小反芻獸疫實(shí)驗(yàn)室診斷

王 琦 ， 吳 燕 ， 程振濤 ， 李 濤

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州貴陽(yáng)550025 ； 2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 貴州貴陽(yáng)550008)

小反芻獸疫實(shí)驗(yàn)室診斷

王 琦1， 吳 燕1， 程振濤1， 李 濤2

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州貴陽(yáng)550025 ； 2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 貴州貴陽(yáng)550008)

為了對(duì)小反芻獸疫疑似病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確診，采集疑似小反芻獸疫病羊材料，用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法以及一步法RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，并針對(duì)小反芻獸疫N基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增N基因并進(jìn)行克隆測(cè)序及序列分析。試驗(yàn)結(jié)果可見，疑似小反芻獸疫病羊臨床剖檢表現(xiàn)為胃腸道及肺部出現(xiàn)壞死，腸道出現(xiàn)線狀出血。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和一步法RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示均為小反芻獸疫病毒(PPRV)核酸陽(yáng)性。N基因測(cè)序結(jié)果China-GZ株與小反芻獸疫4個(gè)支系毒株序列比對(duì)顯示，核苷酸同源性為89.0%～97.3%。本試驗(yàn)通過臨床癥狀表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)診斷確診該病例為小反芻獸疫病毒感染所致。

小反芻獸疫 ； 剖檢病變 ； RT-PCR ；N基因

小反芻獸疫(PPR)是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性、烈性傳染病。該病自1942年首次在西非象牙海岸的科特迪瓦發(fā)現(xiàn)后，一直呈擴(kuò)散趨勢(shì)，目前全球有40多個(gè)國(guó)家已報(bào)告發(fā)生該疫情[1]。該病主要以高稽留熱、眼鼻分泌物增多、壞死性口炎、肺炎、腹瀉為主要特征[2]。主要感染山羊與綿羊，其中山羊比綿羊更易感。2007年，我國(guó)西藏首次暴發(fā)小反芻獸疫疫情[3]。自2013年11月份起，我國(guó)多省陸續(xù)暴發(fā)小反芻獸疫疫情，貴州省小反芻獸疫疫情也十分嚴(yán)峻。目前針對(duì)本病現(xiàn)在尚無(wú)有效的治療方法。對(duì)本病綜合防控依賴于臨床病例的快速診斷、果斷處置，同時(shí)亦應(yīng)及時(shí)明確各地小反芻獸疫流行毒株分子特征，為疫苗防控奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)通過對(duì)臨床疑似小反芻獸疫山羊病例進(jìn)行剖檢病變觀察及樣本采集，并利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法和本實(shí)驗(yàn)室建立一步法RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)該病例進(jìn)行確診。并對(duì)小反芻獸疫病毒本地流行株保守基因N基因進(jìn)行克隆、測(cè)序及序列分析，為貴州省小反芻獸疫病例快速處置及綜合防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料 疑似病羊材料采集自貴州省六盤水市某養(yǎng)羊場(chǎng)。

1.2 載體與試劑 pMD-19T載體，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；小反芻獸疫實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒、E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit 膠回收、E.Z.N.A.TMPlasmid Kit 質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega公司；DNA限制性內(nèi)切酶SalⅠ和KpnⅠ，均購(gòu)自Thermo公司；DNA Marker DL-2 000，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3 方法

1.3.1 臨床病例觀察與樣本采集 按照重大疫病樣本采集與病例處置要求，對(duì)臨床病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查與剖檢病變觀察，并采集肺、糞便等樣本，以備實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè) 提取疑似病例樣本總RNA為模板，用北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司小反芻獸疫實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)(批號(hào)：PPR20150404P)。試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立；被檢樣品Ct值≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為小反芻獸疫病毒陽(yáng)性；被檢樣品30

1.3.4 N基因的克隆與序列分析

1.3.4.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank所登錄的小反芻獸疫病毒N基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，PPRV-N-F：5′-ATGGCGACTCTTCTTAAAAG-3′，PPRV-N-R：5′-CTAGCCGAGGAGATCCTTGT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 578 bp，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，稀釋引物至20 pmol/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 目的片段的擴(kuò)增 提取臨床疑似病例組織樣本總RNA為模板，用引物PPRV-N-F/ PPRV-N-R進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。采用50 μL反應(yīng)體系： RNA模板1 μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2 μL，2×1 step Buffer 25 μL，上下游引物各1 μL，RNase Free dH2O 20 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

1.3.4.3 目的片段的克隆 用膠回收試劑盒純化RT-PCR產(chǎn)物，按照pMD19-T載體試劑盒說明書將回收目的基因片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，應(yīng)用PCR及SalⅠ/KpnⅠ雙酶切(酶切體系:質(zhì)粒DNA 9 μL，SalⅠ 4μL，KpnⅠ 2 μL，Buffer Tango 7 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至30 μL)技術(shù)篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

1.3.4.4 測(cè)序、序列分析 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank上PPRV 4個(gè)支系毒株N基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 疑似病例臨床表現(xiàn)觀察 送檢病羊出現(xiàn)口鼻分泌液增加、牙齦充血、口腔糜爛、咳嗽、腹瀉等癥狀，臨床診斷疑似小反芻獸疫。剖檢后發(fā)現(xiàn)病羊胸腔有炎性滲出液蓄積及肺部出現(xiàn)不同程度的壞死，其他主要表現(xiàn)為肝臟及脾臟、淋巴結(jié)腫大，腸道出現(xiàn)線狀出血。

2.2 疑似病例FQ RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 疑似病例組織樣本總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，結(jié)果見圖2。根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定，由圖1可見，陽(yáng)性對(duì)照Ct值為17.40<30.00并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立。臨床樣本1和2Ct值分別為18.09和23.94，均小于30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，故判定為小反芻獸疫病毒核酸陽(yáng)性。

圖1 小反芻獸疫病毒RNA的擴(kuò)增曲線

+：陽(yáng)性對(duì)照； 1-2：臨床樣本； -：陰性對(duì)照

2.3 疑似病例普通RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 為進(jìn)一步確診，對(duì)疑似病例材料總RNA進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖2。由圖2可見，臨床疑似樣本擴(kuò)增出大小約447 bp的核酸條帶，與陽(yáng)性對(duì)照大小相同，判斷為疑似病例小反芻獸疫病毒核酸陽(yáng)性。

圖2 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

M：DL2000 DNA Marker；+：陽(yáng)性對(duì)照；1-2：臨床樣本；-：陰性對(duì)照

2.4N基因克隆 應(yīng)用所設(shè)計(jì)N基因引物對(duì)其中1份疑似病例樣本總RNA進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，樣本中擴(kuò)增出大小約1 578 bp目的條帶，與預(yù)期擴(kuò)增大小相符。將膠回收純化后的目的片段連接至pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和SalⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果見圖3和圖4。由圖3可見，重組質(zhì)粒中PCR擴(kuò)增出約1 578 bp的目的條帶；由圖5可見重組質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ/KpnⅠ雙酶切可獲得與目的條帶大小相同的目的片段，證明目的基因片段成功克隆到pMD19-T載體。

圖3 重組質(zhì)粒PCR鑒定

M： DL-2 000 DNA Marker； 1～3： 重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物

圖4 重組質(zhì)粒酶切鑒定

M： DL-2 000 DNA Marker； 1～3： 陽(yáng)性重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物； 4： 重組質(zhì)粒對(duì)照

2.5N基因測(cè)序結(jié)果 將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果得到大小為1 578 bp的目的基因序列，暫命名為China-GZ株。

2.6N基因與PPR不同支系核苷酸比對(duì)分析 將China-GZ株序列與小反芻獸疫4個(gè)支系毒株序列進(jìn)行對(duì)比顯示(圖5)：China-GZ株與4個(gè)支系毒株核苷酸同源性分別為93.2%，92.7%，89.0%和97.3%，初步斷定本次病例流行毒株小反芻獸疫病毒Ⅳ系。

圖5 核苷酸同源性比對(duì)分析

3 討論

2013年以來，我國(guó)多個(gè)省份均出現(xiàn)小反芻獸疫疫情，小反芻獸疫的防控迫在眉睫。對(duì)臨床病例的快速診斷是防控小反芻獸疫的關(guān)鍵技術(shù)之一，針對(duì)小反芻獸疫病原的診斷方法包括免疫學(xué)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。免疫學(xué)檢測(cè)方法包括瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)、瓊脂凝膠沉淀試驗(yàn)(AGPT)、對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)(CIE)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等[4]，但相對(duì)于這些檢測(cè)方法，分子診斷技術(shù)中的PCR方法更加靈敏[5]。目前針對(duì)PPRV診斷技術(shù)建立可見基于PPRVN、F、M基因設(shè)計(jì)引物[6-8]。方法可分為普通RT-PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法更敏感，而普通RT-PCR檢測(cè)結(jié)果更直觀。本試驗(yàn)根據(jù)病羊臨床表現(xiàn)為口鼻分泌液增加、口腔糜爛、咳嗽、腹瀉等癥狀，剖檢病羊胸腔存在炎性滲出液蓄積，胃腸道及肺部出現(xiàn)不同程度的壞死，肝臟及脾臟、淋巴結(jié)腫大，腸道出現(xiàn)線狀出血，與王光祥等[9]觀察到的小反芻獸疫病變相似，初步懷疑為小反芻獸病毒感染。為做出確切性診斷，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)和普通一步法RT-PCR技術(shù)對(duì)上述疑似病例進(jìn)行分子生物學(xué)診斷，兩種方法均顯示臨床疑似小反芻獸疫病例組織樣本中存在PPRV核酸?？沙醪脚卸ú±嬖谛》雌c獸疫病毒感染。

小反芻獸疫防控采取凈化與疫苗免疫相結(jié)合的方式進(jìn)行[10]，隨著山羊交易與引種的頻繁發(fā)生，疫苗免疫仍是健康羊群的有效保護(hù)手段。疫苗免疫對(duì)疫病防控能否成功建立在病原種類、分子特征是否一致的基礎(chǔ)之上。小反芻獸疫基因組包括N基因、P基因、M基因、F基因、H基因和L基因，其中編碼核蛋白的N基因在麻疹病毒屬的基因組中是非常保守的，目前小反芻獸疫的ELISA、PCR等檢測(cè)方法多數(shù)都是以N基因?yàn)榛A(chǔ)建立的[11]。N基因所編碼的N蛋白是PPRV中最豐富且免疫原性最強(qiáng)的蛋白[12]，動(dòng)物機(jī)體感染以后能夠引起其機(jī)體產(chǎn)生高滴度抗體，此類抗體雖然不能中和病毒，但是具有重要的診斷意義[13]。為進(jìn)一步確診本次臨床病例和了解PPRV本地流行株分子特征，本試驗(yàn)選取PPRVN基因進(jìn)行克隆及測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與小反芻獸疫四個(gè)支系毒株進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果可見，PPRV本地流行株與4個(gè)支系毒株核苷酸同源性高達(dá)89.0%～97.3%，證明擴(kuò)增出的基因?yàn)镻PRVN基因。同時(shí)分析結(jié)果顯示，China-GZ株與疫苗株Nigeria 75-1株核苷酸同源性為93.2%，而與第四支系毒株India株同源性高達(dá)97.3%，提示本地流行株可能與India株同屬小反芻獸疫第四支系，與疫苗株屬于不同支系。研究結(jié)果為貴州省小反芻獸疫綜合防控奠定基礎(chǔ)。

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2015-10-15

貴州省科技合作項(xiàng)目(黔科合LH字[2015]7674號(hào))；省州科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目 (黔西南科合[2012]5號(hào))；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(黔科合人才團(tuán)隊(duì)[2015]4016號(hào)

王琦(1991-)，女，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail:862708743@qq.com

程振濤， E-mail: chengzhentao@sohu.com；李濤， E-mail: 727670509@qq.com

2.65

A

0529-6005(2017)03-0035-04