沙門菌常見O抗原和H抗原熒光PCR檢測方法評估

曹陽，韓營營，李杰，闞飆，閆梅英

中國疾病預防控制中心 傳染病預防控制所，北京 102206

沙門菌常見O抗原和H抗原熒光PCR檢測方法評估

曹陽，韓營營，李杰，闞飆，閆梅英

中國疾病預防控制中心 傳染病預防控制所，北京 102206

目的：評估沙門菌常見A～F血清群O抗原和H抗原熒光PCR檢測方法對不同血清型沙門菌的檢測效果。方法：選用不同血清型沙門菌制備模板，運用沙門菌O抗原A～F群及不同H抗原熒光PCR檢測試劑盒對這些菌株進行擴增檢測，分別計算不同血清型檢測結(jié)果的靈敏度、特異度、檢測下限、假陽性率、假陰性率、Kappa值等指標并進行分析。結(jié)果：對7種不同沙門菌O抗原的檢測靈敏度為85.71%～100.00%，特異度為66.67%～100.00%；對7種不同沙門菌H抗原的檢測，H1,5及Hi-l的靈敏度不高，分別為35.71%及57.14%，但特異度均較高（87.50%～100.00%）；經(jīng)Fisher精確檢驗，除H1,5陽性檢測的P＞0.05（P=0.162），其余為P＜0.05；C1、C2、D1、E、F血清群及H抗原1,6、1,7、g,s,t、g,m的檢測結(jié)果與血清凝集結(jié)果的一致性較高（Kappa值均大于0.75），而H1,5及Hi-l的檢測結(jié)果與血清凝集結(jié)果的一致性很差（Kappa值分別為0.302及0.492）；試劑盒對不同O/H抗原核酸檢測擴增效率較好，最低檢出限為7～137608拷貝/反應。結(jié)論：除H1,5抗原外，該熒光PCR檢測試劑盒對沙門菌O/H抗原不同血清型的檢測效果較好，優(yōu)于傳統(tǒng)血清凝集方法，可顯著提高血清型鑒定時效，有利于疾病或暴發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)。

沙門菌；血清型；O抗原；H抗原；熒光PCR

沙門菌是常見的引起食源性疾病的致病菌。2007年世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)2610種血清型的沙門菌[1]。至2006年，我國也已檢出近300種沙門菌血清型[2]。傳統(tǒng)的血清型鑒定耗時較長，不利于及時進行疾病暴發(fā)時追蹤傳染源以及分析比較菌株間的差異。目前已有很多關(guān)于沙門菌血清型鑒定的方法學研究，如聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、核酸探針技術(shù)、環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）及基因芯片技術(shù)等分子生物學方法，可對沙門菌進行較為快速的鑒定[3-5]。但是，投入使用的商品化的沙門菌血清型檢測試劑盒較少，且現(xiàn)有的針對沙門菌血清型檢測的研究，一次可以鑒定出的血清型種類有限，多集中于腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌或傷寒沙門菌及副傷寒沙門菌中1種或2～3種血清型的鑒定[6-7]。天津芯片技術(shù)有限責任公司研發(fā)的沙門菌O抗原A～F不同血清群及7種常見H抗原不同血清型核酸擴增（PCR-熒光探針法）檢測試劑盒（以下簡稱沙門O/H抗原核酸檢測試劑盒）可分別同時檢測7種沙門菌O抗原和7種H抗原。該試劑盒采用Taq?Man熒光探針技術(shù)，利用沙門菌O抗原及H抗原不同血清型特異的熒光探針與靶核酸雜交，通過熒光PCR擴增來實時判斷沙門菌屬O抗原及H抗原的型別。但該檢測試劑盒用于沙門菌血清型的判定效果如何，尚無實驗室證據(jù)。本研究中，我們利用傳統(tǒng)血清凝集鑒定的不同血清型菌株，對該試劑盒的特異性、敏感性進行了評估，為其進一步推廣應用及完善提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株選擇

根據(jù)O抗原A～F群血清型及7種常見H抗原，隨機挑選252株不同血清型菌株進行試驗，包括腸炎沙門菌、山夫登堡沙門菌、甲型副傷寒沙門菌等34種血清型（表1），每種抗原測試菌株平均為18株，其中含特異性靶抗原的菌株10株、非特異性菌株8株。實驗用菌株來自中國疾病預防控制中心傳染病所腹瀉病室，均采用API 20E試劑條及血清凝集試驗進行了確認。沙門菌抗血清購自丹麥國家食品研究所并在有效期內(nèi)使用。

1.2 引物信息

依據(jù)O抗原及H抗原編碼基因的可變區(qū)設計引物及探針，具體引物及探針信息涉及商業(yè)機密，故在此不做詳細表述。

1.3 檢測方法

1.3.1 模板制備 采用熱裂解法。挑取單個純菌培養(yǎng)的新鮮菌落于100 μL純水中，制成懸濁液，100℃煮沸10 min，冰浴10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清作為反應模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 熒光PCR 采用沙門菌O抗原A～F（A、B、C1、C2、D1、E、F）不同血清型核酸擴增（PCR-熒光探針法）檢測試劑盒及沙門菌H抗原7種（1,5、1,6、1,7、i-l、g,s,t、g,m、f,g）常見不同血清型核酸擴增（PCR-熒光探針法）檢測試劑盒（天津芯片有限公司研發(fā)且在有效期內(nèi)使用）進行熒光PCR檢測，按照試劑盒說明書進行。具體包括：配制25 μL反應體系，其中模板量為1 μL，酶0.3 μL（廠家提供），反應所需引物及反應緩沖液均由廠家制備成凍干粉，使用時溶于23.7 μL超純水中。采用CFX96熒光PCR儀（擴增條件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，共35個循環(huán)）。Ct值＜33判為陽性結(jié)果，Ct值＞35為陰性結(jié)果。如果33≤Ct值＜35，則復檢2次：若Ct值無，判為陰性結(jié)果；若其中至少1次Ct值＜35，判為陽性結(jié)果。

1.3.3 細菌總DNA的提取及檢測下限測定 每種O抗原及H抗原選取1株代表菌株，從平板上挑取單克隆，在LB液體中培養(yǎng)6～8 h，至D600nm值約為0.6時收集菌體，用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega公司）提取細菌總DNA，嚴格按說明書進行。對提取的總DNA測定濃度后，進行1∶10及1∶3梯度稀釋，不同濃度梯度各取1 μL作為熒光PCR檢測模板，測定該試劑盒檢測下限或敏感度。以模板DNA拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標、相應的Ct值為縱坐標，繪制標準曲線方程。

1.4 統(tǒng)計分析

運用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析。分別計算試劑盒中7種沙門O抗原及7種沙門H抗原對沙門血清型檢測結(jié)果的靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率，并用χ2檢驗、McNemar檢驗、Fisher精確檢驗進行率的比較，P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義；計算Kappa值以評價與血清凝集結(jié)果的一致性，本研究按照一般規(guī)則，認為Kappa值大于0.75一致程度較好，小于0.5一致程度較差。

2 結(jié)果

2.1 O/H抗原不同血清型核酸擴增效果評估

利用252株沙門菌，以血清凝集結(jié)果作為金標準，分別評估沙門O抗原及H抗原檢測試劑盒對不同沙門血清型的鑒定效果（表2），其中O抗原共進行136個檢測反應（含7個陽性對照及相應的空白對照），H抗原共進行162個檢測反應（含7個陽性對照及相應的空白對照）。7種不同沙門菌O抗原檢測的靈敏度不同，但均較高，其中C1、C2、E、F的靈敏性均高達100.00%，次之為D1群（90.91%），最低為B群（80.00%）。不同O抗原檢測的特異度也不同，最低為A群（66.67%），最高為E群，達100.00%。在7種不同沙門氏菌H抗原的檢測中，H1,5的靈敏度最低，僅為35.71%，次之為Hi-l相（靈敏度為57.14%），但H抗原檢測的特異度均較高，特異度為87.50%～100.00%（表2）。經(jīng)Fisher精確檢驗，除H1,5抗原檢測的P＞0.05（P=0.162），其余為P＜0.05。O抗原C1、C2、D1、E、F群及H1,6、1,7、g,s,t、g,m的檢測結(jié)果與血清凝集結(jié)果的一致性較高（Kappa值均大于0.75），但H1,5及Hi-l的檢測結(jié)果與血清凝集結(jié)果的一致性很差（Kappa值分別為0.302及0.492）。

表1 實驗用菌株信息

表2 沙門菌O/H抗原不同血清型核酸擴增效果評估

2.2 純菌樣本中O/H抗原核酸擴增檢測下限測定

將提取的純DNA以1∶3梯度稀釋5個濃度，以此為模板檢測沙門O/H抗原核酸檢測試劑盒反應的敏感性。以模板DNA拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標、相應的Ct值為縱坐標繪制標準曲線方程（表3）。R2值均大于0.9，說明擴增效率均較高，但針對不同抗原，其擴增效率存在差異。如沙門菌H1,6群血清型（圖1）及O：B群血清型（圖2）的擴增效果最好，次之為Hg,m、H1,7，Hf,g擴增效率相對最低（圖譜未展示）。另外，不同O/H抗原核酸檢測最低檢出限亦不同（表4）。對沙門菌O:B群血清型檢測的敏感性最高，最低檢測下限為0.004 fg/μL，約7個拷貝/反應。其次為沙門菌O：C2、D1、E及H：i-l、g,m，檢測下限平均約0.05 fg/ μL，約92個拷貝/反應。對沙門菌O：A群及Hf,g群血清型檢測的敏感性較差，平均約0.05 ng/μL，約9200個拷貝/反應。

表3 純菌樣本中O/H抗原不同血清型核酸擴增標準曲線方程

圖1 沙門菌H1,6群血清型檢測擴增曲線（A）及標準曲線方程（B）

表4 純菌樣本中O/H抗原不同血清型核酸擴增最低檢出限

3 討論

O抗原和H抗原作為沙門菌的主要抗原，用于沙門菌的血清學分型。具有共同O抗原的各血清型沙門菌歸為一群，再根據(jù)H抗原的差異分為不同的血清型[8]。A～F群血清型，尤其是A、B、C1、C2、D1、E、F群沙門菌為臨床常見，涵蓋我國前50位沙門菌血清型，其中B群的鼠傷寒、C群的豬霍亂和D群的腸炎沙門菌是引起食物中毒最常見的病原體[9]。在A～F群沙門菌中，H抗原多種多樣，但其中7種（1,5、1,6、1,7、i-l、g,s,t、g,m、f,g）占全部已有A～F群沙門菌血清型的53%左右。通過引物及探針篩選，最終建立了檢測7種O群（A～F群）抗原及7種H抗原的沙門菌熒光PCR試劑盒，使我們在面對沙門菌感染暴發(fā)尤其是食物中毒來源的沙門菌時，運用該試劑盒可以同時判定這些菌株所具有的O抗原及H抗原，大致了解該暴發(fā)中的優(yōu)勢血清型，在此基礎上，輔助少量、小范圍、有針對性的O、H血清因子做玻片凝集即可確定血清型，可大大節(jié)省傳統(tǒng)血清凝集所需要的時間，有效減少血清凝集結(jié)果的不確定性及由于血清質(zhì)量問題造成的血清型誤判。

目前已有基于基因擴增或雜交的沙門菌分子血清分型方法及應用的報道[10-14]，如Luminex公司的沙門菌分子血清分型試劑盒可檢測常見的前100種血清型[13-14]，但價格昂貴（每株菌的檢測費用約為300元人民幣），需特定的液相芯片平臺（儀器昂貴），操作過程相對復雜。結(jié)合我國臨床及疾病控制系統(tǒng)實驗室硬件實際條件，在已知基因及PCR設備易得的基礎上，熒光PCR不失為一種首選的理想檢測方法。利用TaqMan探針法，以沙門菌O/H抗原核酸為靶標，在國內(nèi)及國際上建立沙門菌常見抗原或血清型的實時熒光PCR檢測方法，相對于采用熒光染料SYBR Green等的方法，避免了引物二聚體和其他非目標DNA擴增并與染料相結(jié)合引起非特異信號的現(xiàn)象，提高了實驗的特異性、敏感性[15]。

本研究中，沙門菌O/H抗原核酸檢測試劑盒對不同抗原的檢測靈敏度不一致。對O抗原的檢測靈敏度均超過85%，其中C1、C2、E及F達100%。但檢出O抗原的特異度較H抗原低，表明其假陽性結(jié)果較多，可能與引物設計或操作過程中的細微污染有關(guān)[16]。該試劑盒對H抗原的靈敏度稍差，檢出1,5項的靈敏度僅35.71%，可能與1, 5是H抗原的非特異項，目前針對該抗原的特異性基因研究較少，本試劑盒所設計的引物特異性可能不夠理想等有關(guān)，有待改善引物及探針序列，擴大樣本量做進一步研究。另外，分子生物學方法在檢測準確性方面也存在一定的誤差，與其他方法的聯(lián)用是未來發(fā)展方向[17]。

圖2 沙門菌O：B群血清型檢測擴增曲線（A）及標準曲線方程（B）

沙門菌O/H抗原核酸檢測試劑盒對O抗原的敏感性總體強于對H抗原的檢測，尤其對B群的O抗原，低于10拷貝/反應即可檢出。其他幾種抗原檢測敏感性尚可，檢測下限為102～104拷貝/反應，對A群O抗原及H抗原f,g項的檢測敏感性差，檢測下限為105拷貝/反應。雖然不及程蘇云[18]等所建方法的最低檢測限為7.1×10-2拷貝/μL的敏感程度，但考慮該試劑盒檢測的主要目的在于定性，一般水煮模板或純菌提取DNA的濃度遠高于該檢測下限，故不能單純以檢測敏感性不高而否定該試劑盒的檢測效果。

總之，本研究結(jié)果表明，國內(nèi)率先建立的基于抗原編碼基因的沙門菌分子血清分型-沙門菌常見O及H抗原熒光PCR檢測試劑盒除對H抗原1,5項檢測效果不理想外，對其他幾種O/H抗原檢測結(jié)果尚可，與血清凝集鑒定結(jié)果的一致性較高，結(jié)合其他確證手段，可初步試用于沙門菌純菌實驗室血清分型。

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Assessment of Fluorescent PCR Assay for Detecting Gomi?nant O/H Serogroups of Salmonella

CAO Yang,HAN Ying-Ying,LI Jie,KAN Biao,YAN Mei-Ying*
National Institute for Communicable Disease Prevention and Control,Chinese Center for Disease Control and Pre?vention,Beijing 102206,China

Objective:To evaluate the efficiency of fluorescent PCR assays for detecting main Salmonella sero?groups.Methods:Different serotypes of Salmonella were purified and detected by fluorescent PCR assays using dif?ferent O&H antigens detection kits.The specificity,sensitivity,lower limit of detection,positive and negative pre?dicted values,and Kappa value for different O&H antigens were calculated,and evaluated by the gold standard se?rum agglutination test.Results:The results showed that the sensitivity of 7 groups of O antigens ranged from 85.71%to 100.00%and the specificity ranged from 66.67%to 100.00%.The higher specificity was found for the detection of 7 groups of H antigens（87.50%～100.00%）.However,the sensitivity of H1,5 and Hi-l were lower with 35.71%and 57.14%,respectively.The H antigen assay exhibited a high consistency with serum agglutination test,except the detection of H1,5 and Hi-l（Kappa=0.302 and 0.492,respectively）.The amplification efficiency of different O/H antigens was high,and the lower limit of detection ranged from 7～137608 copies per action.Conclu?sion:Except for detecting H1,5,the assay of O&H antigens using fluorescent PCR has a better performance com?pared with traditional serotyping method for distinguishing different serogroups of Salmonella,especially at the as?pect of time saving,and it will be useful for early detection of Salmonella infection or outbreaks.

Salmonella;serotype;O antigens;H antigens;Taqman PCR

R392.1;Q78

A

1009-0002（2017）02-0084-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.003

2016-10-26

國家科技重大專項（2013ZX10004216）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2013CB127204）

曹陽（1990-），女，碩士研究生

閆梅英，（E-mail）yanmeiying@icdc.cn

*Corresponding anthor,E-mail:yanmeiying@icdc.cn