小鼠PD-1胞外段重組蛋白表達(dá)及其包涵體復(fù)性

江 慧， 康巧珍， 黃夏冰， 張成龍， 劉 鑫

(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

小鼠PD-1胞外段重組蛋白表達(dá)及其包涵體復(fù)性

江 慧， 康巧珍， 黃夏冰， 張成龍， 劉 鑫

(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

旨在利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備可溶性的PD-1胞外段(以下簡(jiǎn)稱exPD-1)蛋白.以C57BL/6小鼠脾細(xì)胞cDNA為模板，擴(kuò)增小鼠exPD-1基因，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-exPD-1，并在E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá).結(jié)果顯示，小鼠exPD-1重組蛋白大小約為17 kD，以包涵體形式存在.exPD-1包涵體蛋白經(jīng)8 mol/L尿素變性、Ni-NTA親和層析后，采用尿素梯度透析法對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性效果不佳，添加氧化/還原型谷胱甘肽復(fù)性后，復(fù)性率達(dá)到50%以上，提高了復(fù)性效率.小鼠exPD-1蛋白的成功制備，為進(jìn)一步研究PD-1的免疫學(xué)功能奠定了材料基礎(chǔ).

PD-1; 原核表達(dá)載體; 包涵體; 復(fù)性

0 引言

PD-1(programmed cell death-1)是一種免疫抑制受體，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷性T細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞.PD-1與其配體PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)結(jié)合后，能夠削弱和抑制CD4+T、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞的增殖和活化，在腫瘤、 病毒感染、 自身免疫性疾病等方面均發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[1-3].PD-1為50～55 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，胞外區(qū)的IgV結(jié)構(gòu)域是其與配體主要結(jié)合區(qū)域，其胞質(zhì)尾部的兩個(gè)酪氨酸殘基在調(diào)控下游信號(hào)分子產(chǎn)生免疫負(fù)性調(diào)節(jié)作用中扮演重要角色[4].外源表達(dá)的PD-1胞外段(extracellular domain of PD-1，exPD-1)蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合配體，干擾PD-1與配體的結(jié)合，阻礙負(fù)性信號(hào)傳遞.

利用原核表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)外源基因在基因工程菌中穩(wěn)定高效表達(dá)，可以快速易行地獲得大量目的蛋白，且生產(chǎn)周期短、成本低[5].但是，重組蛋白在大腸桿菌內(nèi)的高表達(dá)易導(dǎo)致形成不溶的、無活性的包涵體.目標(biāo)基因高拷貝、強(qiáng)效的啟動(dòng)系統(tǒng)、誘導(dǎo)產(chǎn)物濃度過高都易誘導(dǎo)包涵體的形成，往往需要通過變性溶解，并在適宜條件下復(fù)性,使其形成正確折疊，才能得到可溶的、有生物活性的蛋白[6].由于目的蛋白組成及結(jié)構(gòu)的差異，選擇和優(yōu)化復(fù)性方式對(duì)獲得有生物活性的蛋白具有重要意義.

本實(shí)驗(yàn)使用基因工程技術(shù)獲取小鼠PD-1胞外段基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a中，并在宿主菌E.coliBL21(DE3)中表達(dá)，得到的包涵體蛋白用含8 mol/L尿素的變性液變性，經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后，采取尿素梯度透析復(fù)性及添加氧化/還原型谷胱甘肽等小分子物質(zhì)對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性，成功制備PD-1胞外段蛋白，為進(jìn)一步研究PD-1的免疫學(xué)功能奠定了材料基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28a質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司.Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、NdeⅠ、XhoⅠ、DNA marker購自Takara公司；氧化型谷胱甘肽(GSSG)、還原型谷胱甘肽(GSH)購自上海生工生物工程公司；ProteinIsoTMNi-NTA Resin、低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白marker購自北京全式金有限公司；其余試劑及試劑盒購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司.PCR引物合成及DNA測(cè)序由北京金唯智公司完成.

1.2 小鼠exPD-1的克隆與鑒定

取C57BL/6小鼠脾臟，TRIzol法提取脾細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行.用小鼠exPD-1引物，F(xiàn)：5’-CGGCATATGTCAGGGTGGCTTCTAGA-3’(NdeⅠ)；R：5’-CCCCTCGAGTTATTGAAACCGGCCTTCTG-3’(XhoⅠ)，擴(kuò)增exPD-1基因.PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min.取5 μL PCR產(chǎn)物上樣于1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析.PCR產(chǎn)物用DNA片段純化試劑盒純化，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3 小鼠exPD-1原核表達(dá)載體構(gòu)建

質(zhì)粒pET-28a和純化后PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物上樣于1%瓊脂糖凝膠中電泳，使用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，并用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-exPD-1，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的送至北京金唯智公司測(cè)序.

1.4 小鼠exPD-1蛋白的表達(dá)與鑒定

將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pET-28a-exPD-1轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21(DE3)中，挑取單克隆接種于LB培養(yǎng)基(kan抗性)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜.次日按1∶100接種比例接種于LB培養(yǎng)基(kan抗性)中，培養(yǎng)4 h后加入0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h.以E.coliBL21(DE3)和轉(zhuǎn)化pET-28a的菌株為陰性對(duì)照.取菌液，用15% SDS-PAGE電泳分析.

1.5 小鼠exPD-1蛋白表達(dá)形式分析、純化及鑒定

9 000 rpm離心5 min收集IPTG誘導(dǎo)后的菌體，用可溶性平衡緩沖液(300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L imidazole，10 mmol/L Tris，pH 8.0)重懸，冰浴條件下使用300 W短脈沖超聲處理(超聲處理10 s，間隔15 s)20 min，9 000 rpm離心20 min，收集上清及沉淀，15% SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)形式.可溶性平衡緩沖液洗滌沉淀3次后，用變性液(8 mol/L urea，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris，pH 8.0)溶解沉淀，離心收集上清，并用0.45 μm濾膜過濾.使用Ni-NTA親和層析柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化，使用不同濃度的咪唑洗脫液(變性緩沖液中分別加入50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L imidazole)梯度洗脫，收集洗脫液，15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化結(jié)果，并用Image J圖像分析軟件分析蛋白純度.

1.6 小鼠exPD-1的復(fù)性

M：marker； 1：小鼠exPD-1 PCR產(chǎn)物.圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresis

純化后的蛋白用不同的復(fù)性緩沖液進(jìn)行梯度透析復(fù)性.復(fù)性緩沖液體系1：配制PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4)，分別加入尿素至終濃度為6 mol/L、4 mol/L、3 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0.5 mol/L；復(fù)性緩沖液體系2：在復(fù)性緩沖液1的基礎(chǔ)上，在含0.5 mol/L尿素的復(fù)性緩沖液中添加1 mmol/L GSH，0.2 mmol/L GSSG.在同一蛋白質(zhì)量濃度和溫度條件下分別使用體系1和2進(jìn)行稀釋復(fù)性，收集上清進(jìn)行 SDS-PAGE，并用Image J軟件分析復(fù)性效率.

2 結(jié)果

2.1 小鼠exPD-1的克隆

以C57BL/6小鼠脾細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增小鼠PD-1胞外段基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見大小約為450 bp的特異性條帶，與目的基因大小一致(小鼠exPD-1基因?yàn)?41 bp)(圖1).

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-exPD-1的鑒定

重組質(zhì)粒pET-28a-exPD-1經(jīng)XhoⅠ、NdeⅠ雙酶切鑒定，分別在5 300 bp、450 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖2)，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)，與GenBank(X67914.1)同源性達(dá)到100%，表明重組質(zhì)粒pET-28a-exPD-1構(gòu)建成功.

2.3 小鼠exPD-1蛋白的表達(dá)及鑒定

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET-28a-exPD-1轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，進(jìn)行菌落PCR鑒定，正確的陽性克隆菌經(jīng)IPTG于37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，SDS-PAGE結(jié)果顯示在17 kD處可見明顯的蛋白誘導(dǎo)條帶(圖3).

1：pET-28a空質(zhì)粒的XhoⅠ、NdeⅠ雙酶切結(jié)果； 2： pET-28a-exPD-1的XhoⅠ、NdeⅠ雙酶切結(jié)果； 3：exPD-1 PCR產(chǎn)物；M: marker.圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-exPD-1雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pET-28a-exPD-1

M：marker (12～120 kD)；1：宿主菌E.coli BL21(DE3)；2：誘導(dǎo)的E.coli BL21(DE3)/pET-28a； 3：未誘導(dǎo)的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-exPD-1；4：誘導(dǎo)的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-exPD-1.圖3 小鼠exPD-1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Expression of exPD-1 protein induced by IPTG

2.4 小鼠exPD-1蛋白表達(dá)形式分析

收集菌體，超聲破碎后9 000 rpm離心20 min，收集上清及沉淀，SDS-PAGE結(jié)果顯示exPD-1蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)(圖4).

2.5 小鼠exPD-1蛋白的變性與純化

菌體破碎離心后沉淀經(jīng)可溶性平衡緩沖液洗滌3次后，加入含8 mol/L尿素的變性液對(duì)包涵體蛋白變性.使用Ni-NTA親和層析柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化，用不同濃度的咪唑洗脫液對(duì)蛋白梯度洗脫.SDS-PAGE顯示100～400 mmol/L咪唑洗脫液洗脫率較高(圖5)，圖像經(jīng)Image J軟件分析，蛋白純度達(dá)到80%以上.

M：marker(12～120 kD)； 1：超聲破碎后離心上清；2：超聲破碎后離心沉淀.圖4 小鼠exPD-1蛋白表達(dá)形式分析Fig.4 Expression form analysis of exPD-1 protein

1～5：依次為50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L咪唑洗脫液洗脫產(chǎn)物；M：marker (12～120 kD).圖5 小鼠exPD-1蛋白純化Fig.5 Purity of mouse exPD-1 protein

2.6 小鼠exPD-1蛋白的復(fù)性

親和層析純化后的蛋白分別用只含尿素的復(fù)性緩沖液和添加氧化/還原型谷胱甘肽的復(fù)性緩沖液進(jìn)行梯度透析復(fù)性，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用只含尿素的復(fù)性體系對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性時(shí)，當(dāng)尿素濃度降至0.5 mol/L時(shí)，會(huì)析出大量白色不溶沉淀，可溶性蛋白急劇減少；而添加氧化/還原型谷胱甘肽后，這一現(xiàn)象會(huì)得到很高程度的緩解(圖6).SDS-PAGE圖像經(jīng)Image J軟件分析，結(jié)果顯示，只含尿素的復(fù)性體系復(fù)性率不足10%，使用添加氧化/還原型谷胱甘肽的復(fù)性體系后蛋白復(fù)性率達(dá)到50%以上，提升了約40%的復(fù)性效率.

A： 1：復(fù)性前蛋白；2～7：依次為含6 mol/L、4 mol/L、3 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0.5 mol/L尿素的復(fù)性緩沖液復(fù)性蛋白；8：PBS緩沖液復(fù)性蛋白.B：1～5:依次為含6 mol/L、4 mol/L、3 mol/L、2 mol/L、1 mol/L尿素的復(fù)性緩沖液復(fù)性蛋白；6：含0.5 mol/L尿素及GSH/GSSG復(fù)性緩沖液復(fù)性蛋白；7：含GSH/GSSG的PBS復(fù)性蛋白；M：marker (13～90 kD).圖6 小鼠exPD-1蛋白復(fù)性Fig.6 Refolding of mouse exPD-1 protein

3 討論

PD-1是一種重要的免疫檢驗(yàn)點(diǎn)分子，其通過胞外部分與配體結(jié)合傳遞負(fù)性信號(hào)，抑制T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生.在正常組織中，PD-1信號(hào)在維持體內(nèi)免疫平衡、防止自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；但在腫瘤微環(huán)境中，這一信號(hào)已被證實(shí)能夠通過抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視[7].利用基因工程技術(shù)制備可溶性PD-1胞外段蛋白，或許可以競(jìng)爭(zhēng)性阻斷PD-1/PD-Ls通路，從而削弱其對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞功能的抑制作用，增強(qiáng)CTL腫瘤殺傷能力，恢復(fù)免疫細(xì)胞的特異性的抗病毒功能.已在胰腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌等小鼠腫瘤模型上證實(shí)PD-1的阻斷能夠有效增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答，延長(zhǎng)小鼠生存期[8-10].此外，研究表明PD-1的阻斷能夠恢復(fù)T細(xì)胞功能，促進(jìn)病毒清除[11].

已有研究者利用真核表達(dá)系統(tǒng)[12]和pGEX原核表達(dá)載體[13]表達(dá)PD-1胞外段蛋白.與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)載體生產(chǎn)周期短，成本低，蛋白產(chǎn)量高.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建pET-28a-exPD-1重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE檢測(cè)到目的蛋白表達(dá)，蛋白以包涵體的形式存在.在實(shí)驗(yàn)過程中，為實(shí)現(xiàn)其可溶性表達(dá)，我們嘗試進(jìn)行低溫誘導(dǎo)并降低IPTG濃度，希望減緩重組蛋白的表達(dá)速率，從而形成正確折疊，但未能阻礙包涵體的形成.進(jìn)一步我們使用含8 mol/L尿素的變性緩沖液溶解包涵體，采用尿素梯度透析的方式，逐步降低變性劑的濃度來消除變性劑對(duì)蛋白的影響，使蛋白重新折疊，以獲得可溶性蛋白.但在實(shí)驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)，單純降低尿素濃度的復(fù)性方式并不能很好地實(shí)現(xiàn)exPD-1蛋白的復(fù)性，在復(fù)性后期，即低濃度的尿素復(fù)性緩沖液中，蛋白大量析出，從而嚴(yán)重影響復(fù)性效果.最終，我們嘗試在含低濃度尿素的復(fù)性緩沖液中添加小分子物質(zhì)氧化型和還原型谷胱甘肽，這種含巰基的化合物能夠提供合適的氧化還原電位，幫助形成正確的二硫鍵[14].實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，此種復(fù)性方式蛋白復(fù)性率達(dá)到50%以上，與單純的尿素梯度透析法相比，復(fù)性率明顯提升.

重組質(zhì)粒pET-28a-exPD-1的成功構(gòu)建及小鼠exPD-1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化，為進(jìn)一步研究PD-1的免疫學(xué)功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但蛋白活性驗(yàn)證及復(fù)性方法的進(jìn)一步優(yōu)化，仍需要更多實(shí)驗(yàn)研究.

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(責(zé)任編輯：王浩毅)

Expression and Refolding of Mouse PD-1 Extracellular Protein inEscherichiacoli

JIANG Hui, KANG Qiaozhen, HUANG Xiabing, ZHANG Chenglong, LIU Xin

(SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

To obtain soluble mouse PD-1 extracellular (exPD-1) protein by using prokaryotic expression system, mouse exPD-1 gene was amplified from C57BL/6 mice spleen cells cDNA by PCR.The recombinant plasmid pET-28a-exPD-1 was constructed and expressed inE.coliBL21(DE3)after IPTG induction. The SDS-PAGE showed that exPD-1 recombined protein was about 17 kD and in the form of inclusion body. After solubilized in 8 mol/L urea and purified by Ni-NTA affinity column, the protein was refolded. A 40% of the renaturation rate was improved by adding GSH/GSSG compared with urea gradient dialysis, in which the former rate of refolding was more than 50%. The mouse PD-1 extracellular protein was successfully prepared, which lay the foundation for further study of the function of PD-1 in immunotherapy.

PD-1; prokaryotic expression vector; inclusion body; renaturation

2016-08-17

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)(2012ZX09103301-022);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1204817，81373119).

江慧(1991—)，女，河南平頂山人，碩士研究生，主要從事腫瘤免疫研究，E-mail:huijiang1991@126.com；通訊作者：劉鑫(1981—)，女，甘肅白銀人，講師，主要從事免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制及治療研究，E-mail:liux@zzu.edu.cn.

Q786

A

1671-6841(2017)02-0111-05

10.13705/j.issn.1671-6841.2016204