大豆中主要抗原蛋白表位的研究進(jìn)展

娜仁高娃，趙 元，強(qiáng)嘉楠，孫趙洋，潘 麗，袁志杰

（動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

大豆中主要抗原蛋白表位的研究進(jìn)展

娜仁高娃，趙 元*，強(qiáng)嘉楠，孫趙洋，潘 麗，袁志杰

（動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

本文簡(jiǎn)要介紹了大豆中主要的抗原蛋白如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K等具有強(qiáng)烈的致敏原性的抗原蛋白其抗原表位的研究進(jìn)展，將從大豆抗原蛋白抗原表位的鑒定方法和研究進(jìn)展兩方面做一綜述。

大豆；抗原蛋白；表位；致敏

大豆作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的植物性蛋白來(lái)源被廣泛應(yīng)用在食品及飼料工業(yè)中，而大豆中含有的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子可以引發(fā)幼齡動(dòng)物過(guò)敏反應(yīng)，導(dǎo)致其腸道損傷進(jìn)而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，使幼齡動(dòng)物對(duì)飼料的消化利用率降低，對(duì)畜牧業(yè)造成很大危害。大豆中的抗原蛋白可以分為2S、7S、11S和15S 4個(gè)組成成分[1-4]。大豆球蛋白含糖蛋白較少，屬于11S球蛋白，是大豆蛋白中最大的單體蛋白，其中酸性亞基可引起人體和動(dòng)物的過(guò)敏[5]。凝集素、β-淀粉酶、Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K、脂肪氧化酶和β-伴大豆球蛋白共同構(gòu)成7S組分，β-伴大豆球蛋白是由α、α'和β 3個(gè)亞基組合而成的三聚體，并以α和α'亞基的抗原性最強(qiáng)[6]。2S組分有胰蛋白酶抑制劑、細(xì)胞色素c尿酶素、2S球蛋白等，15S組分占大豆蛋白的4.6%，它不是單純的某種蛋白質(zhì)，而是由多種蛋白質(zhì)分子構(gòu)成[7]。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)大豆抗原蛋白進(jìn)行了深入研究，而作為蛋白質(zhì)致敏的重要“元兇”——抗原表位，包括大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K的抗原表位也得到了進(jìn)一步揭示。大豆抗原蛋白抗原表位的研究可以對(duì)單克隆抗體的制備、飼料原料中抗原蛋白含量的降低、動(dòng)物致敏機(jī)理的研究等工作起指導(dǎo)性作用，因而大豆抗原蛋白的研究十分重要。

1 抗原表位的定義、功能意義

抗原表位又被稱(chēng)為抗原決定簇，通常指抗原分子中可以決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，是抗原分子中最主要的功能單位，可以有效地刺激機(jī)體發(fā)生細(xì)胞免疫和體液免疫[8-10]。根據(jù)抗原表位能夠發(fā)生特異性免疫應(yīng)答的程度，可以用免疫優(yōu)勢(shì)表位、亞優(yōu)勢(shì)表位和隱性表位來(lái)區(qū)分抗原表位。根據(jù)其結(jié)合受體的差異，抗原表位可以分為T(mén)細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位；按照結(jié)構(gòu)的不同可以分為線性表位和構(gòu)象表位，通常由5～17個(gè)氨基酸殘基或5～7個(gè)多糖殘基或核苷酸組成[11-12]。線型表位為T(mén)細(xì)胞表位和一部分B細(xì)胞表位，構(gòu)象型表位均為B細(xì)胞表位[13]，線性表位是由在抗原分子上的一段連續(xù)不間斷的氨基酸序列組成，構(gòu)象表位則是由于蛋白質(zhì)特有的三級(jí)結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的空間折疊，從而發(fā)生本不連續(xù)的氨基酸在結(jié)構(gòu)上的相互接近，進(jìn)而形成次級(jí)結(jié)構(gòu)而組成的。大豆抗原蛋白的晶體結(jié)構(gòu)目前已經(jīng)被解析，而抗原表位存在的某些特征也體現(xiàn)在了晶體結(jié)構(gòu)上，如大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的晶體結(jié)構(gòu)（圖1和圖2）[13-14]，常用于抗原表位預(yù)測(cè)的依據(jù)主要有親水性、可及性和可塑性?？乖砦皇强乖贵w能夠發(fā)生特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)，一旦抗原表位遭到破壞，抗原蛋白就無(wú)法引發(fā)動(dòng)物的過(guò)敏反應(yīng)。研究表明，某些種類(lèi)的免疫調(diào)節(jié)劑，如維生素C和硫辛酸，可以特異性阻斷由IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)[15]，在經(jīng)由食物所產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)中，過(guò)敏原并不是通過(guò)其完整的大分子結(jié)構(gòu)來(lái)發(fā)揮致敏作用，而是通過(guò)胃腸道的消化所產(chǎn)生的含有過(guò)敏原抗原表位的蛋白片段與抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，從而使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。因此，要對(duì)大豆抗原蛋白進(jìn)行研究，首要工作就是要研究清楚大豆抗原蛋白的抗原表位。

2 大豆抗原表位的研究方法

圖1 大豆球蛋白的空間結(jié)構(gòu)

圖2 β-伴大豆球蛋白的空間結(jié)構(gòu)

2.1 生物信息學(xué)法預(yù)測(cè) 由于大豆抗原蛋白抗原表位由氨基酸構(gòu)成，因而在試驗(yàn)中會(huì)使用生物信息學(xué)軟件來(lái)對(duì)抗原表位的氨基酸序列做出預(yù)測(cè)。關(guān)于大豆抗原蛋白線性表位的預(yù)測(cè)均基于蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，常用指標(biāo)包括氨基酸的理化特性、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、統(tǒng)計(jì)顯著性等指標(biāo)，由此獲得一系列具體的計(jì)算方式，如親水性越高的氨基酸殘基越容易形成抗原表位、可及性高說(shuō)明該部分氨基酸殘基有較大的幾率與相應(yīng)抗體結(jié)合，而活動(dòng)性較強(qiáng)的氨基酸殘基具有較大的可塑性，更容易構(gòu)成抗原表位[16-20]。但以上計(jì)算指標(biāo)在單獨(dú)運(yùn)用時(shí)，具有一定的局限性，因此常被聯(lián)合使用，用以提高線性表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率。對(duì)于構(gòu)象表位的預(yù)測(cè)通?；诘鞍踪|(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)所具有的特點(diǎn)，但由于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，預(yù)測(cè)難度相較線性表位來(lái)講更難，準(zhǔn)確性也越低。

2.2 蛋白質(zhì)酶解法 酶解法是一個(gè)能夠直接定位線性及構(gòu)象性抗原表位的方法，又被稱(chēng)做蛋白質(zhì)足跡分析（Protein Footprinting），指利用多種或單一酶將過(guò)敏原分解為多個(gè)短肽段，再逐一檢測(cè)這些短肽是否具有過(guò)敏原性，進(jìn)而確定哪部分肽段與過(guò)敏反應(yīng)有關(guān)，從而獲得構(gòu)成抗原表位的氨基酸序列[17]?；蚴菍⒖乖鞍紫扰c抗體進(jìn)行反應(yīng)，而后利用相應(yīng)的酶來(lái)進(jìn)行水解，抗原表位與抗體結(jié)合的部位會(huì)受到保護(hù)而不與酶發(fā)生反應(yīng)，從而檢測(cè)出相應(yīng)的抗原表位[9,13,16]。酶解法研究抗原表位的過(guò)程比較復(fù)雜，酶解的條件、抗原-抗體結(jié)合的條件、解離的完全程度、解離后的片段是否能有效分離、酶解片段的大小等都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

2.3 肽掃描技術(shù) 對(duì)于一些氨基酸序列已知的抗原蛋白來(lái)說(shuō)，應(yīng)用肽掃描這種方法進(jìn)行線性抗原表位的鑒定是一種便捷的準(zhǔn)確性高的檢測(cè)方法。肽掃描技術(shù)是在合成固相多肽后，使合成的固相多肽與該種抗原的特異性抗體反應(yīng)，根據(jù)其結(jié)果判斷該多肽是否為抗原表位。應(yīng)用這種方法必須同時(shí)滿(mǎn)足2個(gè)條件：一是該種抗原蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)已知；二是獲得該種抗原的抗血清或單克隆抗體。合成多肽經(jīng)過(guò)與載體蛋白偶聯(lián)，可以在硝酸纖維素上點(diǎn)膜，進(jìn)行Dot-blot試驗(yàn)，篩選抗原表位。目前，常用的載體蛋白有3種：牛血清白蛋白（BSA）、血藍(lán)蛋白（KLH）和雞卵白蛋白（OVA）[10,13]。但是，大部分可視抗原表位是氨基酸序列上并不接近但在空間結(jié)構(gòu)上存在相互作用的構(gòu)象表位，因而，肽掃描技術(shù)只能夠檢測(cè)線性表位，并不能提供構(gòu)象表位信息。

2.4 質(zhì)譜技術(shù) 利用免疫親和技術(shù)分離抗體結(jié)合肽，然后用質(zhì)譜技術(shù)鑒定含有抗原表位的肽段，也是一種常用的鑒定抗原表位的方法。質(zhì)譜技術(shù)主要針對(duì)分子間的非共價(jià)鍵反應(yīng)如抗原-抗體間的特異性結(jié)合進(jìn)行分析，在靈敏度、樣品用量、分析速度上都優(yōu)于X-射線衍射和核磁共振技術(shù)，并且能同時(shí)進(jìn)行分離和鑒定[12,21-26]。近些年來(lái)，隨著電霧離子源（ESI）技術(shù)的出現(xiàn)，分子能夠無(wú)損的從液相過(guò)渡到氣相，也因此質(zhì)譜技術(shù)在研究抗原表位的構(gòu)象方面有著越來(lái)越難以取代的作用。

2.5 氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù) 氨基酸定點(diǎn)突變是人工將氨基酸序列上的某個(gè)氨基酸突變，然后比較突變型抗原和野生型抗原與抗體的識(shí)別情況，以此為依據(jù)鑒定抗原表位[10]。盡管氨基酸定點(diǎn)突變是該氨基酸作為抗原表位最有力的證明，但一個(gè)特定的氨基酸突變可能從以下幾個(gè)方面影響抗原與抗體結(jié)合的能力：①抗原抗體的結(jié)合與否，可能取決于抗原表位的8個(gè)或更關(guān)鍵的幾個(gè)氨基酸殘基，因而，只是單一殘基的突變對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體檢測(cè)的衡量可能并不準(zhǔn)確，對(duì)此，可以采用多點(diǎn)突變。②用來(lái)代替的氨基酸的性質(zhì)也可能影響抗原表位與抗體的結(jié)合。盡管氨基酸的親疏水性、帶電荷數(shù)和側(cè)鏈均很重要，但這些特性在線性表位或構(gòu)象表位中的作用卻因抗體差異而產(chǎn)生區(qū)別，所以，大片段氨基酸殘基取代小片段氨基酸殘基可能會(huì)限制在構(gòu)象表位上與抗體結(jié)合，相反小片段氨基酸殘基取代大片段氨基酸殘基可能會(huì)降低原氨基酸殘基和抗體的結(jié)合能力。③抗原表位之外的氨基酸突變也可能引起抗原自身結(jié)構(gòu)的明顯變化，進(jìn)一步影響抗原和抗體的結(jié)合，顯而易見(jiàn)，這種情況下抗原結(jié)構(gòu)并不受到突變影響[10]。

3 大豆抗原表位的鑒定

3.1 大豆球蛋白抗原表位的鑒定 大豆球蛋白作為一種大豆中常見(jiàn)的致敏蛋白，由6個(gè)亞基組成，且酸性肽鏈比堿性肽鏈容易水解，大豆球蛋白能引起幼齡動(dòng)物強(qiáng)烈的致敏反應(yīng)，但目前國(guó)內(nèi)鮮有相關(guān)的研究報(bào)道。Hu等[27]研發(fā)了新型大豆球蛋白的純化方法，該方法是基于單克隆抗體4B2的親和免疫層析法，在提高了純度產(chǎn)率和生物活性的同時(shí)節(jié)約了時(shí)間和成本，而高純度的大豆球蛋白無(wú)疑有利于在未來(lái)進(jìn)一步揭示其致敏機(jī)理。Xiang等[28]通過(guò)表位作圖法和氨基酸定點(diǎn)突變等方法鑒定出了S219-N233（S219GFAPEFLKEAFGVN233）是G2a亞基的人IgE結(jié)合表位，該肽IgE中心結(jié)合區(qū)在E224和V232之間，IgE結(jié)合的最關(guān)鍵氨基酸為F225、L226和F230。盡管免疫印跡結(jié)果表明大豆球蛋白的堿性和酸性亞基幾乎同樣具有抗原性，但Earl Taliercio 通過(guò)Elisa法驗(yàn)證了大豆球蛋白Gy1（A1aBx）亞基基本沒(méi)有被豬致敏血清識(shí)別[25]。Gy1（A1aBx）亞基對(duì)仔豬IgG結(jié)合能力比Gy4（A1aBx）及其他亞基更低。雖然致敏血清能夠識(shí)別Gy1（A1aBx）和Gy4（A1aBx）亞基的重疊區(qū)域，但沒(méi)有致敏血清能共同識(shí)別A5A4B3和A1aBx[29]。由此可知，大豆球蛋白不同種亞基上的抗原表位的氨基酸序列互有重疊但并不完全相同，且同種亞基上的抗原表位的氨基酸序列對(duì)不同實(shí)驗(yàn)材料也有所不同。Chen[30]建立了用于鑒定微量大豆球蛋白的夾心ELISA法，該方法的測(cè)定范圍為3～200 ng / mL，檢測(cè)限為1.63 ng/mL，該方法具有高靈敏度和強(qiáng)特異性的特點(diǎn)，對(duì)于日后篩選并去除大豆球蛋白的抗原表位具有重要意義。

3.2 7S組分大豆抗原蛋白抗原表位的鑒定 Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K和β-伴大豆球蛋白均屬于大豆球蛋白7S組分，且致敏性均很強(qiáng)。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于大豆抗原蛋白7S組分的研究相對(duì)較多，其中大部分采用了信息學(xué)法預(yù)測(cè)抗原表位后再進(jìn)行驗(yàn)證，也有使用酶解法將抗原蛋白進(jìn)行酶解后再分析抗原蛋白抗原表位，但是胃蛋白酶和胰蛋白酶有著十分明顯的專(zhuān)一性，胃蛋白酶很難有效地水解 β-Conlycinin 的β亞基。雖然生物信息學(xué)軟件對(duì)抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)可以避免一部分抗原表位被酶解而消失，但仍需要進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)證。閆慧麗等[31]利用生物信息學(xué)軟件 DNAStar、Disco Tope 2.0 和SOPMA和肽掃描法成功預(yù)測(cè)并鑒定出了 Gly m Bd 28K 蛋白的4個(gè)線性表位5～13、75～77、175～177、200～203和 6個(gè) 構(gòu) 象 表 位 11～14、40～41、43、114～115、185～192、194～207， 其 中 11～13和200～203兩段氨基酸序列為線性表位和構(gòu)象表位的公共序列。單曉紅等[32]利用 DNAStar、SOPMA 預(yù)測(cè)了 Gly m Bd 30K 的二級(jí)結(jié)構(gòu)并結(jié)合其模擬的三級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)出了 Gly m Bd 30K 的4個(gè)抗原表位，并使用點(diǎn)雜交法進(jìn)行定性分析驗(yàn)證了11段短肽是β-伴大豆球蛋白α亞基主要的線性表位。Sun等[33]綜合DNAStar、SOPMA和BepiPred的預(yù)測(cè)結(jié)果，預(yù)測(cè)出了β-伴球蛋白α 亞基上的 15 個(gè)線性表位，利用大豆過(guò)敏患者血清 IgE 鑒定 15 條合成多肽，其中11個(gè)表位被鑒定為主要的IgE結(jié)合表位。Ricki等[8]通過(guò)肽掃描方法篩選得到了Gly m Bd 30K 5個(gè)抗原表位區(qū)域，分別是3～12、100～109、207～225、229～238、340～359。雖然大豆抗原蛋白7S組分含有的抗原蛋白種類(lèi)較多，但其抗原表位仍然表現(xiàn)出了明顯的差異性，其中線性表位和構(gòu)象表位的氨基酸序列互有重疊，預(yù)測(cè)后的抗原表位經(jīng)各種方法驗(yàn)證也多為抗原表位，由此也可以證明生物信息學(xué)法預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。Taliercio等[34]證實(shí)了β-伴大豆球蛋白的β亞基上的抗原表位對(duì)于豬、狗、兔和魚(yú)存在著差異，雖然有很大一部分的重疊肽段，但并不完全一致，由此也可以證明同一種致敏原對(duì)于不同動(dòng)物在抗原表位上存在著差異。

4 小 結(jié)

抗原表位是抗原分子能夠被T細(xì)胞和B細(xì)胞特異性識(shí)別的關(guān)鍵。大豆作為一種重要的飼料原料和食物來(lái)源，從源頭分析并遏制其免疫原性是使大豆制品能夠更廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。近年來(lái)大豆抗原蛋白得到了足夠的重視和研究，關(guān)于大豆抗原蛋白的單抗和純化及檢測(cè)的方法時(shí)有創(chuàng)新，許多新的成果也進(jìn)一步應(yīng)用到了生產(chǎn)上，不過(guò)在分子層面的研究上仍有所不足，雖然其構(gòu)象和線性表位也不斷被海內(nèi)外學(xué)者所發(fā)現(xiàn)，但在抗原構(gòu)象表位的研究領(lǐng)域仍有不足，大部分實(shí)驗(yàn)仍然停留在抗原蛋白線性表位的研究上，許多研究方法或因其難度或因其造價(jià)而沒(méi)有得以應(yīng)用，且不同種屬動(dòng)物對(duì)大豆抗原蛋白表位區(qū)的敏感程度不同。關(guān)于大豆抗原蛋白抗原表位相關(guān)信息需要被進(jìn)一步揭示，以期為揭示其致敏機(jī)理、優(yōu)化其檢測(cè)方法、尋找其致敏阻斷劑等服務(wù)。

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Advances in the Major Allergic Protein Epitopes of Soybean

NARENGAOWA, ZHAO Yuan*, QIANG Jia-nan, SUN Zhao-yang, PAN Li, YUAN Zhi-jie
(1. Biologic and geographic science institute of Yili Normal University, Xinjiang Yili 835000, China; 2. College of animal science, Xinjiang Agricultural University, Xinjiang Urumqi 830052, China)

This paper reviews the progrocess on the major allergic protein epitopes of soybean, such as glycinin, β-conglycinin, Gly m Bd 30K and Gly m Bd 28K, mainly including the identified methods and the identification of soybean antigen epitopes.

Soybean; Allergic protein; Epitope; Sensitization

S816

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-008

2016-11-18；

2016-12-11

國(guó)家自然科學(xué)基金（31572439、31572415）；吉林省自然科學(xué)基金（20160101348JC）；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2015198）

娜仁高娃（1991），女，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，碩士研究生，主要從事飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子方向的研究，E-mail: devil1868@sina.com

* 通訊作者：趙元，博士，副教授，E-mail: zhaoyuan4CL52@ 126.com