黃芪口服液降低大鼠順鉑毒性作用機制的尿液代謝組學研究

宋慧婷 李長印 ??萬瑤瑤 ??丁選勝 ??戴國梁 ??劉史佳 ??居文政

摘要采用基于液相色譜飛行時間質譜聯(lián)用（LCTOFMS）技術的代謝組學方法，分析大鼠尿液內源性代謝物的變化，研究黃芪口服液（HO）降低大鼠順鉑（CDDP）毒性的作用機制。采用低劑量多次腹腔注射CDDP的方法建立CDDP染毒大鼠模型，并連續(xù)給予16天HO。于第18天收集正常對照（Control）組、順鉑模型（CDDP）組和黃芪口服液（HO）組大鼠的24h尿液，進行LCTOFMS分析，以獲取尿液代謝物組數據集，對所得數據進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）等多元統(tǒng)計分析，以篩選潛在生物標志物。于第20天采集大鼠血清測定肌酐和尿素氮水平。血清指標測定結果表明，HO可以顯著降低CDDP染毒大鼠的肌酐和尿素氮水平（p<0.05）。PCA得分圖顯示，3組可分別聚類，HO組位于Control組和CDDP組中間，表明HO可部分改善CDDP所致大鼠尿液代謝產物的異常變化。綜合OPLSDA分析、t檢驗和倍數變化分析結果，最終共篩選并初步鑒定出35個尿液代謝產物作為HO減毒相關的潛在生物標記物。代謝通路分析結果表明，HO可通過糾正體內氨基酸代謝、能量代謝和核苷酸代謝等通路的紊亂，降低CDDP所致機體毒性。

關鍵詞黃芪口服液；順鉑；尿液；代謝組學；液相色譜飛行時間質譜聯(lián)用；毒性

1引言

順鉑（Cisdiaminedichloroplatinum，CDDP）對多種實體瘤具有良好的抗腫瘤療效，基于CDDP的化療方案目前依然是包括進展期非小細胞肺癌在內的多種癌癥臨床治療的標準一線化療方案[1]。雖然療效確切，但CDDP多發(fā)的嚴重毒副作用，特別是劑量限制性腎毒性，極大地限制了其臨床應用。因此，尋找能有效降低CDDP化療毒性，同時不降低乃至可增加其抗癌活性的化療輔助藥物逐漸成為研究熱點。研究表明，CDDP導致機體毒性的過程涉及到氧化損傷、細胞凋亡、炎癥反應、線粒體機能失調、NO受體、內皮縮血管肽受體和腎血流量動力學變化等多條內外源通路和多個環(huán)節(jié)[2～4]。因此，理想的CDDP化療保護劑也應該具有多環(huán)節(jié)多途徑的解毒機制。

傳統(tǒng)中藥具有多成分、多途徑、多靶點協(xié)同增效的整體作用特點，因此有望在防治CDDP機體毒性方面發(fā)揮獨特優(yōu)勢。黃芪（Radixastragali）為豆科植物膜莢黃芪Astragalusmebrananceus（Fisch.）Bge.和蒙古黃芪A.mongholicus（Bge.）Hsiao.的干燥根。性溫，味甘，歸肺、脾經。黃芪為常用補氣中藥，用藥歷史悠久，《神農本草經》將其列為上品。目前，黃芪以單味藥或復方廣泛應用于臨床腫瘤治療。臨床研究顯示，黃芪可增強腫瘤患者機體免疫力[5]，增強化療效果[6]，降低化療毒副反應[7]，改善患者的生活質量[8]。動物實驗表明，黃芪可通過升高白細胞數和胸腺指數、脾指數，提高血清中IL2和TNFα的水平來增強荷瘤小鼠機體免疫功能[9]；也可通過促進Bax蛋白表達、抑制Bcl2蛋白表達來誘導腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抑瘤效應[10]。因此，黃芪具有潛在的直接抗腫瘤作用，并可對抗化療毒副作用，有望成為一種良好的CDDP化療輔助用藥。

代謝組學是通過考察生物體系受刺激或擾動后其代謝產物的變化或其隨時間的變化，研究生物體系的代謝途徑的一種技術[11]，具有明顯的整體反應性特點，與中藥治療疾病的多環(huán)節(jié)、多靶點、協(xié)同起效的整體觀念十分吻合。近年來，越來越多的研究采用代謝組學方法考察中藥治療復雜疾病的藥效及作用機理[12，13]，但目前尚無從整體作用角度研究黃芪降低CDDP所致機體毒性作用機制的報道?；诖耍狙芯坎捎没贚CTOFMS技術的尿液代謝組學方法，從大鼠尿液內源性代謝物組的變化角度，初步闡明臨床常用黃芪制劑黃芪口服液（HO）降低CDDP毒性的作用及其機制。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

ABSCIEXTripleTOFTM5600液相色譜質譜聯(lián)用儀（美國ABSCIEX公司），配有MarkerViewTM和PeakViewTM等代謝組學研究相關軟件、CDS質譜自動校準系統(tǒng)、Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Biofugeprimor冷凍高速離心機、AU5800生化儀（美國Beckman公司）。

甲醇和乙腈（HPLC級，德國默克公司）；甲酸和甲酸銨（HPLC級，美國Tedia公司）；肌酐和尿素氮測定試劑（美國Beckman公司）。SD大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，實驗動物許可證：SCXK（滬）20130006。黃芪口服液（江蘇省中醫(yī)院院內制劑，產品批號：1501001，10mL/支）；注射用順鉑（CDDP，凍干型）源自齊魯制藥（海南）有限公司（批號：2WA2A1307047B，20mg/瓶）。實驗用水為MilliporeMilliQAdvantageA10超純水機制備的超純水。

2.2動物實驗及樣品處理

雄性SD大鼠24只，隨機均分為3組，分別為：（A）順鉑模型組（CDDPgroup）；（B）黃芪口服液組（HOgroup）；（C）正常對照組（Controlgroup）。適應1周后，A和B組均腹腔注射給予CDDP，給藥時間分別為第1，3，7，11，14天，共計5次，每次劑量為2.5mg/kg；C組腹腔注射等量生理鹽水。期間B組每日灌胃給予劑量為每只2mLHO，連續(xù)16天。于第18天搜集各組大鼠24h尿液，

70℃凍存?zhèn)溆?；于?0天采集各組大鼠血清，采用BECKMANAU5800生化儀測定血清肌酐和尿素氮水平，采用單因素方差分析對測定結果進行統(tǒng)計分析。

樣品分析前，室溫解凍各尿液樣品，渦旋混勻，吸取200μL，依次加入500μL甲醇，300μL水，渦旋振蕩1min混勻，在4℃以12000g離心10min，取上清液進行LCMS分析。同時取每個尿樣的上清液各20μL，渦旋混勻作為質控（QC）樣品。

2.3色譜質譜條件及樣品分析

色譜條件：Agilent1200液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Poroshell120SBC18（100mm×3.0mm，2.7μm），預柱為Poroshell120SBC18（5.0mm×3.0mm，2.7μm）。流動相A為含2mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸，流動相B為含2mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的甲醇/乙腈（1〖KG-3∶〖KG-51，V/V）。梯度洗脫：0～0.5min，5%B；0.5～12min，5%～100%B；12～16min，16～16.1min，100%～5%B；16.1～22min，5%B；1.3～16.5min切入質譜進行檢測。流速：300μL/min，柱溫：35℃，進樣量：5μL，進樣室控溫：8℃。

質譜條件：采用ABSCIEXTripleTOFTM5600液相色譜質譜聯(lián)用儀進行檢測，采用電噴霧離子化（ESI）源正負離子掃描模式，噴霧電壓（ISVF）：正離子5400V，負離子

4500V；離子化溫度（TEM）：550℃；霧化氣（GS1）：60psi；輔助加熱氣（GS2）：60psi；氣簾氣（CUR）：35psi。一級質譜采集范圍為m/z100～1000，累積時間0.250015s；DP：80V；CE：10eV。采用IDA模式采集二級質譜，采集范圍為m/z50～1000，累積時間0.100006s，DP：80V；CE：35eV；CES：15；IRD為67；IRW為25。IDA轉換標準為：信號強度>500cps，分子量誤差50mDa，每個循環(huán)最多監(jiān)測8個離子，在4Da內排除同位素。采用Analyst1.6.0軟件控制LCMS分析系統(tǒng)，并采集分析數據。

樣品采用上述LCTOFMS分析方法進行分析。為保證并監(jiān)測分析系統(tǒng)穩(wěn)定性，確保獲取數據的可靠性，本實驗首先連續(xù)進樣5針QC樣品以平衡色譜柱和系統(tǒng)，然后分析待測樣品。每隔5個樣品采用CDS系統(tǒng)自動校準一次，每隔10個樣品插入一個QC樣品。同時各組樣品隨機分布在整個分析批，以消除進樣次序對分析結果的影響。

2.4數據處理

2.4.1數據有效性驗證

根據QC樣品中分布于不同保留時間的代表性離子的色譜峰強度、保留時間（tR）和質荷比（m/z）準確度信息，對儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性和分析數據的質量進行評價，并為后續(xù)樣品預處理參數設定提供依據。采用主成分分析（PCA）評估QC樣品聚類效果，進一步驗證分析數據的有效性和可靠性。

2.4.2預處理過程依據QC樣品中代表性色譜離子的tR和m/z的誤差范圍設定參數，將LCMS原始數據導入Markerview軟件中進行色譜峰的尋找和校準。根據tRm/z數據對應檢測到的色譜峰的離子強度；根據80%原則及去除同位素離子獲取有意義的連續(xù)性變量；采用色譜峰總面積歸一化法對數據進行歸一化處理。

2.4.3多元統(tǒng)計分析將預處理過的分析數據導入SIMCAP14.0中進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）。PCA用于驗證分析系統(tǒng)性能的穩(wěn)定性和分析數據的質量，并發(fā)現(xiàn)可能的逃逸樣品。OPLSDA用于概覽整個分析批的數據，并分辨出導致組間差異的變量。以OPLSDA模型中得到的投射變量影響值（Variableimportanceinprojection，VIP）的統(tǒng)計學差異閾值大于1作為標準篩選差異代謝物。同時，采用Markerview軟件的t檢驗功能對預處理過的數據進行組間雙側獨立樣本t檢驗和倍數變化（Foldchange，F(xiàn)C）分析，以同時滿足t檢驗的p<0.01和FC>2為標準篩選差異代謝物。選取上述兩種篩選方法中的共同部分作為最終的差異代謝物。通過對比CDDP組與Control組和HO組間的共有差異代謝物，篩選變化趨勢一致者作為HO緩解大鼠CDDP毒性作用的潛在生物標志物（Potentialbiomarkers，PBs）。

2.4.4生物標志物鑒定和代謝通路分析通過解析各個PB的母離子和子離子TOFMS圖譜中蘊含的元素組成和化學結構信息，獲得其相應的候選化合物列表；通過搜索匹配Chemspider，HMDB，METLIN，Massbank和KEGG等代謝組學相關數據庫中的相應化合物及其MS/MS2級圖譜，排除干擾的候選化合物，最終初步鑒定相應PB的化學結構。將包含峰強度信息的已鑒定PBs的數據集進行如下處理：（1）導入MultipleArrayViewer以生成熱圖，并進行HCA分析；（2）導入MetaboloAnalyst3.0中進行代謝通路分析，同時結合文獻報道對生物標志物的生理學意義進行深入探討。

3結果與討論

3.1HO對CDDP模型大鼠的肌酐、尿素氮含量的影響

腎臟損害是CDDP最為常見的嚴重不良反應。血清中肌酐和尿素氮水平是反應腎功能的主要指標。如表1所示，給予CDDP后，大鼠血清中肌酐和尿素氮水平顯著升高（p<0.01），而連續(xù)給予HO可顯著降低CDDP導致的肌酐和尿素氮水平的升高（p<0.05），表現(xiàn)出明顯的改善腎臟損傷作用。

3.2HO降低大鼠CDDP毒性的代謝〖ZH（組學研究

3.2.1代謝輪廓分析采用LCTOFMS進行尿液樣本的分離和數據采集，圖1分別展示了正、負離子模式下各組典型的總離子流色譜圖（Totalionchromatograms，TICs）。由TIC圖可知，CDDP組，HO組和Control組的圖譜有一定差異。在對分析數據進行預處理前，首先需要對所獲得的分析數據的質〖ZH）量和有效性進行驗證。數據有效性驗證結果表明，QC樣品中分布于不同保留時間的代表性離子的色譜峰強度的RSD均小于10%，tR漂移均小于0.25min，m/z波動范圍不超過0.000007；同時本批分析數據的PCA分析結果顯示，PCA得分圖（圖2）中QC樣品緊密聚集。由此可知，該批次樣品分析過程中分析系統(tǒng)相對穩(wěn)定，獲得的分析數據基本可以反映樣品的真實狀態(tài)。

為了進一步考察其代謝輪廓變化，采用無監(jiān)督的PCA方法處理LCMS數據，以表征組間差異。從PCA得分圖（圖2）可見：3組樣品在不同的區(qū)域分別聚類，組間可明顯區(qū)分，且HO組樣品位于CDDP組和Control組之間，表明給予HO后可使CDDP所致的機體損傷向正常狀態(tài)恢復。

3.2.2生物標志物的篩選和鑒定先后采用監(jiān)督性的OPLSDA模式識別方法、組間雙側獨立樣本t檢驗和倍數變化分析對LCMS數據進行分析，以同時滿足VIP>1，p<0.01和FC>2為標準篩選導致組間差異的尿液代謝產物。根據其在不同組間的含量變化趨勢，共從中篩選出197個（正離子133個，負離子64個）差異代謝物作為HO緩解大鼠CDDP毒性作用的PBs。

采用2.5節(jié)方法對所有197個PBs進行初步鑒定。以PB3（m/z_tR為141.0658_2.39）正離子為例，根據其分子離子m/z141.0658的精確分子質量測定（誤差在5mDa以內）及同位素匹配等原則可知，C6H8N2O2為其候選分子式；在METLIN和KEGG數據庫中共有4個內源性代謝物Ethylimidazolecarboxylate，Methylimidazoleaceticacid、Gaboxadol和1，3Dimethyluracil與此分子式相對應。如圖3所示，在PB3的二級圖譜中，其分子離子可先后丟失18Da（H2O）和28Da（CO），表明其化學結構中含有羧基，據此可以排除候選化合物Ethylimidazolecarboxylate、Gaboxadol和1，3Dimethyluracil。而可歸屬為咪唑環(huán)的特征碎片的m/z為68.0516的碎片離子的存在，可進一步證明該圖譜應為Methylimidazoleaceticacid的二級圖譜。借助TOFMS的精確分子質量測定和Peakview軟件的fragmentsPane功能，我們對PB3的特征碎片離子進行了合理歸屬（如圖3所示）。需要指出的是，上述步驟并不能保證PBs的唯一歸屬，尚需參考相關文獻報道來確認鑒定結構。最終，通過匹配METLIN等數據庫，解析2級圖譜和參考相關報道，初步鑒定了35個PBs。表2總結了35個PBs的詳細信息，包括離子類型、質荷比、保留時間、分子式、化合物名稱、CDDP組與Control組相比的變化趨勢、VIP值、p值、FC值等。

將包含35個PBs化合物名稱和相對色譜峰強度的數據導入MultipleArrayViewer軟件，經lg2轉化后進行HCA聚類分析生成其相應的熱圖（圖4）。由圖4中顏色變化可以清晰地看到，給予CDDP后，各個PBs在尿液中的含量與Control組相比出現(xiàn)了明顯變化，而給予HO可改善這些改變；樹狀分支圖顯示了各個樣品間的親緣關系，由此可知，HO大體位于CDDP和Control中間，形象地反映了HO改善CDDP所致?lián)p傷的作用。

3.3代謝通路分析及其生物學意義探討

將包含35個PBs化合物名稱和相對色譜峰強度的數據導入MetaboloAnalyst3.0中進行代謝通路分析，如圖5所示，有6條顯著改變（p>0.05）的代謝通路，分別對應12個已鑒定的PBs。而通過HMDB和KEGG等數據庫及文獻搜索可知，剩余21個PBs對應于7條通路（詳見表2中的PA14～20）。這些通路的紊亂與回調與CDDP的機體毒性及HO的解毒作用機制緊密相關。

氨基酸是機體的重要營養(yǎng)物質，和蛋白質及多肽一樣，氨基酸代謝對于機體的生長、繁殖及免疫等而言至關重要[14]。標志物鑒定結果（表2）表明，共有16個潛在生物標志物可能與9條氨基酸生物合成及代謝通路相關，其中13個在給予CDDP后濃度水平顯著上調，而在給予HO后可明顯下降，說明連續(xù)給予HO可回調CDDP導致〖CM（44的機體氨基酸代謝通路紊亂。而代謝通路分析（圖5）結果顯示，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代謝〖CM）

通路為改變最為顯著的代謝通路，且有多達12個潛在標志物與此通路相關（圖6）。由此可知，回調苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代謝通路的紊亂為HO降低CDDP機體毒性的主要作用途徑之一。此外，給予CDDP后Allysine[15]和4Pyridoxicacid的下調，表明CDDP會導致機體維生素B6代謝通路紊亂。而維生素B6是機體內某些輔酶的組成成分，參與多種代謝反應，尤其是和氨基酸代謝有密切關系[16]。由此可以推測，CDDP導致的氨基酸代謝紊亂可能與維生素B6代謝紊亂有關。

脂肪酸是細胞膜的重要組成成分和體內最大的能量儲備物質。據報道，單一劑量的CDDP會導致細胞內鈣非依賴性磷脂酶A2的激活和線粒體脂肪酸氧化的抑制，最終會使非酯化脂肪酸和甘油三酯在血清、尿液和腎臟組織內積累[17]。由表2和圖6可知，給予CDDP后，有3個脂肪酸類代謝產物（PB16，PB27，PB35）出現(xiàn)明顯上調，這與之前的研究報道一致；同時也發(fā)現(xiàn)1個脂肪酸類代謝產物（PB26）下調。

煙酸及煙酰胺是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，參與體內脂質代謝，組織呼吸的氧化過程和糖類無氧分解等過程。因此，給予CDDP后3個煙酸和煙酰胺通路相關代謝物的含量上調（PB23和PB24）或下降（PB21），提示可能存在脂肪酸代謝、三羧酸循環(huán)等代謝通路紊亂；而三羧酸循環(huán)代謝產物PB9的上調進一步表明CDDP導致了三羧酸循環(huán)的紊亂。而這些現(xiàn)象與先前有關CDDP可導致機體線粒體機能失調，繼而引發(fā)ATP合成障礙，造成機體能量代謝紊亂的報道相一致[18]。

根據VIP值大小可判斷代謝物對組間差異的貢獻度。將表2中所有35個PBs按VIP值重新排序發(fā)現(xiàn)，共有15個PBs的組間對比VIP值均大于2，表明與這些PBs相關的代謝通路與HO改善CDDP毒性作用最為相關。而在這15個PBs中，除了11種化合物與上述的氨基酸代謝和能量代謝紊亂外，另有PB25（VIP排名第2）與嘌呤代謝相關，PB4，PB1和PB14（VIP排名第7，11，12）與嘧啶代謝相關，它們在給予CDDP后均顯著升高，而在給予HO后又可顯著回調，這表明回調核苷酸代謝的異常激活可能為HO降低順鉑毒性的主要作用機制之一。

基于上述分析，根據文獻報道和KEGG數據庫信息，可將HO減弱順鉑所致大鼠機體毒性所涉及到的體內主要代謝通路網絡總結如圖6所示，HO主要可通過調節(jié)機體苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代謝、脂肪酸代謝、三羧酸循環(huán)、維生素B6代謝、煙酸煙酰胺代謝、嘌呤和嘧啶代謝等通路的紊亂，恢復機體氨基酸、能量和核苷酸的代謝平衡，發(fā)揮其降低CDDP機體毒性的作用。

4結論

本研究采用基于LCTOFMS的尿液代謝組學研究方法，從整體水平代謝產物輪廓層面證明了HO降低大鼠CDDP毒性的作用，并從尿液中篩選鑒定出35個表征HO減毒作用的PBs。本研究初步闡明了HO降低大鼠CDDP毒性的作用機制主要與改善機體氨基酸、能量和核苷酸代謝相關。

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KeywordsHuangqioralsolution；Cisplatin；Urine；Metabolomics；Liquidchromatographytimeofflightmassspectrometry；Toxicity

（Received1November2016；accepted30December2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.81503300）.