液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂產(chǎn)品中吡蟲啉及其3種代謝物

梁秀美 ??王祥云 ??薛曉鋒 ??齊沛沛 ??劉真真?ち踔?煒 ??周莉 ??王新全 ??王強(qiáng)

摘要建立了蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）檢測(cè)方法。在QuEChERS方法基礎(chǔ)上，針對(duì)目標(biāo)物化學(xué)性質(zhì)和樣品雜質(zhì)情況，對(duì)提取溶液的pH值、提取次數(shù)、凈化材料等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。最終以5%甲酸乙腈溶液提取兩次，無水MgSO4、NaCl鹽析分層，提取液經(jīng)增強(qiáng)型脂類去除材料（EMR）凈化，以LCMS/MS進(jìn)行測(cè)定，基質(zhì)外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸的平均加標(biāo)回收率為86.0%～111.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～9.6%之間，檢出限分別為0.20＼，3.50＼，0.40和14.00μg/kg，定量限分別為0.60＼，11.64＼，1.20和45.00μg/kg。本方法分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉及其3種代謝物的快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；蜂蜜；蜂花粉；吡蟲啉；吡蟲啉烯烴；吡蟲啉脲；6氯煙酸；增強(qiáng)型脂類去除材料

1引言

新煙堿類殺蟲劑為昆蟲乙酰膽堿受體激動(dòng)劑，是繼有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類等殺蟲劑之后的第四大類殺蟲劑[1]。吡蟲啉是其代表性藥劑，主要用于防治水稻、小麥、棉田中的蚜蟲、葉蟬、飛虱等30多種刺吸式口器害蟲、地下害蟲[2]。

吡蟲啉對(duì)哺乳動(dòng)物低毒，但對(duì)蜜蜂具有較大的潛在毒副作用[3]，主要包括高濃度下的急性毒性以及亞致死濃度下的學(xué)習(xí)能力降低[4]、記憶力下降[4，5]、出現(xiàn)非正常的覓食行為[6]及群勢(shì)衰弱[7]等慢性毒性[8]。鑒于吡蟲啉對(duì)蜜蜂的毒害作用，環(huán)保署與美國(guó)農(nóng)業(yè)部于2013年4月重申“使蜂群遠(yuǎn)離新煙堿類農(nóng)藥”是保護(hù)蜂群的必要舉措[3]。Severine等[9]的研究結(jié)果表明，吡蟲啉的烯烴代謝物等具有與其母體相似的蜜蜂毒性，因此在評(píng)估蜂產(chǎn)品中吡蟲啉殘留對(duì)蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)涵蓋其代謝物殘留的影響。吡蟲啉及其部分代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見表1。

吡蟲啉殘留的分析檢測(cè)方法較多，主要有液相色譜法[10，11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12，13]，但其代謝物的檢測(cè)方法較少[14，15]。Kamel等[14]建立了花蜜和花粉中吡蟲啉、噻蟲嗪、呋蟲胺及其代謝物的LCMS/MS檢測(cè)方法，以2%三乙胺乙腈提取、經(jīng)C18小柱凈化、氮吹濃縮后過膜進(jìn)樣，操作較為繁瑣。Garcia等[15]建立了蜜蜂中吡蟲啉和6氯煙酸的LC檢測(cè)方法，該方法需要兩次抽濾、兩次萃取、旋蒸濃縮等步驟，且未涵蓋吡蟲啉烯烴及吡蟲啉脲。本研究基于較為成熟的QuEChERS農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法＼[16]，建立了蜂蜜和蜂花粉樣品中吡蟲啉以及吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲和6氯煙酸等3種代謝物殘留量的LCMS/MS快速檢測(cè)方法。經(jīng)優(yōu)化后，本方法以酸化乙腈提取兩次，確保目標(biāo)物的提取效率，以新型凈化脫脂材料EMR替代傳統(tǒng)的分散固相萃取凈化材料，得到更佳的凈化效果。結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，可滿足蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉及其3種代謝物的快速測(cè)定要求。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

LC30A液相色譜儀（日本島津公司）；4500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（美國(guó)ABSCIEX公司）；68905975氣相色譜質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；HeraeusBiofugePrimoR離心機(jī)（美國(guó)ThermoScientific公司）；MTN2800D氮吹儀（北京華博科技制造有限公司）；QT2旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；BSA2202S電子天平（北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司）；0.22μm濾膜（天津博納艾杰爾公司）。

蜂產(chǎn)品（蜂蜜和蜂花粉，本地超市，本方法測(cè)定無吡蟲啉及其代謝物殘留）；吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品（1000mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（天津））；吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度均為99.0%，德國(guó)Dr.EhrenstorferGmbH公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲酸銨（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；三乙胺（TEA，色譜純，美國(guó)ROEScientific有限公司）；QuEChERSKits提取粉（6g無水MgSO4、1.5gNaCl）、十八烷基硅烷（C18）、乙二胺N丙基硅烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB），均購(gòu)自天津博納艾杰爾公司；ZSep（55299U，美國(guó)Supelco公司）；EMR凈化管（59821010，美國(guó)Agilent公司）；無水MgSO4（分析純，永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（MilliQ，美國(guó)Millipore公司）。

單標(biāo)儲(chǔ)備液：以乙腈定容，配制成質(zhì)量濃度分別為40，388，420和879mg/L的吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸單標(biāo)儲(chǔ)備液，于4℃保存。

混標(biāo)工作液：分別準(zhǔn)確移取適量上述單標(biāo)儲(chǔ)備液，以乙腈定容，配成吡蟲啉質(zhì)量濃度為1mg/L的吡蟲啉混標(biāo)（吡蟲啉〖KG-3∶〖KG-5吡蟲啉烯烴〖KG-3∶〖KG-5吡蟲啉脲〖KG-3∶〖KG-56氯煙酸=1.0〖KG-3∶〖KG-519.4〖KG-3∶〖KG-52.0〖KG-3∶〖KG-575.0，m/m）儲(chǔ)備液。于4℃保存，用時(shí)稀釋成所需濃度。

2.2樣品前處理

準(zhǔn)確稱?。?.00±0.05）g蜂產(chǎn)品于50mL離心管中，加入10mL水，渦旋混勻；隨后加入10mL5%甲酸乙腈溶液，渦旋混勻3min，再加入QuEChERSKits提取粉，立即手動(dòng)劇烈振搖30s，7000r/min離心3min。取上清液于另一個(gè)50mL離心管；下層樣品再加5mL5%甲酸乙腈溶液重復(fù)提取一次，合并提取液，待凈化。

EMR凈化管預(yù)先加2mL水渦旋混勻30s進(jìn)行活化；加入5mL上述提取液，渦旋混勻30s后，7000r/min離心3min；隨后取全部上清液加1.4g無水MgSO4，以除去水分，渦旋混勻30s后，7000r/min離心3min。取0.5mL上清液于2mL離心管中，加入0.5mL水混勻，過0.22μm濾膜，待LCMS/MS測(cè)定。

2.3LCMS/MS測(cè)定條件

采用文獻(xiàn)＼[14＼]中的儀器條件：UPLCHSST3色譜柱（10cm×2.1mm×1.8μm，美國(guó)Waters公司）；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為5mmol/L甲酸銨甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～15min，95%A；15～16min，60%A；16～17min，5%A；17～19min，95%A。流速0.35mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量5μL。

質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子切換掃描方式，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，噴霧電壓4000V，毛細(xì)管溫度350℃；氣簾氣（400Pa）、碰撞氣（7Pa）、噴霧氣（30Pa）和輔助噴霧氣（30Pa）均為氮?dú)狻８骰衔锏馁|(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

3結(jié)果與討論

3.1溶液pH值對(duì)提取效率的影響

6氯煙酸為酸性化合物，因此本研究首先考察了2%三乙胺乙腈、乙腈、0.1%～5%甲酸乙腈等不同pH值溶劑對(duì)提取效率的影響。取一定濃度的吡蟲啉混標(biāo)溶液于離心管中，加H2O、NaCl和不同pH值的乙腈，渦旋混勻、離心后，取等體積的上層有機(jī)相和水，混勻過膜，待LCMS/MS測(cè)定。由圖1可知，在2%三乙胺乙腈、乙腈的提取環(huán)境下，6氯煙酸的提取效率較低，這可能是因?yàn)樵趬A性和中性環(huán)境下〖CM（446氯煙酸以離子形式溶解于水中，降低了溶劑的提取效率；而在酸性條件下，6氯煙酸的提取效率顯著〖CM）

增強(qiáng)。而文獻(xiàn)＼[14＼]表明，以2%三乙胺乙腈提取后，經(jīng)C18柱凈化，LCMS/MS測(cè)定，6氯煙酸的回收率在64.1%～93.0%之間，即2%三乙胺乙腈對(duì)6氯煙酸具有良好的提取效果，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果存在一定的差異。為保障6氯煙酸的提取效率，同時(shí)兼顧其它待測(cè)物的回收率情況，本實(shí)驗(yàn)最終選擇5%甲酸乙腈為提取溶液。

3.2凈化過程

蜂花粉雖然源于植物花粉，但在其生產(chǎn)過程中，蜜蜂通過混入蠟腺分泌物而形成，從而含有較多蠟質(zhì)。Wiesta等[17]采用正己烷萃取和冷凍等方法去除了蜂花粉中的油脂。本研究也進(jìn)行了相應(yīng)的嘗試，但效果并不理想。此外，文獻(xiàn)＼[18，19＼]報(bào)道ZSep和EMR等凈化材料對(duì)于油脂類干擾具有較好的去除效果。因此，本實(shí)驗(yàn)在QuEChERS方法常用凈化材料C18、PSA、GCB之外，對(duì)ZSep、EMR等新型凈化材料進(jìn)行了考察。取樣品提取液，分別采用C18，PSA，GCB或ZSep等材料進(jìn)行凈化；或取樣品提取液于EMR凈化管中凈化（方法同2.2節(jié)），凈化后經(jīng)脫水過膜，以GCMS測(cè)定，其總離子流圖（TIC，圖2和圖3）表明，蜂蜜提取液本身較為純凈，5種凈化材料均可滿足實(shí)驗(yàn)要求；蜂花粉提取液則有較多的干擾物質(zhì)，5種凈化材料均有一定的凈化效果，其中EMR的凈化效果明顯優(yōu)于其它4種凈化材料。其原因可能是EMR通過疏水作用選擇性吸附長(zhǎng)鏈脂類，形成脂類EMR聯(lián)合體，并通過離心沉淀或溶于水相的形式實(shí)現(xiàn)對(duì)提取液的有效凈化[19]。

3.3凈化材料對(duì)回收率的影響

文獻(xiàn)＼[14＼]表明，在2%三乙胺乙腈的提取條件下，PSA對(duì)6氯煙酸具有強(qiáng)烈的吸附作用，導(dǎo)致添加樣品中6氯煙酸回收率為0。因此，本研究在5%甲酸乙腈的提取條件下，考察了C18、PSA、GCB、ZSep、EMR等備選凈化材料對(duì)待測(cè)物回收率的影響。除在空白基質(zhì)提取液（見2.2節(jié)）加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液以及采用LCMS/MS測(cè)定外，其余步驟同3.2節(jié)。結(jié)果見圖4，在5%甲酸乙腈提取條件下，除GCB對(duì)6氯煙酸有吸附外，其它凈化材料對(duì)回收率均無明顯影響。GCB對(duì)6氯煙酸的吸附則源于6氯煙酸本身的平面結(jié)構(gòu)[16，20]。

3.4基質(zhì)效應(yīng)

采用LCMS/MS進(jìn)行殘留測(cè)定時(shí)應(yīng)盡量避免基質(zhì)效應(yīng)[21]，同時(shí)基質(zhì)效應(yīng)也可反映凈化效果。為比較C18、PSA、ZSep和EMR的凈化效果，分別以4種材料對(duì)蜂蜜、蜂花粉提取液（見2.2節(jié)）進(jìn)行凈化，并配制吡蟲啉及其代謝物的系列濃度基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)配制相應(yīng)的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)LCMS/MS測(cè)定后，以化合物的峰面積和濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)液的斜率比值評(píng)判基質(zhì)效應(yīng)的程度：比值>1，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；比值<1，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小，凈化效果越好；當(dāng)比值遠(yuǎn)離1，表明存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，必要時(shí)需進(jìn)一步凈化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)C18、PSA、ZSep、EMR分別凈化后，蜂蜜中吡蟲啉及其3種代謝物的比值在0.96～1.06之間，基質(zhì)效應(yīng)輕微。蜂花粉提取液中的基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，具體結(jié)果如圖5所示：除6氯煙酸存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其余待測(cè)物均呈現(xiàn)出明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)；其中C18、PSA、ZSep和EMR抑制效應(yīng)總體呈依次減弱，這也說明其凈化效果依次增強(qiáng)。雖然ZSep和EMR的基質(zhì)效應(yīng)較為接近，考慮到其在3.2節(jié)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了最佳的凈化效果，本實(shí)驗(yàn)最終選擇EMR作為凈化材料。

3.5確定提取次數(shù)

為確保蜂蜜，尤其是蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物的提取效率，進(jìn)一步考察了提取次數(shù)的影響。結(jié)果表明，蜂蜜中的待測(cè)物在第2次提取時(shí)仍有1%～5%的殘留，而第3次提取時(shí)則僅有<0.5%的殘留；蜂花粉中的待測(cè)物提取效率相對(duì)較低，第2次提取時(shí)尚有6%～16%的殘留，第3次提取時(shí)仍有約3%的殘留。因此，兩次提取即可將蜂蜜和蜂花粉中97%以上的待測(cè)物充分提取。本實(shí)驗(yàn)最終對(duì)蜂蜜和蜂花粉樣品進(jìn)行兩次提取，以確保提取效率。

3.6線性范圍、檢出限和定量限

在2.3節(jié)的色譜條件下，配制吡蟲啉及其代謝物的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)LCMS/MS測(cè)定后，以化合物的峰面積和濃度做圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以添加回收樣品峰響應(yīng)值為3倍噪音的添加濃度為方法檢出限（LOD），以10倍噪音的添加濃度為方法定量限（LOQ）。具體結(jié)果見表2，在蜂蜜和蜂花粉中，2吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸的LOD分別為0.20＼，3.50＼，0.40和14.00μg/kg，LOQ分別為0.60＼，11.64＼，1.20和45.00μg/kg，相關(guān)系數(shù)在0.9992～1.0000之間，能夠滿足定量分析的基本要求。

3.7準(zhǔn)確度和精密度

在蜂蜜和蜂花粉中添加適當(dāng)體積的吡蟲啉混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加水平均分別為L(zhǎng)OQ，5LOQ和10LOQ。由表3可知，在蜂蜜和蜂花粉中，4種化合物的平均加標(biāo)回收率在86.0%～111.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.7%～9.6%之間，方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性。

[LM][HT5”SS][HJ*4]表3蜂蜜和蜂花粉中的加樣回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

Table3RecoveryandRSDofspikedhoneyandpollen（n=5）

References

1WEILiNa，YEFei.Pestic.Sci.Adm.，2013，34（5）：27-34

魏立娜，葉非.農(nóng)藥科學(xué)與管理，2013，34（5）：27-34

2WANGXiaoHui，WANXiaoChun，HOURuYan.JournalofTeaScience，2012，32（3）：203-209

王孝輝，宛曉春，侯如燕.茶葉科學(xué)，2012，32（3）：203-209

3ZHAOYINan，GAOJingLin，WANGYuJie，LIUJunFeng，ZHAODongXiang.Agrochemicals，2014，53（3）：206-209

趙怡楠，高景林，王玉潔，劉俊峰，趙冬香.農(nóng)藥，2014，53（3）：206-209

42DecourtyeA，ArmengaudC，RenouM，DevillersJ，CluzeauS，GauthierM，PhamDelegueMH.Pestic.Biochem.Physiol.，2004，78（2）：83-92

5ZHANGHengMin，ZHAOPing，YANQiuXu，LIXin.Agrochemicals，2012，51（12）：858-862

張恒敏，趙平，嚴(yán)秋旭，李新.農(nóng)藥，2012，51（12）：858-862

6CresswellJE.Ecotoxicology，2011，20（1）：149-157

7WhitehornPR，O′ConnorS，WackersFL，GoulsonD.Science，2012，336（6079）：351-352

8LINZheGuang，MENGFei，ZHENGHuoQing，ZHOUTing，HUFuLiang.ActaEntomol.Sin.，2014，57（5）：607-615

藺哲廣，孟飛，鄭火青，周婷，胡福良.昆蟲學(xué)報(bào)，2014，57（5）：607-615

9SuchailS，GuezD，BelzuncesLP.Environ.Toxicol.Chem.，2001，20（11）：2482-2486

10LANShanShan，LIUHongCheng，LIQiWan，SHAOJinLiang，YANGFang.J.Anal.Sci.，2011，27（2）：171-174

蘭珊珊，劉宏程，黎其萬，邵金良，楊芳.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27（2）：171-174

11YANGDongDong，CONGLuJing，TIANMingMing，WANGMingHua.ChineseJ.Anal.Chem.，2014，42（6）：872-877

楊東冬，叢路靜，田明明，王鳴華.分析化學(xué)，2014，42（6）：872-877

12FidenteP，SecciaS，VanniF，MorricaP.J.Chromatogr.A，2005，1094（1-2）：175-178

13MartelAC，LairC.Inter.J.Environ.Anal.Chem.，2011，91（10）：978-988

14KamelA.J.Agric.FoodChem.，2010，58（10）：5926-5931

15GarciaMDG，GaleraMM，ValverdeRS，GalantiA，GirottiS.J.Chromatogr.A，2007，1147（1）：17-23

16AnastassiadesM，LehotaySJ，StajnbaherD，SchenckFJ.J.AOACInt.，2003，86（2）：412-431

17WiestaL，BuleteA，GiroudB，F(xiàn)rattaC，AmicS，LambertO，PouliquenH，ArnaudguilhemC.J.Chromatogr.A，2011，1218（34）：5743-5756

18LiY，KelleyRA，AndersonTD，LydyMJ.Talanta，2015，140：81-87

19HanLJ，MatarritaJ，SapozhnikovaY，LehotaySJ.J.Chromatogr.A，2016，1449：17-29

20SONGShuLing，LIChongJiu，MAXiaoDong，RAOZhu，WEIQian.ChineseJ.Anal.Chem.，2008，36（11）：1526-1530

宋淑玲，李重九，馬曉東，饒竹，韋倩.分析化學(xué)，2008，36（11）：1526-1530

21NardicD，Bonellif.Rapid.Commun.MassSpectrom.，2006，20（18）：2709-2716

AbstractAmethodwasdevelopedforthedeterminationofimidaclopridanditsmetabolitesimidaclopridolefin，imidaclopridureaand6chloronicotinicacidinhoneyandbeepollenbyliquidchromatographytandemmassspectrometry（LCMS/MS）.OnthebasisoftypicalQuEChERSmethod，thepHandtimesofextractionsolvent，sorbentswereoptimizedtoensuretheextractionefficiencyandthepurificationofextraction.Finally，themethodwasdevelopedasfollows：matrixwasextractedwith5%formicacidacetonitriletwice，andtheextractionwascleanedwithenhancedmatrixremovallipid（EMR），detectedwithLCMS/MSandquantifiedwithexternalmatrixstandards.Theresultsindicatedthattheaveragespikedrecoveriesofimidacloprid，imidaclopridolefin，imidaclopridureaand6chloronicotinicacidinhoneyandpollensampleswere86.0%-111.5%withrelativestandarddeviations（RSDs）of1.7%-9.6%，theLODswere0.20，3.50，0.40and14.00μg/kg，andtheLOQswere0.60，11.64，1.20and45.00μg/kg.Themethodwasrapidandsimplewithhighsensitivityandgoodreproducibility，andsuitableforthedeterminationofimidaclopridanditsthreemetabolitesresiduesinhoneyandbeepollen.

KeywordsLiquidchromatographytandemmassspectrometry；Honey；Hollen；Imidacloprid；Imidaclopridolefin；Imidaclopridurea；6Chloronicotinicacid；EnhancedmatrixremovalLipid

（Received15November2016；accepted6February2017）