海洋放線菌A3202在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征比較

鹿連明，杜丹超，胡秀榮，蒲占湑，黃振東，張利平，陳國慶

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 浙江省柑橘研究所，浙江 臺州 318020)

海洋放線菌A3202在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征比較

鹿連明，杜丹超，胡秀榮，蒲占湑，黃振東，張利平，陳國慶*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 浙江省柑橘研究所，浙江 臺州 318020)

為明確海洋放線菌A3202發(fā)酵培養(yǎng)所需的最佳條件，促進對其活性代謝產(chǎn)物抑菌活性研究的深入開展，測定了菌株A3202在不同固體和液體培養(yǎng)基中的形態(tài)特征。結(jié)果表明：菌株A3202在不同瓊脂含量高氏1號培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征存在明顯差異，瓊脂含量2.0%以下的培養(yǎng)基不利于菌株A3202的氣生菌絲生長及孢子形成；該菌株在相同配方但不同黃豆粉來源的黃豆粉培養(yǎng)基上的形態(tài)特征也表現(xiàn)出明顯差異，現(xiàn)磨生黃豆粉制備的培養(yǎng)基更利于菌株菌絲生長和產(chǎn)孢。

海洋放線菌； 培養(yǎng)基； 培養(yǎng)特征； 黃豆粉

海洋微生物由于長期在高鹽、高壓、低溫、無光照的海洋環(huán)境中生長繁殖，通常具有獨特的代謝途徑和遺傳背景，形成了與陸生微生物不同的生理性狀和特征，使其具備了產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能特殊的活性物質(zhì)的能力[1]。目前，普遍認為海洋微生物及其活性物質(zhì)是新型醫(yī)藥研發(fā)的重要資源[2]。而在利用海洋微生物防治植物病害方面，目前雖然相關(guān)的研究報道較少，但卻顯示出了良好的開發(fā)利用潛力。

近年來，本課題組從海洋生物中分離了多種對植物病原菌具抑菌活性的放線菌。其中，菌株A3202對柑橘青霉病菌(Penicilliumitalicum)、柑橘綠霉病菌(P.digitatum)和柑橘炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)等多種植物病原菌具有較強的抑菌活性，表現(xiàn)出較好的開發(fā)利用前景。為此，本研究測定了該菌株在不同固體和液體培養(yǎng)基中的形態(tài)特征，以期明確發(fā)酵培養(yǎng)所需的最佳條件，為今后對其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

海洋放線菌A3202為本課題組從海洋生物鱗笠藤壺(Tetraclitasquamosa)中分離獲得，其對柑橘青霉病菌、綠霉病菌和炭疽病菌等多種植物病原菌均具較強的抑菌活性，初步鑒定該菌株為米修鏈霉菌(Streptomycesmisionensis)[3]，接種于高氏1號斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

高氏合成1號液體培養(yǎng)基購自杭州百思生物技術(shù)有限公司，配方為：可溶性淀粉2.0%、硝酸鉀0.1%、磷酸氫二鉀0.05%、硫酸鎂0.05%、氯化鈉0.05%、硫酸亞鐵0.001%，向其中添加不同量的瓊脂至終濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%。加入蒸餾水煮沸溶解，分裝至三角瓶中，于121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

液體發(fā)酵用培養(yǎng)基為黃豆粉培養(yǎng)基，配制方法為：稱取20 g黃豆粉，加入到1 000 mL蒸餾水中煮沸30 min，4層紗布過濾后取濾液，加入葡萄糖20 g、硫酸銨5 g、氯化鈉8 g和碳酸鈣2 g，加熱溶解后，用蒸餾水定容至1 000 mL，分裝至三角瓶中，于121 ℃高壓滅菌20 min后備用。所用黃豆粉分別為購自天津利發(fā)隆化工科技有限公司的發(fā)酵用黃豆粉，購自淘寶網(wǎng)上農(nóng)家磨制的黃豆粉，以及利用多功能粉碎機研磨生大豆所得的黃豆粉。

1.3 菌株活化

取4 ℃冰箱保存的菌株A3202，在超凈工作臺中用無菌接種環(huán)刮取培養(yǎng)基表面菌絲，于新鮮制備的高氏1號培養(yǎng)基中劃線，然后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長出，作為下一步試驗用菌種。

1.4 菌株接種

用無菌接種環(huán)刮取上述培養(yǎng)活化的菌株A3202的菌絲，在含1.0%～3.5%瓊脂的高氏1號培養(yǎng)基平板上劃線，然后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用無菌打孔器在上述高氏1號培養(yǎng)基上打取直徑5 mm的菌餅，將其接種至黃豆粉液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫搖床， 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)。

1.5 培養(yǎng)特征觀察

在不同培養(yǎng)時間，肉眼直接觀察并記錄不同瓊脂含量高氏1號培養(yǎng)基上菌株A3202的培養(yǎng)特征。用移液槍吸取20 μL各黃豆粉培養(yǎng)基中菌株A3202的培養(yǎng)液，滴加到載玻片上，置于光學顯微鏡下觀察培養(yǎng)產(chǎn)物的形態(tài)特征并拍照。比較不同瓊脂含量高氏1號培養(yǎng)基及各黃豆粉液體培養(yǎng)基中菌株的培養(yǎng)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株A3202在高氏1號培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)第3、6、10和24天，觀察并記錄菌株A3202的培養(yǎng)特征，結(jié)果見表1，菌株A3202在不同瓊脂含量高氏1號培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征如圖1所示。菌株A3202在不同瓊脂含量高氏1號培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征存在明顯差異，瓊脂含量2.0%以下的培養(yǎng)基不利于菌株A3202氣生菌絲生長及孢子的形成，而在瓊脂含量2.0%及以上的培養(yǎng)基上，菌株A3202生長速度較快，氣生菌絲致密發(fā)達，且易于產(chǎn)生大量孢子。

表1 菌株A3202在不同瓊脂含量高氏1號培養(yǎng)基上的形態(tài)特征

A～E為瓊脂含量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%

2.2 菌株A3202在不同黃豆粉培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

28 ℃恒溫搖床180 r·min-1振蕩培養(yǎng)第3、7、14 d，在光學顯微鏡下觀察各培養(yǎng)產(chǎn)物的形態(tài)特征，結(jié)果見表2，菌株A3202在各黃豆粉培養(yǎng)基中的形態(tài)特征如圖2所示?？梢钥闯?，菌株A3202在相同配方但不同黃豆粉來源的培養(yǎng)基中形態(tài)特征表現(xiàn)出明顯差異。在生黃豆現(xiàn)磨成粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)一定時間后，菌株A3202可產(chǎn)生大量的菌絲和孢子，而在購買的黃豆粉成品制備的培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，菌株A3202只產(chǎn)生大量孢子，難以觀察到菌絲。

表2 菌株A3202在不同黃豆粉培養(yǎng)基上的形態(tài)特征

注：培養(yǎng)基A的黃豆粉為天津利發(fā)隆化工科技有限公司的發(fā)酵用黃豆粉，培養(yǎng)基B的黃豆粉為淘寶網(wǎng)上農(nóng)家磨制的黃豆粉，培養(yǎng)基C的黃豆粉為生大豆現(xiàn)行研磨的黃豆粉。

A，菌株A3202的橢圓形孢子；B，菌株A3202的孢子變?yōu)殚L條形；C，菌株A3202的菌絲圖2 菌株A3202在黃豆粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的不同形態(tài)特征

3 小結(jié)與討論

菌株A3202為本課題組從海洋生物鱗笠藤壺中分離獲得的放線菌，其對柑橘青霉病菌、綠霉病菌和炭疽病菌等多種植物病原菌均具較強的抑菌活性。為進一步探索該菌株對植物病害的生防潛能，我們對其發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，菌株A3202在不同批次高氏1號培養(yǎng)基中培養(yǎng)特征存在明顯差異，有時難以培養(yǎng)獲得氣生菌絲發(fā)達的菌落，影響了菌株的保藏及擴大培養(yǎng)。為分析產(chǎn)生該問題的原因及查找解決辦法，以保障今后對菌株A3202開發(fā)利用的順利進行，特開展了本研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高氏1號培養(yǎng)基中瓊脂含量的高低與菌株A3202氣生菌絲的生長情況具有明顯相關(guān)性，相對高瓊脂濃度的高氏1號培養(yǎng)基利于菌株A3202氣生菌絲的生長及產(chǎn)孢，分析認為菌株A3202在相對干燥的環(huán)境中更易于生長產(chǎn)孢。菌株A3202在不同黃豆粉制備的黃豆粉培養(yǎng)基中形態(tài)特征表現(xiàn)出明顯差異，在現(xiàn)磨生黃豆粉制備的培養(yǎng)基中生長良好，可產(chǎn)生大量菌絲和孢子，而在其他2種黃豆粉成品制成的培養(yǎng)基中只產(chǎn)生孢子，無菌絲形成。推測可能是現(xiàn)磨的生黃豆粉較黃豆粉成品能提供更多的營養(yǎng)，從而利于菌株A3202孢子的萌發(fā)、菌絲的生長及產(chǎn)孢。

在利用海洋微生物防治植物病害方面，人們已開展了諸多有益的探索。如聶亞鋒等[4]從海水中分離的海洋細菌PY- sw- 1對白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)等多種病原菌表現(xiàn)出較強的抑制活性；何紅等[5]從海洋紅樹內(nèi)分離的海洋細菌CⅢ- 1除對辣椒青枯病有良好的防效外，還能明顯促進辣椒的生長；邵彥坡等[6]從淺海海域中分離的放線菌菌株B5的發(fā)酵液對西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)等13種植物病原真菌的菌絲生長抑制率均在80%以上，且具有較好的傳代穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性。本課題組已有研究表明，放線菌A3202在植物病害防治方面具有良好的開發(fā)應用前景，為此，在優(yōu)化該菌株發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，將進一步探索其對植物病害的生防潛能，為今后開發(fā)相關(guān)生防菌制劑提供依據(jù)。

[1] 尚卓, 王斌貴. 海洋真菌來源的抗菌活性物質(zhì)研究:方法與進展[J]. 生命科學, 2012, 24(9): 997- 1011.

[2] 劉全永, 胡江春, 薛德林, 等. 海洋微生物生物活性物質(zhì)研究[J]. 應用生態(tài)學報, 2002, 13(7): 901- 905.

[3] 鹿連明, 杜丹超, 程保平, 等. 海洋放線菌A3202的分離鑒定及其對柑橘采后病害的防效[J]. 植物保護學報, 2014,41(3):327- 334.

[4] 聶亞鋒, 劉永鋒, 李德全, 等. 海洋細菌PY- sw- 1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)及其抑菌活性[J]. 植物保護學報, 2008, 35(4): 373- 374.

[5] 何紅, 歐雄常, 王立才, 等. 紅樹內(nèi)生海洋細菌CⅢ- 1菌株對辣椒青枯病的防病效果[J]. 植物保護學報, 2008, 35(6): 497- 500.

[6] 邵彥坡, 方麗萍, 魏少鵬,等. 海洋放線菌B5菌株發(fā)酵液抗菌譜及穩(wěn)定性研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報, 2007, 16(3):248- 251, 256.

(責任編輯：侯春曉)

2016- 09- 26

臺州市科技計劃項目(131ky20)

鹿連明(1979—)，男，山東安丘人，博士，副研究員，研究方向為柑橘病蟲害，E- mail: minglu79@126.com。

陳國慶(1964—)，男，浙江諸暨人，本科，研究員，研究方向為柑橘病蟲害，E- mail: cgq5373@163.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170326

Q936

A

0528- 9017(2017)03- 0446- 03

文獻著錄格式：鹿連明，杜丹超，胡秀榮，等. 海洋放線菌A3202在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征比較[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2017，58(3)：446- 449.