水通道蛋白在小鼠小腸中的表達和定位

張 迪 , 張凱琦 , 蘇維恒 , 趙 元 , 馬 馨 , 龔 倩 , 曲桂娟 ， 馬紅霞

(1.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118； 2.吉林大學生命科學學院，吉林長春130012)

水通道蛋白在小鼠小腸中的表達和定位

張 迪1, 張凱琦1, 蘇維恒2, 趙 元1, 馬 馨1, 龔 倩1, 曲桂娟1， 馬紅霞1

(1.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118； 2.吉林大學生命科學學院，吉林長春130012)

探明水通道蛋白在小鼠小腸中的表達及定位，為研究小腸水轉運過程中的細胞和分子機制奠定理論基礎。本文運用RT-PCR和免疫印跡技術檢測小鼠十二指腸、空腸和回腸中水通道蛋白的表達情況，結果顯示，AQP3在小鼠空腸中存在基因和蛋白表達，AQP4在小鼠回腸中存在基因和蛋白表達。為進一步明確這兩種水通道蛋白在小腸中的表達位置，通過免疫組織化學的方法進一步證實AQP3主要表達在小鼠空腸黏膜上皮細胞，而AQP4主要表達在小鼠回腸隱窩細胞基底膜。

水通道蛋白 ； 小腸 ； 小鼠 ； 水轉運

腸道是機體重要的水鹽代謝器官，人體每天大約有9 L液體進入到消化道中，其中2 L來自日常飲食，另外7 L則來自于唾液腺、胃腺、胰腺、小腸腺以及肝細胞分泌的膽汁等消化液。這9 L液體84%被小腸吸收，16%被結腸吸收，僅有100～200 mL的水隨著糞便排出體外[1]。由此可見，小腸對水的轉運在維持機體水鹽平衡中發(fā)揮著重要作用。而水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是廣泛存在于原核和真核細胞膜上快速轉運水分子的特異性孔道蛋白,在機體許多器官的體液轉運過程中發(fā)揮重要作用[2]。以往對腸道中水通道蛋白的研究主要集中在人和大鼠的結腸[3-4]，而對小鼠小腸中水通道的表達和功能研究卻確鮮有報道。本文通過RT-PCR、免疫印跡和免疫組織化學等方法，明確了小鼠小腸水通道蛋白的表達類型及表達位置，為進一步揭示水通道蛋白在小腸水轉運過程中的作用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 成年雄性昆明系小鼠，平均體重20g±3g，由吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心提供(動物許可證編號：SCXK2007-0003)?？俁NA提取試劑盒，購自于TaKaRa公司；SuperScriptTMII逆轉錄試劑盒及Taq酶，購自Invitrogen公司；兔抗小鼠AQP3和AQP4抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(HRP-Goat Anti-rabbit IgG)，購自Sigma公司；免疫組化試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 分別取小鼠十二指腸、空腸、回腸各段組織，用高速勻漿器進行勻漿，按照TaKaRa公司Total RNA提取試劑盒提取總RNA。1%非變性瓊脂糖凝膠電泳后，經溴化乙錠染色，凝膠成相儀掃描后觀察結果，根據(jù)28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA的亮度評價RNA是否有降解。測量其OD值并記錄RNA濃度。用Invitrogen的SuperScriptTMII逆轉錄試劑盒合成cDNA。

1.2.2 RT-PCR 根據(jù)GenBank中公布的小鼠AQPs基因序列，選擇其保守區(qū)利用Peimer5.0軟件進行引物設計。其特異性引物用Invitrogen的SuperScriptTMII試劑盒，按說明書提供的方法進行總RNA的逆轉錄反應合成cDNA。以此cDNA為模板，用小鼠AQPs特異性引物對cDNA進行PCR擴增，擴增產物約為300 bp～500 bp大小的片段。反應體系均為25 μL，PCR 擴增條件如下:94 ℃ 預變性5 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃延伸50 s,35個循環(huán)。循環(huán)結束后在72 ℃反應10 min，RT-PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗。

1.2.3 Western Blot 分別取小鼠十二指腸、空腸、回腸組織放入勻漿器中，加入1.5 mL蛋白裂解液，置冰上玻璃勻漿10 min，12 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清，超聲6次(5 s/次，間隔冷卻10 s)，再以12 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?2%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。濕轉法將蛋白轉到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TTBS (20 mmol/L Tirs, pH值7.6,0.2 mol/L NaCl,0.1% Tween-20)50 mL室溫封閉膜1 h，再用TTBS洗膜3次，每次10 min。然后加入一抗(分別為兔抗鼠AQP3抗體1∶1 000，兔抗鼠AQP4抗體1∶1 000，兔抗鼠β-actin 抗體1∶500)，4 ℃下孵育過夜。用TTBS緩沖液洗膜3次，每次10 min。以HRP標記二抗(羊抗兔1∶5 000)室溫下孵育1 h，洗滌條件同上。雜交膜用ECL化學發(fā)光試劑于暗室中顯影并感光膠片。

1.2.4 免疫組織化學 4%多聚甲醛灌注小鼠，取小鼠空腸和回腸各約2 cm，繼續(xù)用4%多聚甲醛固定標本24 h，石蠟包埋，6 μm連續(xù)切片。經二甲苯脫蠟、梯度乙醇再水化后，置入10 mmol/L 檸檬酸緩沖液(pH值6.0)微波修復抗原5 min，室溫冷卻，PBS漂洗。10%非免疫羊血清封閉2 h，分別用兔抗小鼠AQP3(1∶500稀釋)、AQP4抗體(1∶500稀釋)置于濕盒內4 ℃孵育過夜。多次沖洗后，加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG室溫孵育15 min，PBS漂洗3次，DAB顯色，光學顯微鏡下觀察并拍照，棕黃色顆粒為陽性結果。

2 試驗結果

2.1 總RNA質量分析 如圖1所示，分別從小鼠十二指腸、空腸和回腸組織中提取總RNA，用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。電泳結果顯示，28S、18S和5S三條泳帶均清晰、完整，且其亮度比基本符合2∶1，表明所提取的RNA未降解。測定并計算260 nm和280 nm紫外光吸收值OD260/OD280=1.9，表明提取的RNA純度較高，質量可靠，可用于進行RT-PCR試驗。

圖1 總RNA凝膠電泳圖

a:十二指腸； b：空腸； c：回腸

2.2 RT-PCR 檢測小鼠小腸各段AQPs基因的表達

應用小鼠AQPs特異性引物對十二指腸、空腸和回腸組織進行 RT-PCR分析，以β-actin為內參，結果如圖2所示，小鼠的空腸段存在AQP3基因表達，小鼠的回腸段存在AQP4基因表達。而小鼠的十二指腸段,沒有檢測到水通道蛋白基因的表達。

圖2 RT-PCR檢測 AQPs基因在小鼠十二指腸、空腸、回腸中的表達

M：DL-2 000 Marker； A：β-actin為內參；O：AQPO; 1:AQP1; 2:AQP2; 3:AQP3; 4:AQP4; 5:AQP5; 6:AQP6; 7:AQP7; 8:AQP8; 9:AQP9; 10:AQP10; 11:AQP11; 12:AQP12

2.3 Western Blot檢測水通道蛋白AQP3和AQP4的表達 RT-PCR檢測的結果表明，AQP3和AQP4基因分別在小鼠空腸和回腸中表達。為進一步明確這AQP3和AQP4在蛋白水平的表達情況，我們應用Western Blot方法分別檢測了AQP3和AQP4在十二指腸、空腸和回腸中的表達情況。結果如圖3所示，空腸中存在AQP3的蛋白表達，而回腸中存在AQP4的蛋白表達，這與之前RT-PCR的結果一致。

圖3 Western Blot 檢測AQP3和AQP4蛋白在小鼠十二指腸、空腸、回腸中的表達

2.4 AQP3和AQP4在小鼠小腸中的定位 通過Western Blot檢測已知，AQP3在小鼠空腸中存在蛋白表達，AQP4在小鼠回腸中存在蛋白表達。為進一步確定其表達的位置，我們進行了免疫組織化學分析。結果如圖4所示，AQP3蛋白主要表達于小鼠空腸黏膜上皮細胞(圖4.A)，而AQP4蛋白主要表達于小鼠回腸隱窩細胞基底膜(圖4.B)。

圖4 免疫組織化學檢測水通道蛋白在小鼠小腸的表達分布(100x)

3 討論

小腸對水的轉運主要通過兩種途徑：第一種為旁細胞途徑，即水是通過細胞的緊密連接，進入細胞間隙，然后再轉入血液；另外一種為跨細胞途徑,即水通過絨毛柱狀上皮細胞的腔膜面進入細胞內，再通過細胞基底膜或側面膜進入血液[5-6]。這兩種途徑不是完全孤立的，是相互聯(lián)系、互為補充的。傳統(tǒng)觀點認為，消化道對水的轉運主要是通過旁細胞途徑完成的，即使是通過旁細胞途徑進行轉運，水也必須通過小腸上皮細胞的基底膜和毛細血管膜才能進入到血液中[7-8]。因此,水的跨細胞膜轉運是影響小腸水轉運功能的關鍵,而水通道蛋白在水的跨細胞膜轉運過程中發(fā)揮著重要作用。

以往對于水通道蛋白在小腸上的表達及功能研究主要集中在人和大鼠，而對其在小鼠小腸中的表達和功能研究卻鮮有研究。我們的試驗結果表明，AQP3主要表達于小鼠空腸黏膜上皮細胞，而黏膜上皮細胞的主要功能是吸收被分解的營養(yǎng)物質(包括水的吸收)，也稱吸收細胞。2003年Tomoyuki 等人將大鼠的大部分小腸切除，僅保留部分空腸和結腸，手術7 d后檢測剩余部分小腸水通道的表達量，結果發(fā)現(xiàn)AQP3的表達量明顯升高[9]。2011年Nobutomo等人報道，在MgSO4引起的滲透性腹瀉大鼠模型腸道上皮細胞中，AQP3的表達量顯著增加。其原因主要是因為當腸道內容物滲透壓升高時，降低腸道上皮細胞對水的吸收量，機體會代償性的引起水通道表達的增加，以增強機體對水的吸收功能[10]。2013年Zhao等人證實，三硝基苯磺酸(TNBS)誘導機體產生的炎癥因子使得小腸上皮細胞AQP3的表達量下降，從而降低了小腸對水的吸收能力，引起腹瀉[11]。由此可見，AQP3表達在小鼠空腸黏膜上皮細胞中，可能主要與空腸對水的吸收有關。

2002年Hamabata等人用人小腸 AQP4 轉染非洲爪蟾卵母細胞,然后用霍亂毒素(CT)處理這些細胞,發(fā)現(xiàn)其 AQP4表達明顯上調,對水的通透性增加了85 %左右,這說明 AQP4 可能是CT引起分泌性腹瀉時作用的靶蛋白[12]。2014年Jiang等人在豚鼠胃壁細胞中發(fā)現(xiàn)了AQP4的表達，而壁細胞的主要功能就是分泌胃酸，因此他們推測AQP4的表達可能與壁細胞的分泌功能有關[13]。我們的試驗結果也證實，AQP4主要表達在小鼠回腸隱窩細胞中，而隱窩細胞主要是執(zhí)行腺體的分泌功能，又稱分泌細胞。由此我們推測，AQP4在回腸中的表達可能與小腸隱窩的分泌功能有關，但其具體功能還有待進一步研究證實。

總之，小腸是機體中僅次于腎臟的第二大液體轉運器官，在維持機體水鹽平衡中發(fā)揮著重要作用，而水通道蛋白在機體的液體轉運過程中發(fā)揮著不可替代的作用。我們的研究進一步明確了小鼠小腸各段水通道蛋白的表達及分布情況，為揭示小腸水轉運的機制提供理論基礎，也為小腸水轉運障礙相關疾病(如腹瀉等)的治療提供了新的藥物靶點。

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Expression and Localization ofAquaporins in small intestine of mice

ZHANG Di1, ZHANG Kai-qi1, SU Wei-heng2, ZHAO Yuan1, MA Xin1, GONG Qian1, QU Gui-juan1, MA Hong-xia1

(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China； 2.School of Life Science, Jilin University, Changchun 130012,China)

The aim of this study is to ascertain the expression and localization of Aquaporins(AQPs) in small intestine of mice, and provide information for the functional studies of water transport in small intestine. The expression of AQP3 and AQP4 was detected by reverse transcription PCR(RT-PCR) and Western Blot analysis. The results indicated that the expression of AQP3 was detected in jejunum, and the expression of AQP4 was detected in ileum. The expression of AQP3 was located in intestinal epithelial cells, and AQP4 was located in intestinal crypt cells by immunohistochemistry.

Aquaporin (AQP)； Small intestine； Mice； Water transport Corresponding author：MA Hong-xia

2016-08-01

國家自然科學基金青年科學基金項目(31402205)

張迪 (1980-)，男，講師，博士，從事細胞膜的結構與功能方面的研究，E-mail：zhangdi@jlau.edu.cn

馬紅霞，E-mail:hongxia0731001@163.com

S852

A

0529-6005(2017)03-0105-03