應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行急性呼吸道傳染病病原的篩查分析

楊國松

摘要：目的 對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在急性呼吸道傳染病病源篩查中的應(yīng)用情況進(jìn)行分析研究。方法 選取2015年6月～2016年6月在我院進(jìn)行治療的發(fā)熱伴呼吸道癥狀患者130例作為本次研究對(duì)象，對(duì)130份發(fā)熱伴呼吸道癥狀病例咽拭子標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法實(shí)施五類常見呼吸道病毒和其亞型的檢測以及鑒定，并分析在急性呼吸道傳染病病原篩查中應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的意義。結(jié)果 在對(duì)130份咽拭子標(biāo)本實(shí)施實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)以后，共篩查出甲型流感病毒陽性標(biāo)本66份（50.77%），乙型流感病毒陽性標(biāo)本8份（6.15%），腺病毒陽性標(biāo)本4份（3.08%），并未檢出呼吸道合胞病毒、副流感病毒以及冠狀病毒。結(jié)論 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在急性呼吸道傳染病病原的篩查中，可以發(fā)揮出快速準(zhǔn)確以及較強(qiáng)特異性的優(yōu)勢，對(duì)急性呼吸道傳染病的預(yù)防和控制具有重要的預(yù)測作用。因此，值得將此種方式在臨床急性呼吸道傳染病病源篩查中廣泛的應(yīng)用實(shí)踐。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR法；急性呼吸道傳染?。徊≡春Y查；應(yīng)用

呼吸道傳染病的流行具有隱蔽性以及突發(fā)性，其傳播的途徑較多，可以在人-人、人-動(dòng)物、動(dòng)物-動(dòng)物之間進(jìn)行傳播。生活中，呼吸道傳染病的活動(dòng)性較大，同時(shí)較為集中，一旦產(chǎn)生呼吸道傳染病，就會(huì)對(duì)人們的正常生活以及工作造成嚴(yán)重的影響，降低生活質(zhì)量，嚴(yán)重者可對(duì)生命安全造成直接威脅。根據(jù)相關(guān)的研究資料結(jié)果顯示，急性呼吸道感染具有超過百分之九十的比例是因?yàn)椴《舅鶎?dǎo)致，并且最常見的就是呼吸道病毒，所以采取科學(xué)有效的管理以及防控舉措尤為重要。本研究將實(shí)時(shí)熒光定量PCR法應(yīng)用于急性呼吸道傳染病病源篩查中，觀察及分析了應(yīng)用的效果，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 對(duì)2015年6月～2016年6月的130例發(fā)熱伴呼吸道癥狀患者采集的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行篩查分析。標(biāo)本源均排除其他流行病學(xué)接觸史，年齡在20～65歲，平均年齡（42.6±1.2）歲，其中78個(gè)標(biāo)本源自男性患者，52個(gè)標(biāo)本源自女性患者。

1.2方法 本研究應(yīng)用的儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司 7500，試劑為賽默飛世爾公司 PureLinkTMViral RNA/DNA Mini Kit 病毒核酸提取試劑盒。TaKaRa 公司的One Step PrimeScript TM RT - PCR Kit擴(kuò)增試劑盒，其擴(kuò)增用的引物、探針序列得到WHO的推薦，并且為引物合成公司合成[1]。

首先，對(duì)嚴(yán)格遵循無菌技術(shù)從發(fā)熱病例采集的咽拭子標(biāo)本做好標(biāo)識(shí)并詳細(xì)記錄；其次，實(shí)施核酸提取。應(yīng)用核酸提取試劑盒于潔凈區(qū)內(nèi)二級(jí)生物安全柜內(nèi)實(shí)施標(biāo)本RNA的提?。蛔詈笳归_呼吸道病毒的篩查和鑒定，具體如下：①反應(yīng)體系和處理：嚴(yán)格遵循試劑盒的說明書要求進(jìn)行試劑準(zhǔn)備，并且待測的標(biāo)本均分別檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒以及呼吸道合胞病毒、副流感病毒、冠狀病毒。將處理好的待測樣本RNA 4 μl加入到事先準(zhǔn)備好的反應(yīng)液內(nèi)，各反應(yīng)板做好質(zhì)控對(duì)照，并每批次設(shè)置一組陽性對(duì)照，以及各份樣品都實(shí)施內(nèi)參對(duì)照的設(shè)置[2]。制定檢測管終體積在20 μl，于蓋緊管蓋以后進(jìn)行混勻和瞬時(shí)低速離心；②基因擴(kuò)增：于擴(kuò)增儀上，展開實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，設(shè)定擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：以42 ℃、5 min，95 ℃、10 s，1個(gè)循環(huán)作為第一階段，并實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；以95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40個(gè)循環(huán)作為第二階段，并展開PCR擴(kuò)增反應(yīng)。于60 ℃期間，對(duì)熒光進(jìn)行采集，羧基熒光素通道為檢測通道，在進(jìn)行加樣以后再上機(jī)實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)[3]；③分析結(jié)果：在反應(yīng)結(jié)束后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀會(huì)顯示各個(gè)樣品0～40個(gè)循環(huán)數(shù)內(nèi)的相對(duì)熒光強(qiáng)度曲線圖，針對(duì)圖像調(diào)節(jié)擴(kuò)增基線的起始值以及終止值和閾值（Ct）進(jìn)行分析，如果Ct值在37.0或者以下，則反應(yīng)呈現(xiàn)出陽性結(jié)果，如果不具有Ct值、Ct值等于0，則反應(yīng)呈陰性，灰區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)為Ct值在37.0～40.0。在點(diǎn)擊Analysis后，儀器進(jìn)行結(jié)果分析并顯示分析結(jié)果的報(bào)告頁面。

2 結(jié)果

在實(shí)施檢測以后，在130份發(fā)熱伴呼吸道癥狀的咽拭子標(biāo)本中，共檢測到了共篩查出甲型流感病毒陽性標(biāo)本66份（50.77%），乙型流感病毒陽性標(biāo)本8份（6.15%），腺病毒陽性標(biāo)本4份（3.08%），并未檢出呼吸道合胞病毒、副流感病毒以及冠狀病毒。

3 討論

由病毒所導(dǎo)致的急性呼吸道感染，病毒感染的臨床癥狀具有相似的表現(xiàn)，并且有些病毒常常容易導(dǎo)致世界范圍內(nèi)的大流行，其中呼吸道病毒感染更是容易引發(fā)較高死亡率[4]。所以，做到及時(shí)準(zhǔn)確的識(shí)別呼吸道傳染病病原體，做到有效防控疾病傳播，對(duì)于患者的診療以及提升生存質(zhì)量具有重要意義。

熒光定量PCR技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢，包含DNA探針雜交技術(shù)以及PCR兩種技術(shù)，能夠經(jīng)PCR熒光信號(hào)變化情況、PCR反應(yīng)酶動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，針對(duì)DNA模版獲得精準(zhǔn)的定量測定。熒光定量PCR運(yùn)轉(zhuǎn)具有較為封閉的環(huán)境，能夠精簡PCR后處理以及電泳檢測環(huán)節(jié)，所以此種情況也有效避免了產(chǎn)物擴(kuò)增導(dǎo)致污染以及PCR不能夠定量測定和復(fù)雜的操作程序等問題[5-6]。

熒光定量PCR技術(shù)具有較高的特異性、操作便捷、能夠應(yīng)用特定低純度標(biāo)本，同時(shí)靈敏度較高，將現(xiàn)有技術(shù)不能夠解決的缺陷有效克服，所以應(yīng)用的意義巨大。在本研究中，對(duì)130份發(fā)熱伴呼吸道癥狀的病例標(biāo)本應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行呼吸道病毒的篩查和鑒定，結(jié)果顯示在所有研究對(duì)象的咽拭子標(biāo)本中，共檢測到了共篩查出甲型流感病毒陽性標(biāo)本66份（50.77%），乙型流感病毒陽性標(biāo)本8份（6.15%），腺病毒陽性標(biāo)本4份（3.08%），并未檢出呼吸道合胞病毒、副流感病毒以及冠狀病毒。結(jié)果充分表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)于急性呼吸道傳染病病原活動(dòng)水平可獲得有效掌握，也因此為患者得早期防控提供了堅(jiān)實(shí)的依據(jù)，推廣應(yīng)用價(jià)值較大。

綜上所述，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法篩查急性呼吸道傳染病病原具有重要的作用，篩查期間可發(fā)揮優(yōu)勢具有速度快、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)等，所以能夠于實(shí)踐防控急性呼吸道傳染病中起到重要的應(yīng)用價(jià)值，值得大量推廣使用。

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編輯/安樺