氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米及其灌溉水中嘧菌環(huán)胺的殘留量

劉芯成，黃 亮，朱萌萌，陳盧濤，周 強(qiáng)，王川丕

(1.綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000; 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米及其灌溉水中嘧菌環(huán)胺的殘留量

劉芯成1，黃 亮1，朱萌萌1，陳盧濤1，周 強(qiáng)2，王川丕1

(1.綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000; 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

建立了大米及灌溉水中嘧菌環(huán)胺殘留量的氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜(GC- MS/MS)檢測方法，并模擬實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境，對嘧菌環(huán)胺的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。大米樣品經(jīng)乙腈提取，氨基固相萃取柱(NH2- SPE)凈化；大米灌溉水經(jīng)二氯甲烷提取，在GC- MS/MS上進(jìn)行檢測分析，采用外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，嘧菌環(huán)胺在0.01～0.50 mg·L-1內(nèi)相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.999以上，具有良好的線性關(guān)系；共選擇3個(gè)離子對，其中1組用于定量m/z224.10/208.10，另外2組用于定性確證m/z224.10/197.10、224.10/131.10。樣品中添加0.01、0.1、1.0 mg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)品，其回收率為85%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。研究表明，該方法提取效果好，具有良好的靈敏度、回收率和重復(fù)性；嘧菌環(huán)胺在灌溉水中半衰期為3.12 d，在室溫、正常光照條件下，1 d內(nèi)穩(wěn)定，2 d后降解速度加快，4 d后降解速度減慢并趨于穩(wěn)定，為實(shí)際生產(chǎn)中如何施藥提供了一定的參考依據(jù)。

嘧菌環(huán)胺； GC- MS/MS； 穩(wěn)定性

嘧菌環(huán)胺屬于嘧啶胺類化合物，20世紀(jì)90年代由瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司開發(fā)成功，主要用于防治灰霉病、白粉病、黑星病、網(wǎng)斑病、穎枯病和小麥眼紋病等[1]，其作用機(jī)理是通過抑制蛋氨酸的生物合成和水解酶的生物活性而導(dǎo)致病菌死亡[2]。而紋枯病、灰霉病和稻瘟病等真菌性病害是限制水稻穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要限制因子之一。嘧菌環(huán)胺具有較廣的殺菌活性。艾爽等[3]研究嘧菌環(huán)胺對水稻紋枯病具有一定的抑制效果；徐桂芳等[4]研究表明，30%嘧菌環(huán)胺懸浮劑對稻瘟病防治效果明顯，可有效抑制葉稻瘟病和穗頸瘟的流行。

目前我國尚未制定嘧菌環(huán)胺在大米中最大殘留限量，但規(guī)定其在小麥和杏仁中的限量分別為0.5和0.02 mg·kg-1。2014年日本修訂嘧菌環(huán)胺在多種食品中的殘留限量。大麥由3.0 mg·kg-1調(diào)整為2.0 mg·kg-1，洋蔥由0.6 mg·kg-1調(diào)整為0.05 mg·kg-1。歐盟對嘧菌環(huán)胺在大米中最大殘留限量規(guī)定為0.02 mg·kg-1[5]。目前，對嘧菌環(huán)胺的檢測主要集中在氣相色譜、液相色譜及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用上。Otero等[6]采用SPME- GC- MS對白葡萄酒中的嘧菌環(huán)胺進(jìn)行檢測，LOD和LOQ分別為0.1和0.2 μg·L-1。Luis等[7]采用高效液相色譜結(jié)合二極管陣列檢測器對葡萄中的嘧菌環(huán)胺進(jìn)行檢測，回收率達(dá)到97%左右。而三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜通過對適當(dāng)?shù)哪鸽x子進(jìn)行二次質(zhì)譜分析，能有效去除基質(zhì)離子的干擾，定性更加準(zhǔn)確，并具有較高的靈敏度[8]。本研究建立了大米及其灌溉水中嘧菌環(huán)胺的氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，并對該藥在水中的穩(wěn)定性進(jìn)行了探討，為指導(dǎo)該藥在水稻種植中的合理使用提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC- 2010 plus氣相色譜儀配TQ8040質(zhì)譜儀，ZB- 5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，日本Shimadzu公司)；ST- 16R離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司)；BSA2202S電子天平(德國Sartorius公司)；漩渦混合器(美國Henry Troemner公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi 公司)；NH2- SPE氨丙基固相萃取柱(500 mg，6 mL天津博納艾杰爾科技有限公司)；KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MTN- 5800氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、丙酮(HPLC級，美國J.T.Baker公司)；其他試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)室所用水均為去離子水；微孔有機(jī)濾膜(0.22 μm)。

1.2 供試樣品

大米及其灌溉水樣品由藍(lán)城農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。大米樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，混勻，于常溫下保存。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 大米樣品

稱取10 g(精確至0.01 g)于100 mL燒杯中，加入5 mL水浸泡0.5 h，加入50 mL乙腈，用均質(zhì)器在15 000 r·min-1勻漿提取1 min，抽濾并轉(zhuǎn)移提取液至100 mL具塞量筒中(內(nèi)加5～7 g氯化鈉)，劇烈振搖2 min，靜置30 min，取上清液10 mL待凈化；用5 mL乙腈預(yù)淋洗NH2柱，將NH2柱放置在固定架上，下接雞心瓶，移入上述10 mL待凈化液，用15 mL乙腈+甲苯(3+1)分3次洗滌小柱，收集所有流出物，旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用2 mL正己烷定容，渦旋溶解，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，收集濾液待測定。

1.3.2 灌溉水

量取10 mL于125 mL分液漏斗中，加入20 mL二氯甲烷，劇烈振搖1 min，取二氯甲烷層于雞心瓶中；殘?jiān)謩e用10 mL二氯甲烷重復(fù)提取2次，合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至凈干，用10 mL正己烷定容，渦旋溶解，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，收集濾液待測定。

1.3.3 嘧菌環(huán)胺在灌溉水中穩(wěn)定性試驗(yàn)

取灌溉水10.0 mL于50 mL離心管中，加入濃度為1.00 mg·L-1的嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，混勻后加蓋密閉，共配制待測樣品24個(gè)，置于恒溫(25±1)℃、光照與黑暗時(shí)間為15 h∶9 h的培養(yǎng)箱中，分別于0，1，2，3，4，5，6，7 d后依次取出3個(gè)樣品進(jìn)行檢測，檢測方法同1.3.2節(jié)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取嘧菌環(huán)胺0.009 6 g，用色譜純丙酮定容至25.0 mL，得到約378 mg·L-1嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用正己烷稀釋為40.0 mg·L-1的嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于0～4 ℃保存。

1.3.5 基質(zhì)工作液的配制

試驗(yàn)中根據(jù)需要，取1.3.1節(jié)所述提取的樣品液對標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 試驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件

進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦氣，碰撞氣為高純氬氣，純度≥99.999%，柱流量為1.6 mL·min-1；不分流進(jìn)樣，1.0 min后開閥；進(jìn)樣量1 μL；定量方法外標(biāo)法。

1.4.2 質(zhì)譜條件

色譜- 質(zhì)譜接口溫度280 ℃，電離方式EI，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，檢測器電壓0.99 kV (+0.4 kV)，測定方式為MRM多重反應(yīng)監(jiān)測模式。定性、定量離子、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 嘧菌環(huán)胺質(zhì)譜檢測參數(shù)

注：*表示定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜- 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電子轟擊離子源(EI)檢測模式下對嘧菌環(huán)胺進(jìn)行一級質(zhì)譜分析(Q3 Scan)，在質(zhì)譜圖中選擇分子量較高，離子強(qiáng)度較大的離子為前體離子。設(shè)定3～45 eV(每3 eV為1個(gè)間隔)的碰撞能量，對得到的前體離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(產(chǎn)物離子掃描)，根據(jù)二級質(zhì)譜圖，選擇離子強(qiáng)度最大的為定量離子(224.10>208.10)，離子強(qiáng)度次之的為定性離子(224.10>197.10，224.10>131.10)。圖1為使用優(yōu)化后的氣相色譜質(zhì)譜條件對嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品及試驗(yàn)回收的MRM質(zhì)譜圖。

圖1 嘧菌環(huán)胺MRM色譜圖

2.2 灌溉水中嘧菌環(huán)胺提取溶劑的選擇

本研究針對灌溉水中嘧菌環(huán)胺的萃取，分別比較二氯甲烷、石油醚和乙腈3種提取溶劑對該藥回收率的影響。由圖2可知，3種溶劑中的回收率均達(dá)到75%以上，其中乙腈、二氯甲烷溶液回收率達(dá)到85%以上，考慮到二氯甲烷的沸點(diǎn)更低，有利于后續(xù)的濃縮及凈化過程，因此選擇二氯甲烷作為提取溶劑。在萃取體積的選擇上，使用20 mL二氯甲烷萃取1次得到的回收率為66.1%，而使用20、10和10 mL分次萃取，回收率在90.0%以上，說明分批萃取可從樣品中有效萃取嘧菌環(huán)胺。因此本試驗(yàn)選擇用20、10和10 mL二氯甲烷的體積分3次萃取嘧菌環(huán)胺。

圖2 不同溶劑及不同體積二氯甲烷萃取嘧菌環(huán)胺的回收率

研究過程發(fā)現(xiàn)，使用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和基質(zhì)工作溶液定量對回收率的影響較大，且基質(zhì)工作溶液定量比標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的回收率高10%～15%，表明基質(zhì)效應(yīng)對嘧菌環(huán)胺殺菌劑的影響較大。研究中均采用基質(zhì)工作溶液進(jìn)行定量。

2.3 嘧菌環(huán)胺在灌溉水中穩(wěn)定性的測定

農(nóng)藥殘留的貯存穩(wěn)定性不僅與其本身的性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、蒸汽壓、水溶性等)，還與貯存條件(光照、溫度、濕度等)等因素有關(guān)[9]。本研究在試驗(yàn)室模擬了大田中正常溫度和光照條件下噴施農(nóng)藥后嘧菌環(huán)胺在水中的降解情況。嘧菌環(huán)胺在灌溉水中的降解計(jì)算采用一級動(dòng)力學(xué)方程式(Ct=C0e-kt)[10]。

圖3顯示，嘧菌環(huán)胺在灌溉水中的消解趨勢符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，半衰期為3.12 d。隨著時(shí)間的延長，嘧菌環(huán)胺含量降低，在1和3 d時(shí)的濃度分別較0 d降低5.48%和47.3%，在5、6和7 d時(shí)濃度僅為0 d時(shí)的6.31%、3.55%和2.33%。表明嘧菌環(huán)胺在室溫、正常光照條件下，1 d內(nèi)穩(wěn)定，在2 d后降解速度加快，4 d后降解速度減慢并趨于穩(wěn)定。揭示了嘧菌環(huán)胺在正常環(huán)境條件下的降解規(guī)律，為實(shí)際生產(chǎn)中如何施藥提供了一定的參考依據(jù)。

圖3 嘧菌環(huán)胺在灌溉水中殘留量消解動(dòng)態(tài)

2.4 方法的線性范圍、加標(biāo)回收率、精密度和定量限

取0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100、0.200、0.500 mg·L-1質(zhì)量濃度的嘧菌環(huán)胺農(nóng)藥，按優(yōu)化色譜條件進(jìn)樣1 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Y=3 057.4X-14 731，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，以信噪比S/N≥3估算儀器的檢出限(LOD)，S/N≥10估算儀器的定量下限(LOQ)分別為0.083和0.270 μg·kg-1。

稱取不含農(nóng)藥的空白大米及灌溉水樣品，分別添加0.010 0、0.100和1.00 mg·kg-1不同水平的嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)3次，添加回收試驗(yàn)結(jié)果見表2，空白基質(zhì)及加標(biāo)回收氣質(zhì)色譜結(jié)果見圖1。

表2 嘧菌環(huán)胺加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 小結(jié)

本文建立了氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜分析大米及其灌溉水中嘧菌環(huán)胺殺菌劑的農(nóng)藥殘留方法，大米、灌溉水樣品分別用乙腈和二氯甲烷萃取，大米樣品用NH2- SPE固相萃取柱凈化后，進(jìn)入GC- MS/MS檢測分析，利用外標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果表明，該方法靈敏度高、回收率好，可以用于嘧菌環(huán)胺的檢測分析；模擬大田實(shí)際環(huán)境，對嘧菌環(huán)胺在水中的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該藥在室溫、正常光照條件下，24 h內(nèi)穩(wěn)定，在48 h后降解速度加快，96 h后降解速度減慢并趨于穩(wěn)定。揭示了嘧菌環(huán)胺在正常環(huán)境條件下的降解規(guī)律，為實(shí)際水稻生產(chǎn)如何施藥提供了一定的參考依據(jù)。

[1] 潘東，楊紅，劉賢進(jìn). 葡萄中嘧菌環(huán)胺的氣相色譜分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25(5)：1199- 1200.

[2] 何永梅，賈世宏. 內(nèi)吸性殺菌劑—嘧菌環(huán)胺[J].農(nóng)化市場十日訊，2011(28)：32.

[3] 艾爽，侯昌亮，胡寒哲，等. 8種殺菌劑對水稻紋枯病菌的室內(nèi)毒力比較[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版(石油/農(nóng)學(xué))，2014，11(2)：4- 5.

[4] 徐桂方，陳二龍，姜國慶，等. 早稻稻瘟病田間藥效試驗(yàn)[J].植物醫(yī)生，2015，28(4)：32- 33.

[5] European pesticides database of maximum residue levels(Last update：2016- 02- 17). http：//ec.europa.eu/food/plant/pesticides/max_residue_ levels/index_en.htm.

[6] OTERO R R，RUIZ C Y，GRANDE B C，et al. Solid- phase microextraction- gas chromatographic- mass spectrometric method for the determination of the fungicides cyprodinil and fludioxonil in white wines[J]. Journal of Chromatography A，2002，942(1/2)：41- 52.

[7] LUIS V F，ANA S，JESS S A，et al. Determination of cyprodinil and fludioxonil in the fermentative process of must by high- performance liquid chromatography- diode array detection[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2008，88(11)：1943- 1948.

[9] 王素利，陳振山，江樹人，等. 農(nóng)藥殘留樣本貯存穩(wěn)定性概述[C]//農(nóng)藥與環(huán)境安全國際會議論文集. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2005.

[10] GAO J，GARRISON A W，HOEHAMER C，et al. Uptake and phytotransformation of organophosphorus pesticides by axenically cultivated aquatic plants[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2000，48(12)：6114- 6120.

(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2016- 10- 24

劉芯成(1987—)，助理工程師，大專，從事農(nóng)獸藥殘留檢測工作，E- mail：15185227@qq.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170335

S511

B

0528- 9017(2017)03- 0472- 04

文獻(xiàn)著錄格式：劉芯成，黃亮，朱萌萌，等. 氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米及其灌溉水中嘧菌環(huán)胺的殘留量[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(3)：472- 475.