TNF-α對(duì)大鼠腎髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平蛋白表達(dá)的影響

隋洪玉，李 瑩，齊淑芳，賈秀月，趙曉蓮*

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007)

TNF-α對(duì)大鼠腎髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平蛋白表達(dá)的影響

隋洪玉1，李 瑩2，齊淑芳1，賈秀月1，趙曉蓮1*

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：探討腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)對(duì)大鼠腎髓袢升支粗段中PKA(蛋白激酶A)及其磷酸化水平蛋白表達(dá)的影響。方法：在髓袢升支粗段組織中加入10nM的TNF-α作用5min，采用免疫印跡技術(shù)觀察TNF-α對(duì)PKA及其磷酸化水平蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：TNF-α未能明顯改變大鼠腎髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平的蛋白表達(dá)(P﹥0.05)。結(jié)論：TNF-α不能改變PKA的蛋白合成及其磷酸化水平的表達(dá)。

TNF-α；髓袢升支粗段；PKA

0 引言

腫瘤壞死因子是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，包括TNF-α及TNF-β兩類。TNF-α主要由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，也可在中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中產(chǎn)生。在腎臟，TNF-α主要是由系膜細(xì)胞、近曲小管及髓袢升支粗段上皮細(xì)胞產(chǎn)生。大量文獻(xiàn)表明，TNF-α與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其被稱為是糖尿病腎病發(fā)生的重要媒介物[1]。Keith DiPetrillo[2]等研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠早期即可出現(xiàn)尿TNF-α含量增高，及由TNF-α誘導(dǎo)的鈉潴留，并證明TNF-α主要是通過(guò)增加腎遠(yuǎn)端小管鈉轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致鈉潴留發(fā)生的。但TNF-α是如何增加鈉重吸收進(jìn)而導(dǎo)致鈉潴留的機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)以TNF-α為施加因素觀察了其對(duì)髓袢升支粗段組織中PKA及其磷酸化水平蛋白表達(dá)的影響，以探討PKA依賴途徑是否參與了TNF-α致腎小管鈉潴留的形成過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年SD(Sprague-Dawley)大鼠，體重180～220g，雌雄均可。由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品及溶液

TNF-α購(gòu)于Sigma公司，PKA及p-PKA購(gòu)于Santa Cruz公司。細(xì)胞外液(mmol/L)：140NaCl、5KCl、1.8CaCl2、1.8MgCl2、10HEPES(pH7.4)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法和指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 藥品的配制

TNF-α先溶于去離子水中，再用細(xì)胞外液稀釋成相應(yīng)濃度的藥液，4℃貯存?zhèn)溆?。PKA、p-PKA、β-actin抗體用3%牛血清白蛋白(BSA)配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度，二抗用5%脫脂奶粉配制成相應(yīng)濃度，4℃或-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫印跡技術(shù)

取50μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部后停止，取出凝膠，將含有目的蛋白的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉目的蛋白1小時(shí)，繼而孵育一抗及二抗，最后進(jìn)行ECL顯影、凝膠成像分析系統(tǒng)處理分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。給藥前后各項(xiàng)指標(biāo)采用自身配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α對(duì)大鼠腎髓袢升支粗段組織中PKA蛋白表達(dá)的影響

在髓袢升支粗段組織中加入10nmol/L的TNF-α，作用5分鐘后，觀察其對(duì)PKA蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，10nmol/L的TNF-α不能明顯改變PKA的蛋白表達(dá)(n=3，P>0.05)(見圖1，圖2)。

圖1 TNF-α(10nmol/L)對(duì)髓袢升支粗段PKA蛋白表達(dá)的影響

圖2 TNF-α(10nmol/L)對(duì)髓袢升支粗段PKA蛋白表達(dá)的影響

2.2 TNF-α對(duì)大鼠腎髓袢升支粗段組織中磷酸化PKA蛋白表達(dá)的影響

在髓袢升支粗段組織中加入10nmol/L的TNF-α，作用5分鐘后，觀察其對(duì)PKA蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，10nmol/L的TNF-α不能明顯改變PKA的蛋白表達(dá)(n=3，P>0.05)(見圖3，圖4)。

圖3 TNF-α(10nmol/L)對(duì)髓袢升支粗段PKA磷酸化水平的影響

圖4 TNF-α(10nmol/L)對(duì)髓袢升支粗段PKA磷酸化水平的影響

3 討論

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常見的并發(fā)癥，是糖尿病患者的主要死因之一。DN的病理變化主要表現(xiàn)為腎臟肥大，腎小球和腎小管基膜增厚、胞外基質(zhì)積聚及腎小球硬化等。而糖尿病腎病早期的病理變化主要表現(xiàn)為鈉潴留，是導(dǎo)致高血壓和腎臟肥大的原因。因高血壓和腎臟肥大在糖尿病腎病患者中經(jīng)常被觀察到，故鈉潴留可看作是糖尿病腎病早期腎功能改變的一個(gè)重要指標(biāo)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，由鈉潴留導(dǎo)致的腎臟肥大主要發(fā)生在腎小管，且遠(yuǎn)端小管的改變先于近端小管。另外，近年來(lái)大量研究表明，尿TNF-α含量升高是DN早期形成的重要標(biāo)志，且其含量與DN的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[4,5]。Keith DiPetrillo等證實(shí)，糖尿病腎病大鼠早期出現(xiàn)的尿TNF-α含量增高所致的鈉潴留是通過(guò)增加腎遠(yuǎn)端小管鈉轉(zhuǎn)運(yùn)而造成的，但TNF-α是如何增加鈉轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而導(dǎo)致鈉潴留的機(jī)制不明。此外，由于腎遠(yuǎn)端小管對(duì)鈉的轉(zhuǎn)運(yùn)主要發(fā)生在髓袢升支粗段，因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了TNF-α對(duì)髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平蛋白表達(dá)的影響，以探討PKA依賴途徑是否參與了TNF-α致腎小管鈉潴留的形成過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α未能明顯改變大鼠腎髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平的蛋白表達(dá)，說(shuō)明TNF-α導(dǎo)致腎小管鈉潴留可能不是通過(guò)PKA依賴途徑發(fā)生的。

4 結(jié)語(yǔ)

但PKA蛋白合成是需要一段時(shí)間完成的，而本實(shí)驗(yàn)中施加因素作用的時(shí)間比較短，可能還未達(dá)到PKA總蛋白含量改變的時(shí)限，只能說(shuō)明TNF-α不是通過(guò)改變PKA磷酸化水平導(dǎo)致腎小管鈉潴留發(fā)生的。因此，在今后的實(shí)驗(yàn)中可以利用糖尿病模型進(jìn)一步探討PKA總蛋白含量是否發(fā)生改變，以確定PKA途徑是否介導(dǎo)了腎小管鈉潴留的發(fā)生。

[1]Fernández-Real JM, Vendrell J, García I, et al.StructuraldamageindiabeticnephropathyisassociatedwithTNF-αsystemactivity. Acta Diabetol 49(4): 301-305, 2012.

[2]Dipetrillo K, Coutermarsh Bonita, Gesek FA.Urinarytumornecrosisfactorcontributestosodiumretentionandrenalhypertrophyduringdiabetes. Am J Physiol Renal Physiol 284: F113-F121, 2003.

[3]Molitch ME, DeFronzo RA, Franz MA, et al.Diabeticnephropathy. Diabetes Care 23: S69-S73, 2000.

[4]Navarro JF, Mora C, Muros M, Garcia J.Urinarytumournecrosisfactor-αexcretionindependentlycorrelateswithclinicalmarkersofglomerularandtubulointerstitialinjuryintype2diabeticpatients. Nephrol Dial Transplant 21: 3428- 3434, 2006.

[5]Wu J, Ding Y, Zhu C, et al.UrinaryTNF-αandNGALarecorrelatedwiththeprogressionofnephropathyinpatientswithtype2diabetes. Exp Ther Med 6(6): 1482-1488, 2013.

(編輯 文新梅)

Influence of Tumor Necrosis Factor-α on the Expression of Protein Kinase A and Phosphorylation Level of Renal Thick Ascending Limb of Rat

SUI Hongyu1, LI Ying2, QI Shufang1, JIA Xiuyue1, ZHAO Xiaolian1*

(1.Department of Physiology of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2.First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Objective: To study the effect of TNF-α on the protein expression of PKA and phosphorylation level in the thick ascending limb. Methods: The TNF-α was placed into the tissue of TAL for five minutes to observe the protein expression of PKA and phosphorylation level by using Western blot technique. Results: TNF-α did not change the protein expression of PKA and phosphorylation level in the thick ascending limb (P﹥0.05). Conclusion: The TNF-α can not change the protein expression of PKA and phosphorylation level.

tumor necrosis factor-α; thick ascending limb; protein kinase A

2016-01-05

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助課題。課題名稱：TNF-α對(duì)大鼠腎髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道急性效應(yīng)的研究；編號(hào)：12541803；主持人：隋洪玉。

隋洪玉(1976—)，女。佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，副教授，博士。主要研究方向：腎臟生理。

趙曉蓮(1966—)，女。佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，教授，碩士。主要研究方向：糖尿病發(fā)病機(jī)制及預(yù)防。

R-33

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1672-0601(2017)02-0108-03