HPLC同時(shí)測(cè)定山豆根中7種生物堿及3種黃酮的含量

韓馥蔓+王莉鑫+陳影+陳兩綿+馮偉紅+王錦玉+劉德文+游云+仝燕

[摘要] 建立HPLC同時(shí)測(cè)定山豆根中7種生物堿（金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿、槐醇、苦參堿和槐果堿）及3種黃酮（三葉豆紫檀苷、芒柄花素和馬卡因）含量的方法。采用Welch Xtimate_TMC₁₈（4.6 mm × 250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.01 mol·L^-1醋酸銨（氨水調(diào)pH 8.0）溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫：0～20 min，4%～14% A；20～30 min，14%～25% A；30～45 min，25%～40% A；45～65 min，40%～55% A；65～75 min，55% A；流速1.0 mL·min^-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，10種成分的分離度良好，且在各自濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，r≥0.999 7，平均回收率在98.60 %～102.6 %，RSD為0.60%～3.7%（n=6），該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性良好。含量測(cè)定結(jié)果顯示，7種生物堿和3種黃酮成分在不同樣品中的含量具有顯著性差異。由此表明，不同批次的山豆根藥材，其內(nèi)在質(zhì)量存在較大差異。該法可用于山豆根藥材的多成分同步測(cè)定，同時(shí)可以為山豆根的全面質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 山豆根；高效液相色譜法；含量測(cè)定；生物堿；黃酮

[Abstract] In this study，an HPLC method was developed for simultaneous determination of seven alkaloids （cytosine，oxymatrine，N-oxysophocarpine，N-methylcytisine，sophoranol，matrine，and sophocarpine） and three flavonoids （trifolirhizin，fermononetin，and maackiain） from different samples of Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma. Samples were analyzed on a Welch Xtimate_TMC₁₈ column （4. 6 mm× 250 mm，5 μm） eluted with the mobile phase of acetonitrile （A） and 0.01 mol·L^-1 ammonium acetate solution （pH 8.0） （B） in a linear gradient mode as follows： 0-20 min，4%-14% A；20-30 min，14%-25% A；30-45 min，25%-40% A；45-65 min，40%-55% A；65-75 min，55% A. The flow rate of the mobile phase，the column temperature，and the PDA detector wavelength were set at 1.0 mL·min^-1，30 ℃，and 225 nm，respectively. For the method validation，these ten compounds showed good separation and satisfactory linearity （r≥0.999 7） within the concentration ranges tested. The mean recoveries were in the range of 98.60% to 102.6% with the RSD （n=6） between 0.60% and 3.7%. This method was proved to be simple，accurate and repeatable. The quantitative results showed that there were significant differences in the contents of seven alkaloids and three flavonoids among the different samples. This result revealed that the quality of Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma varied widely. This method could be used for the simultaneous determination of the multi-ingredients from Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma，which might provide scientific evidences to evaluate/control the quality of Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma，comprehensively.

[Key words] Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma；HPLC；quantitative analysis；alkaloid；flavonoid

doi：10.4268/cjcmm20162423

山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep. 的干燥根和根莖，主產(chǎn)于廣西、貴州、江西、云南等地，味苦，性寒，具有清熱解毒，消腫利咽的功效，主治火毒蘊(yùn)結(jié)，乳蛾喉痹，咽喉腫痛，齒齦腫痛，口舌生瘡[1]。山豆根中主要含有生物堿、黃酮及多糖類成分[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山豆根中所含生物堿類成分具有多重功效，如苦參堿和氧化苦參堿等具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗心律失常、降血壓和解熱鎮(zhèn)痛等藥理活性[3]；槐花醇、槐果堿和氧化槐果堿等具有抗乙肝病毒活性[4]，槐果堿還具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及對(duì)抗室性心律失常等作用[5]。山豆根中黃酮類成分具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]，抑制胃酸分泌，治療胃潰瘍等作用[7]，其中三葉豆紫檀苷和馬卡因可抑制白血病HL-60細(xì)胞[8]，芒柄花素具有抑制過(guò)敏性炎癥和抗宮頸癌等作用[9-10]。因此，山豆根的整體藥效是山豆根中多種有效成分共同作用的宏觀反映，山豆根的內(nèi)在質(zhì)量由多種有效成分的含量高低共同決定。目前，對(duì)于山豆根的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制，主要以生物堿類成分苦參堿和氧化苦參堿的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[11-14]，對(duì)于同時(shí)測(cè)定多種黃酮和生物堿類成分含量的研究報(bào)道較為少見(jiàn)。本研究建立了HPLC同步測(cè)定7種生物堿（金雀花堿、槐醇、槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿、N-甲基金雀花堿）和3種黃酮（三葉豆紫檀苷、芒柄花素及馬卡因）含量的分析方法，并對(duì)山豆根藥材的質(zhì)量進(jìn)行了分析與評(píng)價(jià)，可為山豆根藥材的全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；BT 125D型1/10萬(wàn)電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BSA 2224S-CW型1/1萬(wàn)電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；JA1003型1/1000電子天平（上海良平儀器有限公司）；B2510E-DTH型超聲波清洗儀（美國(guó)Bransonic公司）；DET-50型號(hào)高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司）。

氧化苦參堿（批號(hào)PSO187-0020，純度>98.5%）、苦參堿（批號(hào)PSO986-0025，純度>99.0%）和芒柄花素（批號(hào)PSO215-0025，純度>98.0%）購(gòu)自成都普斯生物科技有限公司；金雀花堿（批號(hào)J-008-160311，純度>98.0%）、N-甲基金雀花堿（批號(hào)J-008-160311，純度>98.0%）、槐果堿（批號(hào)H-031-140729，純度≥98.0%）、三葉豆紫檀苷（批號(hào)S-061-150924，純度>98.0%）和馬卡因（批號(hào)M-030-150731，純度>98.0%）購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；槐醇（批號(hào)CFS201601，純度≥98.0%）購(gòu)自武漢天植化學(xué)生物科技有限公司；氧化槐果堿（批號(hào)Z1856B3547，純度≥98.0%）購(gòu)自廣州雋沐生物科技有限公司。甲醇和乙腈為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司），醋酸銨、濃氨水和二氯甲烷均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為娃哈哈純凈水。

實(shí)驗(yàn)用山豆根藥材8批，于2016年收集，其中江西產(chǎn)山豆根1批（JX-1），貴州產(chǎn)山豆根1批（GZ-1），廣西產(chǎn)山豆根6批（GX-1，GX-2，GX-3，GX-4，GX-5和GX-6），經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所何希榮老師鑒定為山豆根S. tonkinensis 的干燥根和根莖。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Welch Xtimate TM C₁₈（4.6 mm × 250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈（A）- 0.01 mol·L^-1醋酸銨（氨水調(diào)pH 8.0）溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～20 min，4%～14% A；20～30 min，14%～25% A；30～45 min，25%～40% A；45～65 min，40%～55% A；65～75 min，55% A；流速1.0 mL·min^-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm。在上述色譜條件下，樣品中金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿、槐醇、苦參堿、槐果堿、三葉豆紫檀苷、芒柄花素和馬卡因色譜峰的保留時(shí)間與對(duì)照品保持一致，10種成分的色譜峰能達(dá)到較好的分離，且純度檢查符合要求，樣品中其它成分對(duì)待測(cè)成分的測(cè)定無(wú)干擾。對(duì)照品及典型的山豆根樣品的HPLC圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備 分別取各對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇配制成含40.3 mg·L^-1金雀花堿、 427.2 mg·L^-1氧化苦參堿、106.7 mg·L^-1氧化槐果堿、 27.2 mg·L^-1 N-甲基金雀花堿、 28.4 mg·L^-1槐醇、51.9 mg·L^-1苦參堿、23.3 mg·L^-1槐果堿、58.5 mg·L^-1三葉豆紫檀苷、18.1 mg·L^-1芒柄花素和52.8 mg·L^-1馬卡因的混合對(duì)照儲(chǔ)備溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末（過(guò)50目篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入二氯甲烷-40%氨水（25∶1）的混合溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，稱重，用混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液10 mL，水浴揮干，殘?jiān)尤爰状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性與范圍、檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ） 分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成系列濃度的對(duì)照品溶液。取各個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品濃度（mg·L^-1）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）；同法逐級(jí)稀釋，分別以S/N=3和S/N=10的進(jìn)樣濃度確定檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，各待測(cè)物在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為0.118～1.15 mg·L^-1，定量限為0.395～3.82 mg·L^-1。

2.5 精密度考察 取同一中等濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示，金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿、槐醇、苦參堿、槐果堿、三葉豆紫檀苷、芒柄花素和馬卡因峰面積的RSD分別為1.8%，0.65%，1.9%，0.71%，2.3%，1.7%，1.8%，1.3%，1.9%，0.94%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，分別于配制后0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示，金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿、槐醇、苦參堿、槐果堿、三葉豆紫檀苷、芒柄花素及馬卡因峰面積的RSD分別為2.9%，2.2%，2.7%，2.7%，1.9%，2.7%，2.6%，1.8%，2.9%，2.4%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性考察 取同一批次的山豆根樣品（GX-3）約0.5 g，共6份，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示，金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿、槐醇、苦參堿、槐果堿、三葉豆紫檀苷、芒柄花素和馬卡因含量的RSD分別為1.8%，2.9%，1.6%，1.2%，2.1%，2.4%，1.5%，1.6%，2.4%，2.9%，表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率考察 取已知含量的同一批次的山豆根樣品（GX-3）約0.25 g，共 6 份，分別加入對(duì)照品適量，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算10種成分的平均回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。10種待測(cè)成分的平均回收率在98.60%～102.6%，RSD均小于4.0%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.9 樣品的含量測(cè)定 取各山豆根樣品粉末，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每個(gè)樣品平行2份，并按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各山豆根樣品中10種成分的含量，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

本研究建立了HPLC測(cè)定山豆根中金雀花堿、槐醇、槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿、N-甲基金雀花堿等7種生物堿及三葉豆紫檀苷、芒柄花素、馬卡因等3種黃酮含量的方法，該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重復(fù)性良好。采用該法，對(duì)不同批次的山豆根樣品進(jìn)行了測(cè)定。

3.1 供試品溶液制備方法的考察 實(shí)驗(yàn)考察了水浴回流法和超聲法2種提取方法對(duì)待測(cè)成分的提取效果，結(jié)果表明2種提取方法的提取效率無(wú)顯著性差異，考慮到實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)便易行，最終選擇超聲提取法；比較了甲醇-氨水、三氯甲烷-氨水、三氯甲烷-甲醇-氨水、二氯甲烷-氨水4種混合溶液的提取效率，結(jié)果表明含有甲醇的混合溶液的提取效率較低且雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，三氯甲烷-氨水和二氯甲烷-氨水混合溶液的提取效率最高且二者無(wú)顯著性差異，故選擇了毒性較小的二氯甲烷-氨水混合溶液作為提取溶劑。此外，實(shí)驗(yàn)考察了超聲時(shí)間（20，30，40 min）和氨水濃度（40%，50%，100%）對(duì)提取效率的影響，最終選擇了以二氯甲烷-40%氨水（25∶1）為提取溶劑，超聲提取20 min作為供試品的提取條件。

3.2 色譜柱，流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了Welch Ultimate XB-NH₂柱，Welch Ultimate XB-C₁₈柱，Welch Xtimate_TM-C₁₈柱和Topsil-C₁₈柱等4種色譜柱對(duì)各待測(cè)成分的分離效能，結(jié)果表明使用Welch Xtimate^TM-C₁₈柱可以獲得較為平穩(wěn)的基線，且各待測(cè)成分的峰形較好，故選擇該柱作為分離柱。比較了流動(dòng)相為乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液和乙腈-0.01 mol·L^-1醋酸銨水溶液系統(tǒng)的分離效能，結(jié)果表明，以乙腈-0.01 mol·L^-1醋酸銨水溶液為流動(dòng)相，其色譜圖的基線較為平穩(wěn)，各色譜峰的拖尾因子在0.95～1.05；通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫條件，10種待測(cè)成分能達(dá)到較好的分離且純度檢查符合要求，故選擇乙腈-0.01 mol·L^-1醋酸銨水溶液作為流動(dòng)相的梯度洗脫系統(tǒng)。采用二極管陣列檢測(cè)器，于190～400 nm波長(zhǎng)對(duì)10種待測(cè)成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明10種成分在225 nm處均有較大吸收，且色譜圖的基線較為平穩(wěn)，故選擇225 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 測(cè)定結(jié)果分析 本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地不同批次的山豆根藥材中10種成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，由含量測(cè)定結(jié)果可知，8批藥材中苦參堿和氧化苦參堿的總量在7.15～13.5 mg·g^-1，符合2015年版《中國(guó)藥典》一部對(duì)于山豆根藥材中苦參堿和氧化苦參堿的總含量要求（苦參堿和氧化苦參堿的總量≥0.7%），表明以上8批山豆根藥材均符合中國(guó)藥典的質(zhì)量要求。8批藥材中，7種生物堿類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為10.5～16.3 mg·g^-1，3種黃酮類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為1.06～2.32 mg·g^-1，10種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為12.2～18.7 mg·g^-1，不同批次的山豆根藥材中生物堿和黃酮類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和具有較大差異。GX-3樣品中苦參堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.7 mg·g^-1，氧化苦參堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.784 mg·g^-1，而GZ-1樣品中苦參堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.99 mg·g^-1，氧化苦參堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.89 mg·g^-1，山豆根中氧化苦參堿與苦參堿的含量呈現(xiàn)出此消彼長(zhǎng)的關(guān)系。此外，表3的含量測(cè)定數(shù)據(jù)顯示，GX-3樣品中氧化槐果堿的含量是GX-1樣品中的17.4倍，GX-6樣品中N-甲基金雀花堿的含量是JX-1樣品中的3.37倍，GX-4樣品中槐醇的含量是GX-2樣品中的12.5倍，GX-4樣品中槐果堿的含量是JX-1樣品中的18.1倍，GX-3樣品中三葉豆紫檀苷的含量是JX-1樣品中的5.64倍，GX-4樣品中芒柄花素的含量是GX-1樣品中的5.48倍，JX-1樣品中三葉豆紫檀苷的含量是GX-1樣品中的2.78倍。以上結(jié)果表明，10種成分在不同批次的山豆根藥材中的含量差異顯著，其內(nèi)在質(zhì)量差異較為明顯，故對(duì)山豆根中的多種成分進(jìn)行同步測(cè)定可以更加全面的反映山豆根的內(nèi)在質(zhì)量。

山豆根為有毒中藥，據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[2，5]，山豆根中生物堿類成分既是有效成分亦是潛在的毒性成分，尤其以苦參堿和金雀花堿的毒性較強(qiáng)。如何建立山豆根中各種生物堿的含量與其藥效及毒性的內(nèi)在相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。此外，山豆根中的生物堿類成分并非山豆根的專屬性成分，比如苦參為無(wú)毒中藥，但所含生物堿類成分卻與山豆根十分相似。那么，山豆根中的其他類成分，比如黃酮類成分，是否與山豆根的毒性具有相關(guān)性，研究報(bào)道甚少，亦有待研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中國(guó)藥典.一部[S]. 2015：27.

[2] 王君明，崔瑛. 山豆根化學(xué)成分、藥理作用及毒性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，14（4）：229.

[3] 張鳳玲，唐永，張景梅. 苦參堿、氧化苦參堿的藥理作用及其制劑的研究進(jìn)展[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，19（112）：84.

[4] 丁佩蘭.山豆根和苦參化學(xué)成分的比較研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2004.

[5] 鄭麗娜，孫虎，謝元璋，等. 山豆根化學(xué)成分與功效、毒性相互關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品，2011，13（5）：205.

[6] Kajimoto S，Takanashi N，Kaimoto T，et al. Sophoranone，extracted from a traditional Chinese medicine Shandougen，induces apoptosis in human leukemia U937 cells via formation of reactive oxygen species and opening of mitochondrial permeability transition pores [J]. Int J Cancer，2002，99（6）：879.

[7] He C M，Cheng Z H，Chen D F. Qualitative and quantitative analysis of flavonoids in Sophora tonkinensis by LC/MS and HPLC [J]. Chin J Nat Medicines，2013，11（6）： 690.

[8] Aratanechemuge Y，Hibasami H，Katsuzaki H，et al. Induction of apoptosis by maackiain and trifolirhizin （maackiain glycoside） isolated from sanzukon （Sophora subprostrate Chen et T. Chen） in human promyelotic leukemia HL-60 cells [J].Oncol Rep，2004，12 （6）：1183.

[9] 王燕，陶羽，王曉鈺，等. 芒柄花素抑制小鼠Th2型變應(yīng)性接觸性皮炎的機(jī)制分析[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（10）：88.

[10] Jin Y M，Xu T M，Zhao Y H，et al. In vitro and in vivo anti-cancer activity of formononetin on human cervical cancer cell line HeLa [J]. Tumor Biol，2014，35 （3）：2279.

[11] 郝學(xué)志，劉臣，王新彥. HPLC法測(cè)定山豆根中苦參堿及氧化苦參堿的含量[J]. 黑龍江中醫(yī)藥，2002（3）： 56.

[12] 馬長(zhǎng)華，曹天海. HPLC法測(cè)定山豆根中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J]. 藥物分析雜志，2000，20（6）： 408.

[13] 李南，鄧紅，張蜀. UPLC法快速測(cè)定山豆根中氧化苦參堿和苦參堿的含量[J]. 今日藥學(xué)，2012，22（6）：347.

[14] 丁佩蘭，郁韻秋，王鋼力. RP-HPLC法評(píng)價(jià)山豆根藥材質(zhì)量[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào)，2004，31（2）： 208.

[責(zé)任編輯 丁廣治]