三重?zé)晒釶CR檢測食源性致病菌方法的建立與初步應(yīng)用

謝海燕 ， 蔡奕琪 ， 張端秀 ， 徐振娜 ， 洪偉彬

(東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞 523086)

三重?zé)晒釶CR檢測食源性致病菌方法的建立與初步應(yīng)用

謝海燕 ， 蔡奕琪 ， 張端秀 ， 徐振娜 ， 洪偉彬

(東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞 523086)

根據(jù)大腸桿菌 O157的rfbE基因、志賀腸桿菌ipaH基因、單增李斯特桿菌hlyA基因的保守序列，設(shè)計(jì)引物和探針，通過優(yōu)化反應(yīng)體系，測定其靈敏度、特異性和重復(fù)性，建立了可同時(shí)檢測上述3種食源性致病菌的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌進(jìn)行3聯(lián)擴(kuò)增的相對靈敏度檢測限分別為5×102、5×102和5×103CFU/mL；對10株標(biāo)準(zhǔn)/參考菌株的檢測結(jié)果，只有目的菌株呈陽性反應(yīng)；用該方法檢測26份凍肉樣品，與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定法結(jié)果一致，說明研究建立的方法是鑒定3種食源性致病菌的有效方法。

大腸桿菌 O157 ； 志賀氏腸桿菌 ； 單增李斯特桿菌 ； 三重?zé)晒釶CR ； 方法建立 ； 初步應(yīng)用

在我國食源性細(xì)菌污染嚴(yán)重，統(tǒng)計(jì)資料表明，我國在1992—2001 年間發(fā)生的食物中毒病例中， 細(xì)菌性食物中毒所占比例高達(dá)50.9%。人獸共患致病菌已成為重要的公共衛(wèi)生問題。而大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌是國內(nèi)重要而常見的食源性人獸共患致病菌。這3種人獸共患致病菌危害嚴(yán)重，會(huì)對畜牧業(yè)、出口等造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，也會(huì)通過污染的動(dòng)物源性食品感染人類，導(dǎo)致食物中毒、敗血癥、尿毒癥等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。目前，國內(nèi)外檢測這3種致病菌方法很多，有膠體金免疫層析檢測試紙條方法[1]、酶聯(lián)免疫吸附法[2]、免疫磁珠法[3-4]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[5-6]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)[7]、基因芯片技術(shù)[8]等，但這些方法都不能同時(shí)具備快速、特異、靈敏、經(jīng)濟(jì)、簡便等優(yōu)點(diǎn)而未得到推廣。

為了建立一種簡便、敏感、準(zhǔn)確可靠的快速檢測方法，通過反復(fù)試驗(yàn)，建立了大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌三重?zé)晒釶CR檢測方法，適用于大批量的樣本檢測、突發(fā)疫情診斷和食品安全檢測，對公共安全具有較大的意義。

1 材料

1.1 試劑與耗材 DNA提取試劑盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit，由美國OMEGA公司生產(chǎn)； real time PCR試劑，由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要儀器 7500 Real Time PCR System，美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)；Sigma 3-18 K小型高速冰凍臺(tái)式離心機(jī)，德國Sartorius公司生產(chǎn)；NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer 紫外分光光度計(jì)，美國 NanoDrop Technologies 公司生產(chǎn)。

1.3 菌種 大腸桿菌O157:H7(CICC21530)、志賀腸桿菌(CICC21534)、單增李斯特桿菌(CICC21633)、沙門菌(CICC21513)標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供；金黃色葡萄球菌、致病性鏈球菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、普通變形桿菌、銅綠假單胞桿菌等菌株由珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室提供。

表1 3種致病菌的引物和探針序列

2 方法

2.1 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中公布的大腸桿菌O157的O抗原rfbE基因、志賀腸桿菌ipaH基因、單增李斯特桿菌的毒力標(biāo)志基因hlyA基因，利用生物學(xué)軟件Clustal X比對后在高度保守區(qū)域用Primer Express 2.0設(shè)計(jì)一套熒光PCR引物、探針，由上海輝睿生物科技有限公司合成。2.2 模板DNA的制備 采用水煮裂解法:3種菌種在營養(yǎng)瓊脂純化分離后，挑取單個(gè)菌落接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)，參照國標(biāo)法 (GB/T4789. 2-2003) 對菌株進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，均配制成107CFU/ mL濃度的菌液。取1 mL于1.5 mL EP 管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用滅菌ddH2O洗滌2次，12 000 r / min 離心5 min，棄上清后加入100 μL滅菌ddH2O，漩渦混勻，封口膜封口，水浴煮沸10 min，置-20 ℃ 10 min，取出溶解，漩渦混合器震蕩破碎細(xì)菌釋放核酸，12 000 r / min 離心 5 min，取上清作為檢測模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的優(yōu)化 將各致病菌增菌培養(yǎng)后，分別提取DNA為模板，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL： 2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL， DNA模板5 μL，以上下游引物各0.4、0.5、0.6 μL(10 μmol/L)，探針各0.4、0.5、0.6 μL(10 μmol/L)進(jìn)行組合優(yōu)選，反應(yīng)程序： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，50-58 ℃ 40 s(收集熒光信號)，25、30、35、40、45、50個(gè)循環(huán)進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)參數(shù)。

2.4 特異性試驗(yàn) 將大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、李斯特桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、致病性鏈球菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、普通變形桿菌、銅綠假單胞桿菌等10種菌株增菌培養(yǎng)后的菌液為模板，使用2.3建立中的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證所建立的熒光PCR方法的特異性。

2.5 敏感性試驗(yàn) 取已配制成5×107CFU/mL 濃度的大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、李斯特桿菌菌液 1 mL，用水煮裂解法提取 DNA 作為模板，進(jìn)行10倍比梯度稀釋。同樣使用2.3中建立的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行單一、三聯(lián)組合的檢測擴(kuò)增，驗(yàn)證所建立的熒光PCR方法的敏感性。

2.6 應(yīng)用于臨床樣品檢測 從東莞市某農(nóng)批市場采集26份凍肉樣品，其中豬肉8份、羊肉3份、牛肉4份、雞肉6份、鴨肉5份，用建立的三重?zé)晒釶CR方法進(jìn)行檢測。同時(shí)用相應(yīng)國標(biāo)法(GB/T 4789.36-2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌0157:H7/NM 檢驗(yàn)、GB 4789.5-2012食品微生物學(xué)檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)、GB 4789.30-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn))進(jìn)行驗(yàn)證。

3 結(jié)果與分析

3.1 三重?zé)晒釶CR方法的建立 最終建立的反應(yīng)體系為：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，探針各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA模板為5 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)程序： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 40 s(收集熒光信號)，40個(gè)循環(huán)。3.2 特異性結(jié)果 對抽提的10種細(xì)菌的基因組DNA，利用建立的熒光定量PCR體系進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，建立的檢測方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌檢測為陽性，其他7株菌株均為陰性，說明該方法具有較好的檢測特異性。

圖1 三重?zé)晒釶CR特異性擴(kuò)增結(jié)果

1：大腸桿菌O157擴(kuò)增曲線； 2：志賀腸桿菌擴(kuò)增曲線； 3：單增李斯特桿菌擴(kuò)增曲線

3.3 敏感性結(jié)果 所建立的三重?zé)晒?PCR方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌進(jìn)行單一擴(kuò)增的相對靈敏度檢測限分別為5×101、5×101和5×103CFU/ mL，進(jìn)行三聯(lián)擴(kuò)增的相對靈敏度檢測限分別為5×102、5×102和5×103CFU/mL。具體結(jié)果見圖2。

圖2 大腸桿菌O157靈敏度擴(kuò)增曲線

圖3 志賀腸桿菌靈敏度擴(kuò)增曲線

圖4 單增李斯特菌靈敏度擴(kuò)增曲線

圖5 3種菌濃度均為5×103CFU/mL時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果

圖6 3種菌濃度均為5×102 CFU/mL時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果

3.4 臨床樣品檢測 建立的熒光PCR方法對26份凍肉樣品進(jìn)行大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌檢測，結(jié)果1份雞肉樣品與1份豬肉樣品檢測為大腸桿菌O157陽性，陽性率11.53%；1份牛肉樣品中檢測出志賀腸桿菌，1份豬肉樣品中檢測出單增李斯特桿菌。未發(fā)現(xiàn)混合感染。國標(biāo)法結(jié)果與熒光PCR方法一致，符合率100%。說明該方法準(zhǔn)確可靠，可以廣泛應(yīng)用于臨床樣品檢測。

4 討論

4.1 與相應(yīng)國標(biāo)檢測方法比較，建立的三重?zé)晒釶CR方法可以特異地檢測食源性致病菌：大腸桿菌O157、志賀腸桿菌與單增李斯特桿菌。不但檢測所需時(shí)間短，減少了工作量，檢測成本低，一份樣品檢測其中一種細(xì)菌的費(fèi)用比之前少了50元左右，更經(jīng)濟(jì)，更省力。因此，具有廣泛的應(yīng)用前景。

4.2 建立的方法是針對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、李斯特桿菌等威脅仔豬健康的、引起癥狀相似的重要細(xì)菌，常以混合感染的形式出現(xiàn)，診斷困難。三重?zé)晒釶CR檢測方法可為政府和養(yǎng)殖戶快速、及時(shí)的合理處理動(dòng)物疫病提供技術(shù)保障。

4.3 大腸桿菌 O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌等被公認(rèn)是主要的食源性人獸共患致病菌。我國已先后在江蘇、山東、河南、安徽、北京等10幾個(gè)省市發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7 感染的散發(fā)病例。1999-2000年，蘇、皖、豫地區(qū)大規(guī)模流行大腸桿菌O157∶H7，造成急性腎功能衰竭患者195 人，死亡177人，病死率達(dá)90.8%[9]。食品污染志賀腸桿菌的情況也不容樂觀。2003-2004年廣西6類食品中志賀腸桿菌檢出率為1.45%[10]。單核細(xì)胞李斯特菌則可引起以腦膜炎、腦炎、敗血癥等，死亡率高達(dá)30%～70%。目前該菌在美國已成為由食物污染引起死亡的四大病原菌之一。近年來我國也有關(guān)于此菌對食品污染的[11]。食品安全極為重要，我國暴發(fā)的食源性疾病嚴(yán)重危害著消費(fèi)者的身體健康,并影響消費(fèi)者對食品安全的信心。本方法的建立對保證食品安全，具有重要的公共安全意義 。

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2016-07-07

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020410006)

謝海燕(1976-)，女，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物疫病防控分析、技術(shù)推廣及管理，E-mail：xhy402@hotmail.com

S855.9+9

B

0529-6005(2017)03-0086-03