姜黃素增強(qiáng)脂多糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制及其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用

周音頻 寧 琳 向立權(quán) 吳永才 楊義航 黎 明

(重慶市涪陵區(qū)中心醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 408000)

姜黃素增強(qiáng)脂多糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制及其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用

周音頻 寧 琳 向立權(quán) 吳永才 楊義航 黎 明

(重慶市涪陵區(qū)中心醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 408000)

目的 探究姜黃素增強(qiáng)脂多糖(LPS)跨血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。方法 采用TER法檢測(cè)姜黃素處理后心肌細(xì)胞通透性的變化，放射法檢測(cè)姜黃素處理的心肌細(xì)胞內(nèi)LPS流出率， Western印跡法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)小窩蛋白(Cav)-1的表達(dá)，qRT-PCR法檢測(cè)姜黃素作用后的小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)層VCAM-1、ICAM-1的基因表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較,不同濃度姜黃素處理后的心肌細(xì)胞單層電阻值逐漸增加；心肌細(xì)胞膜內(nèi)的LPS流出率下降，隨著姜黃素濃度升高，其流出率逐漸降低，與劑量濃度呈負(fù)相關(guān)。與對(duì)照組相比，姜黃素處理后Cav-1蛋白表達(dá)量均下降，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸降低，在藥量濃度范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)。姜黃素處理過(guò)的心肌細(xì)胞內(nèi)VCAM-1、ICAM-1基因表達(dá)量均升高且與姜黃素濃度呈負(fù)相關(guān)，隨著姜黃素藥物作用濃度的升高，VCAM-1、ICAM-1基因表達(dá)量逐漸降低。結(jié)論 姜黃素通過(guò)提高細(xì)胞通透性加強(qiáng)LPS在小鼠心肌內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，并且通過(guò)調(diào)控VCAM-1、ICAM-1基因抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

姜黃素；心肌細(xì)胞；脂多糖;小窩蛋白-1;動(dòng)脈粥樣硬化

姜黃素是從植物Curcuma longa L.中提取到的多酚物質(zhì)，難溶于水，易溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑〔1〕。臨床研究證明，姜黃素在抗腫瘤、治療心血管疾病方面具有良好的效果〔2〕。Chang等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過(guò)抑制MDR1蛋白的表達(dá)可誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞凋亡且對(duì)牙齦的毒性小。趙秀峰等〔4，5〕證實(shí)姜黃素對(duì)小鼠心肌缺血性細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。本文主要對(duì)姜黃素增強(qiáng)脂多糖(LPS)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制及其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料 體重約為150 g的健康小鼠20只由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)；姜黃素由重慶市中藥研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及器材 胎牛血清，Gibco公司；DMEM，Invitrogen公司；胰酶，Thermo Scientific 公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，Gibco公司；MTT，華美公司；兔抗大鼠 p-Caveolin-1、GAPDH 等一抗抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 IgG，北京博勝經(jīng)緯科技有限公司；聚丙烯酰胺、Tris-HCl、NC膜，Amersham公司；EDTA，Amresco公司；Transwell小室，北京優(yōu)尼生物科技有限公司；MERS00002型跨膜細(xì)胞電阻儀，美國(guó)Millipore 公司；SYBRTM Premix Ex TaqⅡ，Takara公司;Bio-Red熒光定量PCR儀，Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 將20只小鼠隨機(jī)分為五組，每組4只。對(duì)照組灌輸生理鹽水，治療組和模型組小鼠提前3 d給予脂多糖(LPS)喂養(yǎng)，治療組分別灌輸姜黃素(0.3 g/L)一倍藥量、兩倍藥量、三倍藥量、四倍藥量，2次/d，5 d后將小鼠用4%水合氯醛麻醉，麻醉后將小鼠解剖取出心臟，迅速置于100 ml PBS溶液中，清洗3次，用無(wú)菌剪刀去除心臟表面的組織血管等，用PBS溶液清洗后，將組織用剪刀剪成1 mm3大小的組織塊放入錐形瓶，加入2 g/L的胰酶置于37℃搖床100 r/min培養(yǎng)30 min，將上層細(xì)胞懸浮液用移液槍吸取后，加入含10%胎牛血清的DEME，混勻后得到心肌細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞貼壁數(shù)目達(dá)到80%時(shí)加入0.5%胰酶溶液進(jìn)行消化，按照1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)的第三代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 采用TER法檢測(cè)姜黃素作用后心肌細(xì)胞通透性的變化 在體外將不同藥量處理后的5組小鼠心肌細(xì)胞接種于DMEM液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)1 d，加入胰酶消化細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1.5×105個(gè)/ml，取100 μl接種于六孔板置于Transwell上室中，上下室內(nèi)均加入500 μl DMEM培養(yǎng)液，上室中細(xì)胞培養(yǎng)分為5組，每組四個(gè)重復(fù)，細(xì)胞培養(yǎng)至單層，用電阻儀檢測(cè)上下室之間的電阻值，觀察細(xì)胞通透性的變化。

1.3.3 放射法檢測(cè)含藥的心肌細(xì)胞的通透性 將體外5組培養(yǎng)生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于加入〔3〕H標(biāo)記LPS的DMEM液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 d待反應(yīng)結(jié)束后加入不含血清DMEM液體培養(yǎng)基漂洗2次，加入含5%BSA的DMEM液體培養(yǎng)基和載體蛋白apoA-I后連續(xù)培養(yǎng)6 h，設(shè)置陰性對(duì)照為不加載體蛋白apoA-I，分別收集上清培養(yǎng)基和破裂細(xì)胞，用0.22 μm的微孔過(guò)濾器過(guò)濾，PBS溶液清洗2次，取上清和裂解細(xì)胞液200 μl，用液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定上清、細(xì)胞及陰性對(duì)照細(xì)胞〔3〕H內(nèi)毒素放射量，內(nèi)毒素的流出率=(上清〔3〕H內(nèi)毒素放射量-陰性對(duì)照量)/(總〔3〕H內(nèi)毒素放射量)。

1.3.4 Western印跡法檢測(cè)小窩蛋白(Cav)-1蛋白的表達(dá) 參照Triton-100細(xì)胞裂解液膜蛋白試劑盒進(jìn)行裂解后細(xì)胞內(nèi)Cav-1蛋白的提取，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，配置8%的分離膠與5%的濃縮膠，蛋白樣品中加入1/2體積的SDS上樣緩沖液，每孔上樣蛋白10 μg，Marker 5 μl，50 V電壓30 min，待指示劑進(jìn)入分離膠后100 V電壓至電泳結(jié)束。以兔抗鼠Cav-1、PKC、P-ERM、ERM抗體作為一抗，4℃過(guò)夜轉(zhuǎn)膜，用PBS-T洗膜4次，按照(1∶5 PBS-T稀釋)加入二抗，室溫下反應(yīng)1 h，用PBS-T洗膜4次。用ELC試劑盒檢測(cè)發(fā)光劑顯影，之后采用凝膠成像儀保存圖像。

1.3.5 qRT-PCR檢測(cè)姜黃素作用后細(xì)胞內(nèi)皮ICAM-1、VCAM-1基因表達(dá) 采取最佳姜黃素處理濃度1.2 g/L灌喂治療組小鼠后提取心肌組織內(nèi)皮RNA，參照RNA試劑盒進(jìn)行操作，參照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)ICAM-1的序列設(shè)計(jì)引物序列：正義:5′-AGGTATCCATCCATCCCACA-3′，反義：5′-AGT-GTCTCATTCCCACGGA-3′；VCAM-1的引物:反義:5′-CGGTCATGGTCAAGTGTTTG-3′，正義:5′-GAGATCCAGGGGAGATGTCA-3′。內(nèi)參β-actin序列：反義:5′-CGTTGACATCCGTAAAGA-3′，正義:5′AGCCACCAATCCACACAG-3′。反應(yīng)體系：SYBRTM Premix Ex TaqⅡ 10 μl，ddH2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA模板1 μl。在Bio-Red熒光定量PCR儀上按照反應(yīng)程序94℃變性3 min；95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃ 20 s；40個(gè)循環(huán)；95℃ 1 min進(jìn)行反應(yīng)，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-ΔΔcq算法進(jìn)行基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行方差分析并繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 TER法檢測(cè)姜黃素作用心肌細(xì)胞后單細(xì)胞層的電阻值 對(duì)照組隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞膜的通透性并未發(fā)生明顯的變化。與對(duì)照組比較，姜黃素處理后的心肌細(xì)胞層的電阻值降低，并且隨著姜黃素濃度增加，細(xì)胞的通透性逐漸升高。見(jiàn)表1。

2.2 放射法檢測(cè)含藥的心肌細(xì)胞〔3〕H LPS流出率 姜黃素作用后的小鼠心肌細(xì)胞膜內(nèi)的LPS流出率與對(duì)照組相比下降；隨著姜黃素濃度的升高，流出率逐漸降低，與劑量濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表1。

組別電阻值TER(Ω,×cm2)流出率(%)對(duì)照組19.21±0.6311.74±0.46模型組31.52±0.397.69±0.570.3g/L姜黃素28.68±0.5410.23±0.741)0.6g/L姜黃素22.59±0.751)12.38±0.651)0.9g/L姜黃素18.52±0.761)14.37±0.362)1.2g/L姜黃素15.27±0.662)16.07±0.262)

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；2)P<0.01

2.3 姜黃素作用后對(duì)心肌細(xì)胞Cav-1蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，姜黃素處理后Cav-1蛋白表達(dá)量均下降，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸降低，在藥量濃度范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)，表明姜黃素處理后轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Cav-1量降低,減少了細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。見(jiàn)圖1。

a:對(duì)照組；b：模型組;c:治療組+0.3 g/L姜黃素;d:治療組+0.6 g/L姜黃素;e：治療組+0.9 g/L姜黃素;f:治療組+1.2 g/L姜黃素；下圖同圖1 姜黃素處理后細(xì)胞膜內(nèi)Cav-1蛋白的表達(dá)

2.4 姜黃素作用后細(xì)胞內(nèi)皮ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)量 與對(duì)照組(1.02±0.82，1.00±0.85)不做任何處理的心肌細(xì)胞對(duì)比，LPS處理過(guò)的心肌細(xì)胞內(nèi)VCAM-1、ICAM-1蛋白表達(dá)量(1.98±0.62,2.34±0.18)均升高，且與姜黃素濃度呈負(fù)相關(guān)；隨著姜黃素藥物作用濃度的升高，VCAM-1、ICAM-1基因和蛋白的表達(dá)量逐漸降低(0.3、0.6、0.9、1.2 g/L姜黃素組分別為1.74±0.15，1.49±0.36；1.25±0.62，1.28±0.14；0.96±0.56，0.89±0.21；0.73±0.17，0.80±0.11)。表明姜黃素可能通過(guò)調(diào)控VCAM-1、ICAM-1基因抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。見(jiàn)圖2。

圖2 姜黃素作用后細(xì)胞內(nèi)皮ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)

3 討 論

姜黃素通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制過(guò)氧化物的產(chǎn)生起到消炎的作用〔6〕。有研究表明姜黃素能夠抑制血管生成，其主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，并且對(duì)血管的抑制具有特異性〔7〕。

體內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，LPS、TNF-α?xí)箖?nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生間隙，細(xì)胞通透性升高〔8〕。本研究通過(guò)TER法檢測(cè)單細(xì)胞層的電阻值，表明心肌細(xì)胞的通透性升高，姜黃素可能通過(guò)增加心肌細(xì)胞的通透性使LPS在內(nèi)皮細(xì)胞膜間運(yùn)輸。TER法(跨膜電阻測(cè)定)一般分為兩種：接觸式與非接觸式培養(yǎng)〔9〕，兩者區(qū)別在于組織內(nèi)皮細(xì)胞和組織細(xì)胞接種于培養(yǎng)室的兩側(cè)，二者之間的細(xì)胞間物質(zhì)是否可以進(jìn)行自由交換〔10〕,接觸式培養(yǎng)主要研究組織細(xì)胞之間的相互作用，非接觸式培養(yǎng)研究細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸，張水華等〔11〕通過(guò)非接觸式培養(yǎng)法測(cè)定血腦屏障模型的TER。TER法關(guān)鍵的技術(shù)操作在于組織細(xì)胞單層細(xì)胞的培養(yǎng)及接種濃度的確定，若非單層細(xì)胞或細(xì)胞濃度過(guò)高，均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果〔12〕。Cav-1是位于胞膜上的凹陷囊狀結(jié)構(gòu)，體內(nèi)廣泛存在，主要參與細(xì)胞增殖、腫瘤、凋亡等生命活動(dòng)〔13〕。已有研究證實(shí)，Cav-1基因沉默會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞通透性增強(qiáng)〔14〕。Jie等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后,Cav-1的表達(dá)升高，從而誘導(dǎo)claudin-5的表達(dá),表現(xiàn)出腦部組織水腫。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明姜黃素通過(guò)抑制Cav-1蛋白的表達(dá)，降低了膜上LPS等大分子的運(yùn)輸，增強(qiáng)細(xì)胞的自我保護(hù)能力，但對(duì)于具體參與抑制Cav-1蛋白的信號(hào)路徑尚未清楚，還需要進(jìn)一步深入研究。

放射性核素標(biāo)記法是檢測(cè)微量物質(zhì)的一種實(shí)驗(yàn)方法，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、作用范圍廣，在醫(yī)學(xué)及生物界廣泛應(yīng)用〔16〕。本實(shí)驗(yàn)表明姜黃素可能是通過(guò)抑制LPS跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。同位素標(biāo)記法實(shí)驗(yàn)也存在局限性：(1)標(biāo)記后的化合物其生化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，(2)輻射后化合物自身分解，(3)標(biāo)記的原子會(huì)因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定發(fā)生移動(dòng)造成實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤〔17〕。因此，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中要控制好放射標(biāo)記物反應(yīng)的時(shí)間。 動(dòng)脈粥樣硬化是常見(jiàn)的心腦血管疾病之一，伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生，尋找新型抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物是當(dāng)前主要任務(wù)〔18〕。姜黃素除了在治療心血管病方面發(fā)揮著重要的作用外，在抑制動(dòng)脈粥樣硬化方面也起到了良好的效果〔19〕。 研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，主要是通過(guò)抑制GTP酶的表達(dá)而起到消炎的作用〔20〕。P 選擇素抑制劑 PSI-697能有效降低小血管表皮白細(xì)胞的聚集，減小表面脂塊的大小，起到消炎及抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用〔21〕。 ICAM-1、VCAM-1基因在動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵重要作用，負(fù)責(zé)血管內(nèi)皮表面白細(xì)胞的遷移、聚集。ICAM-1、VCAM-1基因表達(dá)量升高可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞之間黏附，進(jìn)而在血管表面形成脂塊。本實(shí)驗(yàn)表明姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞表皮ICAM-1、VCAM-1基因的表達(dá)來(lái)抑制炎癥的產(chǎn)生，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生。姜黃素作為良好的心血管、逆腫瘤中藥，具有廉價(jià)、高效、對(duì)人體副作用好，體外實(shí)驗(yàn)誤差小等優(yōu)點(diǎn)。

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〔2016-08-08修回〕

(編輯 郭 菁)

重慶市醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013-1-056)

周音頻(1969-)，男，博士， 副主任醫(yī)師，主要從事心內(nèi)科疾病研究。

R543.5

A

1005-9202(2017)07-1617-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.021