%乙醇水溶液超聲溶解，轉(zhuǎn)移至50m L容量瓶，定容到刻度，搖勻備用。

1.2 測定方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、2.00 m L、4.00 m L、6.00m L、8.00m L、10.00m L，分別置于50m L容量瓶(蘆丁質(zhì)量相當(dāng)于0、512μg、1024μg、1536μg、2048μg、2560μg)，按如下步驟進(jìn)行顯色反應(yīng)：加入2.0m L的5%NaNO2溶液,搖勻，放置6 min；加2.0 m L 10%A l(NO3)3溶液，搖勻，放置6 m in；加20.0m L的4%NaOH溶液；加水定容至刻度搖勻，靜置28min后，于波長510 nm處測定紫外吸收值，以吸光度A為縱坐標(biāo)，樣品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，得到回歸方程y=0.0002x-0.0002，線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.9997。

1.2.2 樣品測定

量取4.00 m L酒樣作為顯色的反應(yīng)液。按照1.2.1的方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定得到樣品吸光度值A(chǔ)。

1.2.3 空白試驗

量取4.00m L酒樣置于50m L容量瓶中，按照1.2.1的操作，其中10%Al(NO3)3溶液用蒸餾水代替，測定得到吸光度值A(chǔ)0，以A-A0作為樣品吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出或用回歸方程計算出樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量m。

1.2.4 計算公式

式中：m——樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量，μg；v——酒樣體積，m L。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長的選擇

黃酮分子含有鄰二酚羥基，與NaNO2作用生成鄰二醌類物質(zhì)，在堿性條件下，與A l3+絡(luò)合反應(yīng)生成有色物質(zhì)，該物質(zhì)在500 nm處附近具有最大吸收波長。取待測液在480～540 nm隨同空白掃描，結(jié)果見圖1，待測液的最大吸收峰出現(xiàn)在510 nm，故選擇510 nm為測試波長。

圖1 最大吸收波長

2.2 顯色反應(yīng)平衡時間的測定

按照1.2.1的方法處理樣品，記錄隨時間延長紫外吸光度的變化，結(jié)果見圖2。反應(yīng)前28min，樣品吸光度呈不斷下降的趨勢；28～36m in吸光度值趨于一致，36m in之后吸光度開始緩慢降低。反應(yīng)初期顯色絡(luò)合物逐漸形成，吸光度隨之發(fā)生變化；反應(yīng)平衡時絡(luò)合物形成，吸光度相對穩(wěn)定；繼續(xù)延長反應(yīng)時間，絡(luò)合物易分解，吸光度發(fā)生變化，導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確[6]。本實驗中，顯色反應(yīng)時間在28～36m in之間達(dá)到平衡，這與已經(jīng)報道的銀杏酒[7]、蓮子酒[8]的平衡時間有差異，可能是辣木酒含有其他物質(zhì)或黃酮的種類不同等原因造成的。為使反應(yīng)完全，提高測定效率，縮短測定時間，本試驗樣品選擇放置時間為28m in。

圖2 樣品吸光度隨時間的變化

2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程的建立

按照1.2.1的方法，以蘆丁對照液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖3，得到線性回歸方程y=0.0002x-0.0002,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。該參數(shù)大于0.9990，說明此方法測定的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)與總黃酮的質(zhì)量成正相關(guān)。

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 樣品處理

由于黃酮類化合物的醇溶性大于水溶性，故選用甲醇或者乙醇作為提取溶劑；同時辣木酒樣的酒精度為45%vol，據(jù)此本實驗選擇如下的樣品處理方式。一是90℃水浴蒸干酒樣，用75%甲醇溶液或者75%乙醇溶液溶解蒸干物，蒸餾水定容后通過顯色反應(yīng)測定總黃酮的含量；二是酒樣無需處理，利用顯色反應(yīng)直接測定。每種樣品制備方式測定3個樣，測定結(jié)果見表1。

用75%的甲醇或75%的乙醇溶解蒸干物，測定數(shù)據(jù)的重復(fù)性不好，穩(wěn)定性不高，主要是由于凝固在蒸發(fā)皿上的固體物質(zhì)呈黏稠的膠狀，不易溶解。乙醇溶液對蒸干物的溶解性不如甲醇溶液，延長2種溶液對蒸干樣品的處理時間，總黃酮的測定數(shù)值變大；但甲醇具有揮發(fā)性和毒性，延長樣品前處理時間，增加操作難度。

表1 不同樣品制備方式對測定結(jié)果的影響

樣品直接測定結(jié)果的重現(xiàn)性好，操作方便，測定過程中不會涉及有毒試劑，綜上選擇酒樣不經(jīng)處理，直接測定。

2.5 準(zhǔn)確度實驗

為驗證方法的準(zhǔn)確度，對辣木酒進(jìn)行回收率實驗。取辣木酒樣品6份，每2份1組，共3組。分別精確加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00m L、1.26m L、1.51m L，按照1.2.1的方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在波長510 nm下測定結(jié)果（見表2）。由表2可知，加標(biāo)樣的平均回收率為104.38%，表明方法的回收率良好，滿足定量分析要求。

2.6 精密度實驗

取同一批次辣木酒酒樣，按照1.2.1的顯色方法測得吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到辣木酒總黃酮含量，結(jié)果見表3。同一個樣品測定結(jié)果RSD為1.97%，表明該方法對測定辣木酒中總黃酮含量的精密度較高，滿足實驗要求。

3 結(jié)論

本研究建立辣木酒中總黃酮含量的測定方法，在測定波長為510 nm下，辣木酒樣無需處理，直接進(jìn)行顯色反應(yīng)，反應(yīng)時間在28～36m in之間達(dá)到平衡，吸光度值相對穩(wěn)定。在此條件下測定樣品回收率為104.38%，酒樣中總黃酮測定結(jié)果的RSD值為1.97%，測定方法操作簡便，結(jié)果可靠，為辣木酒控

表2 辣木酒中總黃酮回收率實驗

制質(zhì)量提供參考依據(jù)，對辣木酒的保健性能指標(biāo)提供數(shù)據(jù)支持。

表3 樣品中總黃酮含量測定的結(jié)果

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Determ ination of Total FlavonoidsContent in Moringa oleifera Liquor by Spectrophotometry

LANGDingchang,LU Bin,DENGYahong,HEKun,WANGYongpu and HECuirong
(Sichuan Research Institute of A lcoholic Drinks,Chengdu,Sichuan 610017,China)

A method for determ ining flavonoids content in Moringa oleifera liquor by spectrophotometry had been developed.Wine samples directly reacted w ith NaNO2,A l(NO3)3and NaOH,and the absorbance valuewasmeasured atwavelength of 510 nm.The average recovery of suchmethod was104.38%and RSD was1.97%.Suchmethod was simple to operatew ith good stability,and suitable for the determ ination of total flavonoids content in Moringa oleifera liquor.

Moringa oleifera liquor;total flavonoids;spectrophotometry

TS262.91；TS261.7

A

1001-9286（2017）04-0103-03

10.13746/j.njkj.2017009

2017-01-13

郎定常，男，高級工程師，四川省酒類科研所副所長，主要從事酒類研究工作。