脂肪干細胞與不同脫細胞基質(zhì)的組織相容性研究*

白 勇，武 陽，凱賽爾·阿吉，喬炳璋，王玉杰，木拉提·熱夏提

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，新疆 烏魯木齊 830054；2.中國人民解放軍第747醫(yī)院普外泌外科，新疆 烏魯木齊 830000）

脂肪干細胞與不同脫細胞基質(zhì)的組織相容性研究*

白 勇1，武 陽2，凱賽爾·阿吉1，喬炳璋1，王玉杰1，木拉提·熱夏提1

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，新疆 烏魯木齊 830054；2.中國人民解放軍第747醫(yī)院普外泌外科，新疆 烏魯木齊 830000）

目的 研究SD大鼠脂肪干細胞與不同脫細胞膀胱基質(zhì)（BAMG）的體外生物相容性，為進一步把細胞支架復(fù)合物回植動物體內(nèi)提供有利的實驗基礎(chǔ)。方法 取SD大鼠雙側(cè)腹股溝處脂肪組織經(jīng)過相應(yīng)處理后得到原代脂肪組織，進行成骨、成脂誘導(dǎo)染色及流式細胞術(shù)檢測CD29、CD34、CD44及CD45，對脂肪干細胞進行鑒定，同時制備鼠及新西蘭兔BAMG，采用2次沉淀法將脂肪干細胞靜態(tài)接種于不同BAMG表面，觀察細胞在材料表面的生長狀況，并繪制細胞生長曲線。結(jié)果 細胞材料體外復(fù)合培養(yǎng)5 d后行HE染色后觀察可見SD大鼠脂肪干細胞在SD大鼠BAMG表面生長狀態(tài)較其在新西蘭兔BAMG表面生長狀態(tài)好，且細胞形態(tài)舒展成長梭形，細胞生長曲線與SD大鼠原代脂肪干細胞基本一致。結(jié)論 SD大鼠脂肪干細胞接種于SD大鼠BAMG復(fù)合物表面生長狀況相比于其接種于新西蘭兔BAMG復(fù)合物表面更加良好，具有更好的生物相容性。為進一步把細胞支架復(fù)合物回植動物體內(nèi)提供有利的實驗基礎(chǔ)。

脂肪干細胞；脫細胞膀胱基質(zhì)；組織相容性；修復(fù)

目前各種類型的膀胱疾病均可能導(dǎo)致膀胱組織、結(jié)構(gòu)或功能的喪失，經(jīng)過傳統(tǒng)方法治療很難完全替代原組織器官功能，并可能會產(chǎn)生一系列并發(fā)癥。近年來，應(yīng)用組織工程學(xué)相關(guān)方法修復(fù)損傷膀胱成為一種新的趨勢，脂肪干細胞是一種具有多種分化潛能、可作為組織工程修復(fù)的種子細胞，具有來源豐富、取材容易等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣泛。膀胱黏膜下脫細胞基質(zhì)（bladder acellular matrix graft，BAMG）是指僅保留細胞外基質(zhì)成分，而將同種或異種膀胱組織去除細胞、抗原等成分，具有較好的生物相容性，修復(fù)膀胱組織時有優(yōu)勢，是較為理想的天然生物支架[1-7]。本實驗選用具有多種分化潛能的SD大鼠脂肪干細胞作為種子細胞，體外分別接種于SD大鼠和新西蘭兔的脫細胞膀胱基質(zhì)構(gòu)建細胞-支架復(fù)合物，為SD大鼠脂肪干細胞和不同異種脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物修復(fù)膀胱缺損提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠35只，雌雄不限，出生6～8周，體重200 g左右，5只用于培養(yǎng)SD大鼠脂肪干細胞，30只用于制備SD大鼠BAMG；新西蘭兔30只，雌雄不限，出生3～5個月左右，體重2 500 g左右，用于制備兔BAMG。以上實驗動物均由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，并通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.1.2 試劑 高糖DMEM細胞培養(yǎng)液（美國Gibco公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司），疊氮化鈉及脫氧膽酸鈉（美國Sigma公司），胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司），I型膠原酶（美國Roche公司），CD抗體（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠脂肪干細胞分離培養(yǎng)及鑒定 將SD大鼠斷頸處死后使用碘伏消毒皮膚2遍后，再用75%酒精進行脫碘處理，嚴格無菌條件下收集SD大鼠雙側(cè)腹股溝處脂肪組織。將其剪碎后置于50 ml的離心管內(nèi)，PBS沖洗3遍，轉(zhuǎn)速為1 500 r/min離心5 min后棄上清液，加入0.1%的Ⅰ型膠原酶在37℃、5%二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化1 h，并且每隔15 min振蕩1次，200目無菌網(wǎng)篩濾去未被消化的殘余組織。轉(zhuǎn)速為1 500 r/min離心5 min處理后將細胞計數(shù)并按1×105個/cm2的密度，種植于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，待細胞生長達到80%融合時消化傳代。用0.25%胰蛋白酶消化后接種于新的細胞培養(yǎng)瓶，按1∶3傳代培養(yǎng)。

1.2.2 脂肪干細胞成骨、成脂誘導(dǎo)分化 取第3代脂肪干細胞進行成脂、成骨誘導(dǎo)分化。①成骨誘導(dǎo)以3×103/cm2的密度接種于6孔板中，24 h后換成骨誘導(dǎo)液（生長培養(yǎng)液，0.01μmol/L 1，25-dihydroxyvitamin D3，50μmol/L ascorbate-2-phosphate，10 mmol/L β-glycerophosphate）進行培養(yǎng)，每周換液2次。誘導(dǎo)21 d后進行茜素紅染色，倒置相差顯微鏡對染色結(jié)果進行觀察、拍照。②成脂誘導(dǎo)：以3× 103/cm2的密度接種于6孔板中，24 h后換成脂誘導(dǎo)液 [生長培養(yǎng)液，0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine（IBMX），1μmol/L地 塞 米 松 ，10μmol/Linsulin，200μmol/L indomethacin]進行培養(yǎng)。每周換液2次，成脂誘導(dǎo)14 d后進行油紅O染色，倒置相差顯微鏡對染色結(jié)果進行觀察、拍照。

1.3 SD大鼠及兔膀胱BAMG的復(fù)制及鑒定

1.3.1 制備方法 分別脫頸處死SD大鼠及空氣栓塞法處死新西蘭兔，縱行剖開膀胱組織，將膀胱壁黏膜面朝上固定于自制泡沫板上，仔細刮除黏膜層，顯微分離去除漿肌層組織，置于100 ml PBS（含0.1%疊氮化鈉）混合液中37℃攪拌10～12 h；PBS沖洗后加入100 ml 0.5 mmol/L EDTA+0.4%胰蛋白酶溶液中37℃攪拌5～6 h；PBS再次沖洗后置于100 ml 1 mol/L氯化鈉（含DNase-I 4 000 kU）溶液中37℃浸泡攪拌6～8 h，使細胞徹底溶解，細胞組分完全釋放。置于100 ml含4%脫氧膽酸鈉和0.1%疊氮化鈉的混合液中攪拌6～8 h，使細胞膜脂質(zhì)雙層和細胞內(nèi)的膜脂質(zhì)溶解。制備好的BAMG浸泡于含10%青鏈霉素溶液中4℃保存。

1.3.2 鑒定 抽取制備好的BAMG行HE染色及Masson染色后光學(xué)顯微鏡觀察，同時制備電鏡標本行掃描電子顯微鏡觀察。

1.4 BAMG細胞毒性的測定

將制備好的BAMG用無菌PBS液漂洗3遍，冷凍干燥儀內(nèi)冷凍干燥5 h后稱重，按0.2 g/ml置入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h制備浸提液。取第3代SD大鼠脂肪干細胞，按1×104個/孔接種于24孔板中，含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基為對照組，含10%、20%和50%不同濃度浸提液為實驗組，從第2天開始，每隔1天利用CCK-8法測定各組吸光度（A）值，計算細胞相對增殖率（相對增殖率=A實驗/A對照），并對材料毒性分級。相對增殖率≥100%、80%、50%、30%及0%，分別為0、1、2、3、4級。根據(jù)國家醫(yī)療器械生物學(xué)評價標準，材料的毒性分為0級或1級時表面材料無細胞毒性。

1.5 脂肪干細胞與BAMG的復(fù)合物培養(yǎng)

將制備好的BAMG修剪成1 cm×1 cm，平鋪于無菌24孔板中，其中8孔放入SD大鼠BAMG，8孔放入新西蘭兔BAMG，余下8孔為空白組，每孔中都加入高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，放置24 h后吸去培養(yǎng)液，并且保持支架材料的平鋪狀態(tài)，再次加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)基浸潤、預(yù)濕2 h備用。將第3代脂肪干細胞（1×106個/ml）輕鋪于支架上及空白孔中，每天換液，5 d后掃描電鏡下觀察脂肪干細胞與膠原支架的相容性，同時將細胞-支架復(fù)合物體外復(fù)合培養(yǎng)自第2天開始每天每組隨機抽2孔，將其中的細胞-支架復(fù)合物剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化離心處理后連續(xù)10 d進行細胞計數(shù)并繪制細胞生長曲線，然后將3組細胞生長曲線進行對比。

1.6 主要觀察指標

脂肪干細胞的形態(tài)學(xué)、體外增殖傳代能力、免疫表型的檢測結(jié)果；脂肪干細胞成脂及成骨分化鑒定；脂肪干細胞與膠原支架材料的相容性生長情況同時繪制生長曲線。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪干細胞的形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)細胞貼壁后伸展成長梭形或成纖維樣，2 d后細胞擴增速度加快，呈密集生長。8 d時，細胞可達到80%以上融合狀態(tài)。傳代培養(yǎng)細胞的生長速度較原代細胞略快，至第3代細胞仍然保持長梭形。見圖1。

2.2 脂肪干細胞的免疫表型檢測結(jié)果

利用流式細胞術(shù)檢測脂肪干細胞表面標志，結(jié)果顯示第 4代脂肪干細胞表面 CD44表達為81.7%，CD29表達為80.3%，而CD34表達為6.2%，CD45表達僅為2.6%。見圖2。

2.2.1 脂肪干細胞的成脂肪分化 經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)液培養(yǎng)14 d后，可在多數(shù)脂肪干細胞胞質(zhì)內(nèi)見到圓形的小脂滴，有些小脂滴可相互融合成較大的脂滴。經(jīng)過油紅O染色后，脂滴可被染成紅色。

2.2.2 脂肪干細胞的成骨分化 經(jīng)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 d后，在脂肪干細胞生長密集的區(qū)域內(nèi)可見很多細胞間界限不清楚、細胞結(jié)構(gòu)模糊，在該部位可見折光率較強的顆粒狀物質(zhì)沉積。經(jīng)茜素紅染色后，可見較多大小不一的顆粒狀結(jié)構(gòu)。

圖1 鼠脂肪干細胞形態(tài)

圖2 SD大鼠脂肪干細胞表面標志物表達

2.2.3 脂肪干細胞與BAMG的相容性 掃描電子顯微鏡下可見BAMG呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，脂肪干細胞附著于BAMG支架上生長，細胞鋪展好。見圖3、4。

2.3 BAMG細胞毒性測定結(jié)果

加入10%、20%和50%不同濃度培養(yǎng)液1、2、3、4、5 d后利用CCK-8法測定各組吸光度（A）值，結(jié)果顯示計算出的相對細胞增殖率均大于80%，材料毒性分級為0或1級，證明材料無毒。

2.4 繪制SD大鼠原代脂肪干細胞及SD大鼠脂肪干細胞分別接種鼠BAMG、兔BAMG復(fù)合物的生長曲線

3組細胞經(jīng)過測定，SD大鼠脂肪干細胞接種于SD大鼠BAMG復(fù)合物與SD大鼠原代脂肪干細胞生長曲線基本一致，均于培養(yǎng)7～8 d進入平臺期，而SD大鼠脂肪干細胞接種于新西蘭兔BAMG復(fù)合物細胞計數(shù)量較少，見圖5。進一步表明，SD大鼠脂肪干細胞接種于SD大鼠BAMG復(fù)合物表面生長狀況相比于 SD大鼠脂肪干細胞接種于新西蘭兔BAMG復(fù)合物更加良好，具有更好的生物相容性。

圖3 不同異種BAMG電鏡圖

圖4 脂肪干細胞與不同BAMG體外培養(yǎng)結(jié)果

圖5 細胞生長曲線

3 討論

近年來，組織工程的發(fā)展為膀胱重建提供了新的有效的選擇，目前在膀胱損傷的修復(fù)過程中主要涉及平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）和尿路上皮細胞（urothelial cell，UC）。JACK等[8]將經(jīng)綠色熒光蛋白標記的脂肪干細胞注入大鼠膀胱壁內(nèi)，4周后發(fā)現(xiàn)經(jīng)標記的脂肪干細胞長入膀胱壁的平滑肌內(nèi)，12周后表達c-平滑肌肌動蛋白等平滑肌特異性標記物，因此SD大鼠脂肪干細胞也能通過相關(guān)誘導(dǎo)向SMC分化，同時表達平滑肌特異性的標志物，并最終具備SMC相應(yīng)的收縮和舒張功能，在膀胱損傷的修復(fù)過程中用于修復(fù)膀胱缺損的肌層[9-16]。目前以脂肪組織作為種子細胞為來源的主要原因包括來源豐富、取材方便及損傷小等優(yōu)勢。同時目前較為良好的膀胱修復(fù)材料不僅需要良好的生物相容性，而且還要具備良好的收縮能力，這樣就可以使其抵抗腹膜內(nèi)外的感染，不影響正常腎功能，同時還可以依靠神經(jīng)和平滑肌使其具有自主排尿功能[17]。脫細胞膀胱基質(zhì)表面有多種生物活性因子，可以為種子細胞生長、增殖提供良好的微環(huán)境；脫細胞膀胱基質(zhì)不僅具有良好的生物相容性，而且其所具有的特殊的機械特性能夠支持幫助上皮細胞更好地生長[18-20]，以上事實充分說明SD大鼠脂肪干細胞及脫細胞膀胱基質(zhì)在膀胱缺損修復(fù)中是很好的種子細胞和支架材料。

本實驗在進行SD大鼠脂肪干細胞與脫細胞膀胱基質(zhì)制備細胞-支架復(fù)合物時，采用了2次沉淀法，該方法不僅可以使SD大鼠脂肪干細胞均勻地接種到脫細胞膀胱基質(zhì)制備細胞-支架表面，而且還可以使SD大鼠脂肪干細胞更好地與脫細胞膀胱基質(zhì)制備細胞-支架黏附向支架內(nèi)滲透，最終使SD大鼠脂肪干細胞分布更加接近正常組織[21]。通過相應(yīng)掃描電鏡可以看到，經(jīng)過2次沉淀法接種SD大鼠脂肪干細胞后，雖然大量的接種SD大鼠脂肪干細胞仍主要集中在支架材料表面，但有部分SD大鼠脂肪干細胞體外共培養(yǎng)早期即可滲透到脫細胞膀胱基質(zhì)制備細胞-支架內(nèi)部。因此采用了2次沉淀法可以更好地使SD大鼠脂肪干細胞與脫細胞膀胱基質(zhì)結(jié)合。

本實驗研究SD大鼠脂肪干細胞與不同脫細胞膀胱基質(zhì)的組織相容性，將制備好的不同細胞-支架復(fù)合物進行實時觀察，發(fā)現(xiàn)SD大鼠脂肪干細胞與SD大鼠脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物較SD大鼠脂肪干細胞與新西蘭兔脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物組織相容性要好，實驗發(fā)現(xiàn)SD大鼠脫細胞膀胱基質(zhì)制備的細胞-支架復(fù)合物5 d后在顯微鏡下可見SD大鼠脂肪干細胞基本上已經(jīng)附著于SD大鼠異種脫細胞膀胱基質(zhì)上，同時SD大鼠脂肪干細胞生長良好，細胞量較同時接種的新西蘭兔異種脫細胞膀胱基質(zhì)細胞-支架復(fù)合物明顯增多，細胞形態(tài)舒展成長梭形，掃描電鏡下觀察SD大鼠脂肪干細胞與SD大鼠脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物在接種5 d后SD大鼠脂肪干細胞已經(jīng)基本滲入支架材料內(nèi)部。而SD大鼠脂肪干細胞與新西蘭兔脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物在掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)滲入到支架材料內(nèi)部較前者數(shù)量減少。且通過SD大鼠脂肪干細胞分別與SD大鼠及新西蘭兔脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物細胞生長曲線的比較可以發(fā)現(xiàn)，SD大鼠脂肪干細胞與SD大鼠脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物細胞計數(shù)生長曲線與原代SD大鼠脂肪干細胞計數(shù)的生長曲線基本相近，且較SD大鼠脂肪干細胞與新西蘭兔脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物的細胞計數(shù)量明顯增多，因此可以進一步說明SD大鼠脂肪干細胞接種于SD大鼠脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物有更好的生物相容性。

本實驗結(jié)果表明，SD大鼠脂肪干細胞與SD大鼠脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物較SD大鼠脂肪干細胞與新西蘭兔脫細胞膀胱基質(zhì)復(fù)合物組織相容性要更好，這為進一步把細胞支架復(fù)合物回植動物體內(nèi)提供有利的實驗基礎(chǔ)。

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（張蕾 編輯）

Histocompaticblity research of adipose stem cells with different acellular bladder matrix*

Yong Bai1,Yang Wu2,Kaisaier Aji1,Bing-zhang Qiao1,Yu-jie Wang1,Muratrixat1
(1.Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi, Xinjiang 830054,China;2.Department of General Surgery,the 747th Hospital of the Chinese People's Liberation Army,Urumqi,Xinjiang 830000,China)

Objective To study thein vitrobiocompatibility of SD rat adipose stem cells with different acellular bladder matrix(bladder acellular matrix graft,BAMG),and provide favorable experimental basis to further implantation into animals.Methods In the bilateral inguinal adipose tissue of SD rats,the primary fat cells were obtained after treatment.CD29,CD34,CD44 and CD45 were used to identify adipose derived stem cells by staining and flow cytometry.BAMG of SD rats and New Zealand rabbits were prepared.Using secondary precipitation method,adipose stem cells were inoculated on different BAMG surface,cell growth on the surface of the materials was observed,and cell growth curve was drawn.Results Afterin vitroculture of the cellular materials for 5 days, HE staining revealed the adipose derived stem cells of SD rats grew better on the surface of SD rat BAMG than on the surface of New Zealand rabbit BAMG,the cells grew into spindle cells,and the cell growth curve was consistent with that of the primary fat cells of SD rats.Conclusions Adipose stem cells of SD rats grow better on the surface of SD rat BAMG complex than on the surface of New Zealand rabbit BAMG complex,it has better biological compatibility.Our result provides favorable experimental basis for further implantation of the cell scaffold complex into animals.

adipose stem cell;bladder acellular matrix graft;tissue compatibility;repair

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.002

1005-8982（2017）04-0007-06

2016-08-10

國家自然科學(xué)基金（No：81160088）

木拉提·熱夏提，E-mail：muratrixat@126.com