藥物篩選中分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用研究

梁 璇

藥物篩選中分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用研究

梁 璇

（昆明醫(yī)科大學(xué) 海源學(xué)院， 云南 昆明 650000）

藥物篩選是新藥物研究、制造、合成的必備過程，通過藥物篩選，能夠從已有的海量化合物中尋找到具有特定藥物作用及治療功能的新化合物，從而提高藥物的研發(fā)效率，縮短其研發(fā)周期，起到降低風(fēng)險減少成本的作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)的應(yīng)用對于藥理研究及藥物臨床應(yīng)用的推進(jìn)起到了極大的促進(jìn)作用，提高了藥物篩選的特異性，對于藥物篩選效率及成功率的提升具有重要的意義。

藥物篩選；生物技術(shù)；分子生物學(xué)；應(yīng)用

藥物篩選是藥物研發(fā)過程中的重要環(huán)節(jié)，它是針對有可能藥用的各類物質(zhì)，包括各類蛋白多肽、化合物、天然及海洋產(chǎn)物等，運(yùn)用一定的篩選方法和技術(shù)，對其內(nèi)部可能存在的具有藥理作用的活性物質(zhì)進(jìn)行檢測，并利用相應(yīng)的方法，進(jìn)行藥用成分的提取與合成。藥物篩選在藥物的實(shí)驗(yàn)室研究到臨床應(yīng)用之間發(fā)揮了核心的橋梁作用。

隨著分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步，以分子生物學(xué)為應(yīng)用基礎(chǔ)的各類方法在藥物篩選中獲得了廣泛的應(yīng)用，例如高通量及高內(nèi)涵篩選技術(shù)、反義核酸技術(shù)、生物芯片技術(shù)、基因工程技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫分析法等。分子生物學(xué)的基礎(chǔ)是受體學(xué)說，針對受體進(jìn)行研究能夠加強(qiáng)對于藥物作用、激素及神經(jīng)遞質(zhì)作用的認(rèn)識。針對受體的分子生物學(xué)相關(guān)研究，能夠通過研究分子結(jié)構(gòu)及基因序列推動人們了解各類物質(zhì)結(jié)構(gòu)與作用的關(guān)系，從而在細(xì)胞及分子層面研究受體進(jìn)行生理病理調(diào)節(jié)的機(jī)制[1]。分子生物學(xué)的發(fā)展使得人們對藥物篩選的研究與應(yīng)用提升到了分子水平，大大加速了藥物篩選的技術(shù)進(jìn)步。

1 高通量及高內(nèi)涵篩選技術(shù)

高通量及高內(nèi)涵篩選技術(shù)是分子生物學(xué)的重要應(yīng)用之一，高通量篩選((high throughput screening，HTS)和高內(nèi)涵篩選((high content screening HCS)是針對單細(xì)胞水平進(jìn)行多參數(shù)分析的細(xì)胞成像分析方法，高內(nèi)涵篩選（HCS）是高通量篩選的一種補(bǔ)充技術(shù)，更加側(cè)重于多細(xì)胞樣品的無偏成像。HTS及HCS在藥物篩選領(lǐng)域有著較為廣泛的應(yīng)用[2]。與傳統(tǒng)的藥物篩選技術(shù)相比，HTS及HCS通過顯微鏡下的全自動成像及無偏成像從細(xì)胞樣品獲得了更加豐富的信息，同時能夠在更為優(yōu)化的生理生化環(huán)境中進(jìn)行藥物篩選研究，所獲取的數(shù)據(jù)集更為豐富，對于藥物篩選過程中所出現(xiàn)的各類問題有著更好的解釋能力。

高通量HTS技術(shù)具有具有高效、快速、微量的特點(diǎn)，其篩選靶點(diǎn)包括酶、受體、離子通道，一般以單一模型針對大量樣品進(jìn)行活性篩選，主要分析方法包括光吸收、化學(xué)發(fā)光、熒光檢測等，HTS技術(shù)能夠建立可觀的靶標(biāo)及化合物庫，在先導(dǎo)化合物的評價、優(yōu)化、毒性研究等多個階段均有重要作用，對于創(chuàng)新藥物的研制有著重要的應(yīng)用價值。

高內(nèi)涵HCS技術(shù)主要在細(xì)胞分子層面進(jìn)行多元分析，能夠?qū)?xì)胞的生長過程、分化過程、凋亡過程以及其代謝、傳導(dǎo)等進(jìn)行全面的分析，篩選靶點(diǎn)包括細(xì)胞器、膜受體、胞內(nèi)成分、離子通道等，HCS技術(shù)對于細(xì)胞表征的生理病理特征有更強(qiáng)的分析功能，其分析獲取的先導(dǎo)化合物及陽性化合物有效率及成功率更高。

相比較而言，高通量HTS技術(shù)更為側(cè)重于同時能夠?qū)Υ罅康臉颖具M(jìn)行檢測，目前HTS技術(shù)已經(jīng)進(jìn)步到可以日篩選10萬以上樣本超高通量階段。而高內(nèi)涵HCS技術(shù)更側(cè)重于對單個樣本的分析所呈現(xiàn)的信息更為豐富。在藥物篩結(jié)合，能夠在樣本數(shù)量及微觀豐富性方面大大提高藥物篩選的可靠性及有效性。

2 反義核酸技術(shù)

反義核酸技術(shù)是基因表達(dá)調(diào)控的一種作用方式，它是以mRNA具有互補(bǔ)作用的RNA分子，其基礎(chǔ)的作用機(jī)理是與靶RNA進(jìn)行堿基配對，反義核酸技術(shù)能夠通過與特定的mRNA進(jìn)行互補(bǔ)、阻斷、翻譯等作用，使得某些基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)封閉，體現(xiàn)為不表達(dá)或低表達(dá)的形式[3]。反義核酸技術(shù)具有基因調(diào)節(jié)作用，對于有害及失控基因的抑制有著重要的作用。目前反義核酸技術(shù)主要包括反義RNA ( antisense RNA)、反義寡核普酸(an tisense oligonucleotide）、RNA干擾技術(shù)(RNA interference, RNAi)等作用機(jī)制。

當(dāng)前，反義核酸技術(shù)主要應(yīng)用于體內(nèi)外模型中對于各項(xiàng)靶基因功能進(jìn)行驗(yàn)證或檢測，對于基因敲除技術(shù)有一定的替代作用。反義核酸技術(shù)能夠通過高通量HTS技術(shù)的應(yīng)用，大量快速的發(fā)現(xiàn)藥物靶基因，并且能夠特異性的對潛在靶點(diǎn)的基因作用進(jìn)行控制與干擾，這一技術(shù)能夠?yàn)樗幬锏陌悬c(diǎn)發(fā)現(xiàn)以及疾病的基因治療提供較為可靠的手段，該技術(shù)廣泛的應(yīng)用于基因治療、基因組研究、轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究等。

反義核酸技術(shù)應(yīng)用與藥物篩選之中，具有高度特異性、高生物活性、高信息量等優(yōu)點(diǎn)，同時由于反義核酸沒有被發(fā)現(xiàn)存在顯著毒性，并且能夠最終實(shí)現(xiàn)降解與消除，因此相比傳統(tǒng)的藥物篩選方法，其獲取的藥物更為安全、低毒。目前反義核酸技術(shù)在腫瘤、病毒感染、神經(jīng)退行類疾病的藥物篩選中有著重要的應(yīng)用。

3 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)的基本作用機(jī)制是通過微縮技術(shù)，利用分子生物學(xué)中特異性分子能夠相互作用的原理，將不連續(xù)分析過程在硅芯片或玻璃芯片上進(jìn)行集成，從而形成微型的化學(xué)生物分析機(jī)制，從而對各類生物組分進(jìn)行快速高效的檢測與篩選。生物芯片技術(shù)能夠有效應(yīng)用與藥物篩選過程，通過測定分析可以對藥物的靶點(diǎn)、活性、毒性、細(xì)胞表達(dá)等進(jìn)行發(fā)現(xiàn)與評價。

依據(jù)固化內(nèi)容物的差別，生物芯片可以分為基因芯片、多糖芯片、蛋白質(zhì)芯片、神經(jīng)元芯片等；根據(jù)作用原理的不同，生物芯片可以分為組件型微陣列、通道型微陣列、生物傳感等多種類型的生物芯片，微陣列形式的生物芯片又稱基因芯片(DNA Microarray)，是目前研究中較為成熟的在藥物篩選領(lǐng)域有著重要應(yīng)用前景的技術(shù)形式，尤其對于需要進(jìn)行長時間追蹤研究的藥物篩選，這一方法有著尤為顯著的作用。該方法能夠針對上千個基因進(jìn)行平行測定，對于有效靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)作用明顯[4]。同時，該技術(shù)對于藥物篩選過程中的化合物的基因表達(dá)變化能夠進(jìn)行較好的監(jiān)測。目前的DNA Microarray主要的應(yīng)用形式有兩種，一類是對大量不同靶標(biāo)的DNA進(jìn)行分析，一類是對同一靶標(biāo)的DNA通過不同探針序列的操作形式進(jìn)行分析。

蛋白質(zhì)芯片也在藥物篩選中有著重要的應(yīng)用，該技術(shù)突破了原有的應(yīng)用較多的酵母雙雜交技術(shù)的限制，能夠通過功能性與檢測性的蛋白質(zhì)芯片實(shí)現(xiàn)對于藥物篩選的體外研究。目前的主要分析手段包括核磁共振、質(zhì)譜儀、高效液相分析等。

此外，組織芯片是一種將大量微小組織固化于某介質(zhì)而組成的高通量微陣列，這一研究方法能夠使藥物篩選在DNA、RNA、蛋白質(zhì)多個層面上進(jìn)行平行研究，對不同層面的研究結(jié)果進(jìn)行匯總并建立數(shù)據(jù)庫，對于指標(biāo)、靶點(diǎn)、抗體等的篩選具有顯著的適用性。

4 基因工程技術(shù)

基因工程技術(shù)是近年來分子生物學(xué)的重要進(jìn)展，主要的技術(shù)形式是基因拼接及基因重組，該技術(shù)將不同類型的基因進(jìn)行預(yù)先設(shè)計，而后在體外構(gòu)建雜交的DNA分子，并將之導(dǎo)入活體細(xì)胞之后對原有的細(xì)胞特征進(jìn)行改變。

基因工程技術(shù)的出現(xiàn)使得從人體中提取受體或受體亞型成為可能，并將所提取的基因在哺乳動物的細(xì)胞或者某類微生物中進(jìn)行重組，從而用于進(jìn)行藥物篩選模型的構(gòu)建。這一技術(shù)的應(yīng)用使得動物模型的有效性被大大加強(qiáng)，由于經(jīng)過基因重組之后，實(shí)際的受體是從人體中提取的受體，通過該方法獲得重組的受體，更為接近受體在人體中存在和發(fā)揮作用的狀態(tài)，動物僅是研究的載體，因此其藥物篩選的特異性與針對性得到了提升。這一方法的應(yīng)用使得藥物的篩選與制備獲得了顯著的突破[5]。該方法的出現(xiàn)使得原有的只能在人體特定位置或特定環(huán)境中存在的受體獲得了大規(guī)模的制備，從而降低了特定受體的藥物篩選的難度?；蚬こ碳夹g(shù)在胰島素、干擾素、乙肝疫苗、白細(xì)胞介質(zhì)等藥物的制造出發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，將基因工程技術(shù)繼續(xù)應(yīng)用于藥物篩選，能夠有效提高藥物的特異性與篩選效率。

5 轉(zhuǎn)基因動物模型

轉(zhuǎn)基因動物模型是通過對動物模型進(jìn)行代際改良而獲得醫(yī)藥目的的一種技術(shù)運(yùn)用形式，其基本作用機(jī)制是運(yùn)用外源性的基因，通過實(shí)驗(yàn)的方法導(dǎo)入動物染色體基因組內(nèi)，通過實(shí)驗(yàn)篩選后獲得能夠?qū)⑥D(zhuǎn)入基因遺傳到下一代的動物模型。轉(zhuǎn)基因動物模型可以在藥物篩選中用于疾病模型的制作，從而使得人類相關(guān)疾病能夠通過轉(zhuǎn)基因動物模型獲得更具特異性的研究[6]。通過動物模型的制備，特定的分子、細(xì)胞及整體情況能夠在同一個動物模型中獲得整合，對于特定疾病的藥物篩選有著更為全面的模擬效果。

傳統(tǒng)的動物模型一般通過外源干預(yù)的方法制作動物的疾病模型，由于疾病發(fā)生的過程、方式、誘因等存在較大的差異，因此相關(guān)藥物的研制在應(yīng)用于人體方面需要有一個較長的研究試驗(yàn)過程。轉(zhuǎn)基因動物模型的運(yùn)用能提升藥物篩選對于人體的適用性，從而將這一過程大大縮短。目前轉(zhuǎn)基因動物模型在抗腫瘤、抗肝炎病毒、抗艾滋病病毒、腎臟疾病藥物等方面的研究發(fā)揮了重要的作用，但由于動物與人體不可避免的差異性，轉(zhuǎn)基因動物模型仍然存在種族差異、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物能否獲得長期穩(wěn)定表達(dá)、目的基因在試驗(yàn)過程中是否獲得了完整的等位基因定位等問題。

6 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是一種能夠單次高速分析上萬細(xì)胞的定量分析方法，該方法在細(xì)胞分子水平上運(yùn)用抗體單克隆的方式對細(xì)胞或生物例子進(jìn)行多參數(shù)分析。流式細(xì)胞術(shù)主要通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行操作，其分析速度快、準(zhǔn)確度高[7]。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多種單細(xì)胞抗體和熒光探針在流式細(xì)胞技術(shù)中獲得了廣泛應(yīng)用，通過熒光對細(xì)胞分子進(jìn)行標(biāo)記，細(xì)胞的受體、離子、胞內(nèi)成分、配基等都能獲得快速分析，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞抗藥性檢測、癌基因與抗癌基因檢測等方面有著較好的應(yīng)用，這些功能使得流式細(xì)胞術(shù)能夠較好的用于創(chuàng)新藥物的篩選。

流式細(xì)胞分析的優(yōu)點(diǎn)在于對于細(xì)胞的分子層面的分析較為全面，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)從單色到多色的熒光分析，細(xì)胞膜到細(xì)胞內(nèi)微觀成分的分析，細(xì)胞內(nèi)可溶成分分析，分子表型分析等多種技術(shù)的應(yīng)用。在藥物篩選方面，流式細(xì)胞術(shù)能夠通過對細(xì)胞凋亡的觀察與監(jiān)測提高藥物研制的針對性，在細(xì)胞凋亡研究中，流式細(xì)胞術(shù)能夠?qū)NA、膜成分、肌動蛋白、磷脂成分等的改變狀況進(jìn)行具體測定，并根據(jù)測定的結(jié)果為藥物篩選提供一定的有效參考。

7 免疫分析法

免疫分析法是藥物篩選中一種常用的分子生物學(xué)分析方法，其基本原理是可溶的抗體和抗原在接觸時能夠形成不相容的抗體抗原復(fù)合物，并發(fā)生可觀察課測量的沉淀作用。該方法主要利用抗原以及抗體的特異性，根據(jù)其對藥物、蛋白、微生物、激素等的反應(yīng)進(jìn)行特定的分析。目前，免疫分析法較為主要的分析技術(shù)包括放射免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析等。

免疫分析法能夠?qū)ι锢枚纫约八幬锎x參數(shù)等具體的指標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)的測定，從而了解藥物在試驗(yàn)過程中的吸收及作用情況，在對藥物的毒性試驗(yàn)、濃度試驗(yàn)方面，免疫分析法也有很好的適用性[8]。免疫分析法能夠?qū)υ囼?yàn)中的細(xì)胞分子的各類有效成分進(jìn)行具體的含量測定，對于藥品中是否含有某種特定物質(zhì)，以及特定物質(zhì)的影響作用均能進(jìn)行有效的指標(biāo)評價。

8 結(jié)論

藥物篩選是創(chuàng)新藥物研發(fā)的必經(jīng)階段，其篩選效率及其有效性對于后續(xù)的藥物研發(fā)有著重大的影響。運(yùn)用各類分子生物學(xué)技術(shù)，推進(jìn)藥物篩選向更為微觀更為精準(zhǔn)有效的方向發(fā)展，為藥物的篩選與制備提供更有效的指標(biāo)參考，對于提升藥物研發(fā)速度，降低研發(fā)成本有著重要的意義。各類新興的分子生物學(xué)技術(shù)為藥物篩選提供了新的模型與方法，而各類方法的相互融合組合利用，對于未來的創(chuàng)新藥物開發(fā)能夠提供更為有效的技術(shù)支持。

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Study on Application of Molecular Biology in Drug Screening

(Haiyuan College of Kunming Medical University, Yunnan Kunming 650000, China)

Drug screening is an essential process in the research and synthesis of new drugs. Through the screening of drugs, it is possible to find new compounds with specific drug action and therapeutic function from the existing massive compounds.Thedrug screening can reduce risk and costs of drug manufacture, improve the efficiency and shorten the cycle of drug research and development. With the continuous development of molecular biology technology, the application of this technology has played a significant role in the promotion of pharmacological research and clinical application of drugs. The molecular biology is of great significance to improve the screening efficiency and improve the success rate of drug screening..

Drug screening; Biotechnology; Molecular biology; Application

R915

A

1671-0460（2017）12-2610-03

2017-04-13

梁璇（1981-），女，廣西桂林人，講師，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)及分子生物學(xué)在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用。