右美托咪定對谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用的影響

李欣明，李松澤，劉洪濤

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽110004）

右美托咪定對谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用的影響

李欣明，李松澤，劉洪濤

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽110004）

目的探討右美托咪定（Dex）對大鼠谷氨酸神經(jīng)毒性作用的影響及其機制。方法采用腦室注射谷氨酸制作大鼠腦谷氨酸神經(jīng)毒性模型，將36只SD大鼠隨機分為對照組（C組）、谷氨酸損傷組（G組，腦室注射谷氨酸）、Dex1組（腦室注射谷氨酸前30 min腹腔注射Dex 50 μg/kg）和Dex2組（腦室注射谷氨酸前30 min腹腔注射Dex 100 μg/kg）。2 h后取腦，分離出右側(cè)海馬組織測定超氧化物歧化酶和丙二醛，剩余腦組織測定腦含水量。另用尼氏染色法檢測神經(jīng)細(xì)胞受損狀態(tài)。結(jié)果Dex1組和Dex2組的腦組織含水量、丙二醛水平比G組明顯降低，超氧化物歧化酶明顯升高。同G組相比，Dex1組、Dex2組海馬尼氏染色結(jié)果顯示神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕明顯。結(jié)論Dex預(yù)處理可以明顯減輕谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，其機制可能是通過增加超氧化物歧化酶，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而拮抗谷氨酸引起的細(xì)胞神經(jīng)毒性作用。

右美托咪定；谷氨酸神經(jīng)毒性；氧化應(yīng)激反應(yīng)

谷氨酸是腦內(nèi)一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛參與大腦神經(jīng)各種活動，但腦組織中過多的谷氨酸則可過度激活谷氨酸受體，造成不同程度的繼發(fā)性損害。谷氨酸神經(jīng)毒性在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)急、慢性疾病中起重要作用，例如阿爾茨海默病、帕金森病、癲癇、缺血性腦卒中、抑郁癥等［1?2］，適當(dāng)調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)中的谷氨酸信號系統(tǒng)的作用，能夠有效控制各種原因所致的神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一種新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動藥，具有良好的鎮(zhèn)靜、催眠、順行性遺忘作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床［3］。基礎(chǔ)實驗研究［4］表明Dex對大腦等機體的重要臟器損傷具有保護作用，在培養(yǎng)的鼠神經(jīng)元中注射谷氨酸鹽誘導(dǎo)神經(jīng)損害，給予Dex能夠顯著減少神經(jīng)損傷［5］，初步證實Dex對谷氨酸神經(jīng)毒性具有顯著的保護作用，但在體實驗還未見報道，本研究擬建立大鼠在體腦谷氨酸神經(jīng)毒性模型，觀察Dex的作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g，由北京華阜康生物科技有限公司提供。Dex購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。L?谷氨酸購于Sigma公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購于南京建成生物技術(shù)公司。尼氏染色液購于碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 實驗分組

健康雄性SD大鼠36只，采用隨機數(shù)字表法隨機分為對照組（C組）、谷氨酸損傷組（G組）、Dex1組（腦室注射谷氨酸前30 min腹腔注射Dex 50 μg/kg）、Dex2組（腦室注射谷氨酸前30 min腹腔注射Dex 100 μg/kg），每組9只。

1.3 動物模型制作

SD大鼠術(shù)前12 h禁食飼料，能自由飲水。腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，劑量為3 mL/kg。麻醉后于腦立體定位儀上雙耳插入耳桿固定，皮膚消毒后，剪刀剪開皮膚，鈍性分離皮下組織并刮掉骨膜，清晰暴露前囟（Bregma點），以前囟為基準(zhǔn)點，在其后1.0 mm，矢狀縫右側(cè)旁開1.5 mm處鉆開顱骨，進針深度4 mm［6］，用微量注射器行側(cè)腦室注射4 μL谷氨酸（1 mg/kg）［7］，C組側(cè)腦室注射等容量生理鹽水。取針后觀察大鼠行為學(xué)改變，造模成功的標(biāo)志為大鼠出現(xiàn)癲癇樣抽搐。術(shù)后飼養(yǎng)室溫保持在（22±2）℃，控制濕度穩(wěn)定在50%±10%。術(shù)后2 h處死大鼠。每組取6只剝開顱骨分離出腦組織，迅速分離出右側(cè)海馬組織，將其快速置-80℃冷凍用于測定SOD、MDA。將分離出海馬后剩余腦組織用于測定腦含水量，每組再取3只多聚甲醛灌注取腦后用于尼氏染色。

1.4 給藥

Dex1組和Dex2組如前所述，G組只造成腦谷氨酸毒性模型，造模前30 min腹腔注射等量生理鹽水。C組側(cè)腦室注射等容量生理鹽水，造模前30 min腹腔注射等量生理鹽水。

1.5 尼氏染色

大鼠在腦室注射谷氨酸2 h后，以10%水合氯醛腹腔注射將其麻醉，開胸經(jīng)心尖灌流生理鹽水，接著灌注4%多聚甲醛內(nèi)固定，斷頭取腦。多聚甲醛固定1周后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成8 μm厚的切片，進行尼氏染色（焦油紫法）。

1.6 SOD和MDA測定

取離心后的各組大鼠海馬組織勻漿，按照試劑盒說明書，采用硫代巴比妥酸法測定SOD，采用黃嘌呤氧化酶法測定MDA。

1.7 腦含水量測定

取分離海馬后剩余腦組織，以濾紙吸去表面血跡和腦脊液，用電子天平精確測量腦組織濕重，將腦組織放入恒溫干燥箱（70℃）烘烤48 h至恒重，置于干燥缸冷卻10 min后取出，用同一天平測量其干重（2次稱重誤差<0.2 mg）。用干濕重法計算腦組織含水量，計算公式為：腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量

結(jié)果顯示，谷氨酸毒性可造成腦含水量增加，不同劑量的Dex均能抑制腦含水量的增加，緩解腦水腫（P<0.05）。Dex1組與Dex2組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見表1。

表1 腦組織含水量Tab.1 Cerebral water content

表1 腦組織含水量Tab.1 Cerebral water content

1）P<0.05 compared with G group.

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2.2 SOD和MDA

SOD能清除自由基，使細(xì)胞免受氧化損傷。MDA為脂質(zhì)過氧化的有害產(chǎn)物，間接地反映出組織受到自由基攻擊的程度。腦室注射谷氨酸后海馬組織MDA的含量明顯增加，給予Dex后能顯著降低MDA水平（P<0.05），減輕損傷。見表2。給予Dex后，Dex1組和Dex2組SOD含量與G組比較都明顯上升（P<0.05）。Dex1組與Dex2組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見表3。

2.3 腦尼氏染色

光鏡下見C組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元排列有鈣超載進而引起許多下級神經(jīng)毒性級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、凋亡［11］。2009年Dex在中國上市，廣泛用于神經(jīng)外科手術(shù)、心臟手術(shù)、區(qū)域鎮(zhèn)靜、重癥監(jiān)護室的鎮(zhèn)靜和全麻輔助藥等方面。研究［12］表明Dex具有神經(jīng)保護作用，其機制較為復(fù)雜，為了探討Dex是否能夠通過作用于谷氨酸相關(guān)的通路，改善谷氨酸引起的神經(jīng)毒性作用，本研究通過大鼠腦谷氨酸毒性作用模型進行觀察研究。谷氨酸的中樞毒性作用會使腦組織出現(xiàn)明顯的水腫，過氧化物的含量明顯增高［13］。結(jié)果證明，腦室內(nèi)谷氨酸增高，能夠使海馬組織中MDA含量明顯升高，引起明顯的腦組織水腫，同時也發(fā)現(xiàn)SOD的水平明顯降低。當(dāng)腹腔預(yù)先注射50 μg/kg或100 μg/kg Dex時，谷氨酸引起的海馬組織中MDA的含量明顯降低，腦組織水腫也有明顯改善，SOD的水平相對于單純谷氨酸刺激組又有明顯的升高。尼氏染色結(jié)果也證實給予Dex后能減序，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，尼氏體大而明顯。G組神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞稀疏，尼氏體縮小或模糊不清，有的細(xì)胞出現(xiàn)核固縮。Dex1組與Dex2組少量細(xì)胞尼氏體縮小，但細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)基本正常，接近C組，和G組比較損傷減輕。Dex1組與Dex2組比較損傷程度相仿。見圖1。

表2 海馬組織中MDA含量Tab.2 The level of MDA in hippocampus

表2 海馬組織中MDA含量Tab.2 The level of MDA in hippocampus

1）P<0.05 compared with G group.

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表3 海馬組織中SOD含量Tab.3 The level of SOD in hippocampus

表3 海馬組織中SOD含量Tab.3 The level of SOD in hippocampus

1）P<0.05 compared with G group.

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3 討論

圖1 CA3區(qū)的病理改變×400Fig.1 The pathologic change in CA3×400

谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，過多的谷氨酸堆積造成繼發(fā)性神經(jīng)毒性。谷氨酸神經(jīng)毒性造成腦損傷的機制主要是大量激活各種谷氨酸受體產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性［8］和抑制細(xì)胞膜上谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運子的功能，產(chǎn)生氧化性毒性［9］，造成鈉、水的內(nèi)流，使神經(jīng)元急性腫脹，形成腦水腫［10］，大量離子型谷氨酸受體激活，造成細(xì)胞內(nèi)輕海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的損傷及凋亡情況。說明過度的谷氨酸刺激會導(dǎo)致大量過氧化物生成，引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷，同時，升高的過氧化物會使SOD代償性增高。提前給予不同劑量Dex，能顯著減輕谷氨酸毒性造成的腦水腫，使海馬組織中MDA含量降低，使能清除自由基的SOD進一步升高，從而產(chǎn)生顯著的神經(jīng)系統(tǒng)保護作用。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)50 μg/kg與100 μg/kg Dex對觀察結(jié)果的影響無明顯差別，具有相同的神經(jīng)保護作用。

綜上所述，Dex能夠明顯減輕谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，其機制可能是抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的神經(jīng)毒性，其詳細(xì)的機制還有待于進一步研究。

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（編輯 于溪）

Effects of Dexmedetomidine Hydrochloride on Glutamate?induced Neurotoxicity in Rats

LI Xinming，LI Songze，LIU Hongtao
（Department of Anesthesiology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of dexmedetomidine hydrochloride preconditioning against glutamate?induced neurotoxicity.MethodsThe model of glutamate?induced neurotoxicity was established by the injection of glutamate into lateral cerebral ventricle. Thirty?six SD rats were randomly divided into control group（C group），glutamate?induced neurotoxicity group（G group），Dex1 group and Dex2 group.Dex1 group and Dex2 group received intraperitoneal injection of dexmedetomidine respectively at a dose of 50 μg/kg or 100 μg/kg before glutamate application.Two hours later，the rats were sacrificed and hippocampus was separated to measure the level of SOD and MDA.The rest of each brain was used to measure the degree of brain edema.Pathological changes were observed under microscope with Nissl’s staining.Re?sultsIn contrast to G group，brain edema and MDA concentration in Dex1 group and Dex2 group were significant lower，while SOD concentra?tions were significantly increased and the pathological change in Dex1 group and Dex2 group were relieved obviously compared to glutamate?in?duced neurotoxicity group.ConclusionDexmedetomidine preconditioning can significantly attenuate glutamate?induced neurotoxicity，which is properly related to the inhibition of oxidative?stress reaction.

dexmedetomidine；glutamate?induced neurotoxicity；oxidative?stress reaction

R614.2

A

0258-4646（2017）04-0302-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.04.004

國家自然科學(xué)基金（81271370）

李欣明（1987-），男，醫(yī)師，碩士研究生.

劉洪濤，E-mail：2895364359@qq.com

2016-10-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：