銀離子固相萃取程序升溫大體積進樣氣相色譜法定量分析市售巧克力中的飽和烷烴礦物油

李冰寧 劉玲玲 張貞霞 武彥文

摘要建立了銀漬硅膠固相萃取柱離線（AgSPE）凈化，程序升溫進樣氣相色譜氫火焰離子化檢測器（PTVGCFID）定量分析巧克力中飽和烷烴礦物油（MOSH）的方法。以正己烷浸泡提取巧克力中的MOSH，離心后取1mL上清液，過0.3%Ag漬硅膠SPE柱凈化，氮吹濃縮，定容至0.2mL，注入GC分析；GC的進樣口程序升溫過程：初始溫度45℃，保持1min（分流比200〖KG-3∶〖KG-51），以250℃/min升溫至360℃（分流閥關(guān)閉2min），并保持27min（分流比100〖KG-3∶〖KG-51）；進樣量40μL；柱溫箱升溫程序為：35℃保持3min，以25℃/min升溫至350℃，以5℃/min升溫至370℃，保持10min，載氣為高純氮氣，流速1.3mL/min（壓力60kPa）；FID溫度為380℃。結(jié)果表明，本方法的MOSH定量限為0.5mg/kg，加標回收率為84.9%～108.6%，相對標準偏差（RSD）為0.2%～1.5%。運用本方法對25個市售巧克力樣品中的MOSH含量進行了測定，3個樣品未檢出，其余22個樣品中MOSH含量為1.09～8.15mg/kg（其中C16～C35的含量為0.56～4.43mg/kg），有3個樣品含量高于5.00mg/kg，為嚴重污染樣品。本方法操作簡便，檢出限低，適用于巧克力中MOSH的定量測定。

關(guān)鍵詞巧克力；礦物油污染；飽和烷烴；固相萃取；氣相色譜法；氫火焰離子化檢測器

1引言

礦物油是石油分餾得到的C10～C50烴類化合物的總稱，主要包括直鏈、支鏈和烷基取代環(huán)狀的飽和烷烴（Mineraloilsaturatedhydrocarbons，MOSH）以及烷基取代的芳香烴（Mineraloilaromatichydrocarbons，MOAH）兩類，同時含有極少量無烷基取代的多環(huán)芳烴及含硫、含氮化合物[1]。研究表明，食品中的礦物油，特別是C16～C35的MOSH會蓄積在人體的各種組織和器官中，如皮下腹部脂肪組織、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、肺、心臟和大腦中MOSH的含量為15～360mg/kg[2]。MOSH呈低等到中等毒性，大量蓄積容易引發(fā)微粒肉芽腫，誘導漿細胞瘤形成，改變免疫功能或誘導自身免疫反應，高劑量的長鏈MOSH甚至是腫瘤的啟動因子[3，4]。德國聯(lián)邦食品與農(nóng)業(yè)部2014年規(guī)定，遷移至食品的MOSH不得高于2mg/kg；聯(lián)合國糧農(nóng)和世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）規(guī)定，礦物油的每日允許攝入量（ADI）不能超過45mg/kg[2]。

食品中的MOSH來源于從原料種植到終產(chǎn)品銷售的各個環(huán)節(jié)，包括環(huán)境污染、加工過程的引入和包裝材料遷移等[2，4]。研究表明，食用油、谷物、嬰幼兒食品、母乳、食品包裝材料等均受到了不同程度的MOSH污染[5～9]。食品中礦物油的檢測主要采用液相色譜氣相色譜（配氫火焰離子化檢測器）聯(lián)用法（LCGCFID）[10～12]，該方法準確、靈敏、干擾低，但儀器昂貴、操作復雜，難以普及。LCGC中的液相色譜用于除去MOSH的干擾物，利用固相萃取（SPE）代替液相色譜，即SPEGCFID方法也能達到凈化目的[13～15]。目前，已經(jīng)建立了離線SPEGC定量檢測食用油、面包及食品接觸材料中MOSH的方法[6，14～17]，但巧克力樣品尚未涉及，原因是巧克力的基質(zhì)復雜，對MOSH檢測干擾嚴重。本研究通過優(yōu)化SPE凈化條件，根據(jù)巧克力的樣品基質(zhì)選取了合適的定量內(nèi)標，建立了離線SPE凈化，然后注入配有大體積程序升溫（Programmedtemperaturevaporization，PTV）進樣系統(tǒng)的氣相色譜儀，定量分析巧克力中MOSH的方法，并采用此方法檢測了市售巧克力中的礦物油污染情況。

2實驗部分

2.1儀器、與試劑

GC2010plus氣相色譜儀，配備PTV進樣系統(tǒng)和FID檢測器（日本Shimadzu公司）；DB5HT毛細管柱（15m×0.25mm×0.1μm，美國Agilent公司）；NEVAP氮吹儀（美國Organomation公司）。

正己烷、丙酮（色譜純，美國FisherScientific公司）；硅膠（0.063～0.200mm，德國Merck公司，使用前在馬弗爐中600℃烘烤6h，冷卻后置于干燥器中備用）；液體石蠟（Paraffinoil，用作外標）、聯(lián)環(huán)己烷（Cyclohexylcychlohexane，Cycy，用作內(nèi)標）、膽甾烷（5alphacholestane，Cho，作為MOSH洗脫結(jié)束的定位標準）、1，3，5三叔丁基苯（1，3，5tritertbutylbenzene，TBB，作為MOAH洗脫開始的定位標準）、C7～C40正構(gòu)烷烴混合標準溶液（用于揮發(fā)損失分析），均購自美國SigmaAldrich公司；巧克力樣品購于當?shù)爻?。玻璃器皿用鉻酸洗液、超純水、丙酮和正己烷淋洗后晾干。

分別配制10mg/mL的Cycy、Cho、TBB的單標溶液，然后分別取0.5mL的單標溶液，以正己烷定容至25mL，得到200mg/L的混合標準溶液。

2.2實驗方法

2.2.1巧克力中MOSH的提取

稱取5g切碎的巧克力樣品，加入30μL200mg/L混合標準溶液，10mL正己烷，渦旋混勻后浸泡過夜，振蕩、離心，取上清液，即得到樣品提取液[18]。

2.2.2SPE柱制備及樣品凈化

取5mL玻璃注射器（8cm×13mm，外層包裹鋁箔），底部放入玻璃纖維濾紙（Φ13mm），裝入3g0.3%銀漬硅膠（參照文獻＼[15＼]制備），輕輕敲實。SPE柱先用10mL正己烷淋洗，棄去流出液，待正己烷近干時，取1mL樣品提取液上樣過柱，待提取液近干時，加入10mL正己烷洗脫SPE柱。流出液的前2mL棄去，收集后續(xù)的5mL流出液，氮吹濃縮至0.2mL，備用。

2.2.3GC分析條件PTV參數(shù)：初始溫度45℃保持1min（分流比200〖KG-3∶〖KG-51），以250℃/min升溫至360℃并保持27min（分流閥關(guān)閉2min，使MOSH全部進入分析柱，隨后打開分流閥，以100〖KG-3∶〖KG-51分流比洗脫襯管中殘留的高沸點物質(zhì)）。進樣量40μL。柱箱升溫程序：35℃保持3min，以25℃/min升溫至350℃，以5℃/min升溫至370℃，保持10min，載氣為高純氮氣，流速1.3mL/min（壓力60kPa）；FID溫度為380℃。

2.2.4揮發(fā)損失考察將2mg/LC7～C40正構(gòu)烷烴混標溶液直接注入GC分析，隨后取2mg/L正構(gòu)烷烴混標溶液200μL，稀釋至5mL，氮吹濃縮至0.2mL，注入GC分析。平行測定11次，考察程序升溫進樣過程和氮吹濃縮過程的揮發(fā)損失。

3結(jié)果與討論

3.1樣品提取

巧克力固體樣品切成小塊，液體樣品則直接稱量5g，加入10mL正己烷提取，渦旋混勻、浸泡過夜，次日離心取上清液，采用烘干稱重法計算脂肪含量。結(jié)果表明，巧克力產(chǎn)品包裝上標識的95%以上的脂肪被提取出來。Fiselier等[15]發(fā)現(xiàn)，3g0.3%銀漬硅膠能夠保留400mg油脂，建議上樣量不超過200mg油脂。根據(jù)實驗結(jié)果，1mL巧克力提取液的平均油脂含量是0.17g，因此，確定SPE柱的上樣體積為1mL。結(jié)果表明，SPE柱未出現(xiàn)甘油三酯流出，即過載現(xiàn)象。

3.2MOSH洗脫組分的確定

將Cho、TBB、Cycy混合標準溶液添加到巧克力基質(zhì)中，按照2.2.2節(jié)方法凈化樣品，分段接收流出液（1mL為1段），并注入GC檢測，以確定MOSH組分的洗脫區(qū)間。由于MOSH和MOAH先后流出，通常采用Cho和TBB作為定位標準，用于標示MOSH和MOAH的分離情況[15]。由圖1可見，前2mL流出液未出現(xiàn)任何標準品，可視為SPE柱的死體積。后續(xù)3～7mL流出液出現(xiàn)Cycy和Cho，且主要集中于3～5mL流出液。第8mL流出液中僅含極少量的Cycy和Cho，卻出現(xiàn)大量MOAH的定位標記物TBB。因此，收集第3～7mL流出液即得到MOSH洗脫組分。

3.3內(nèi)標物的選擇

由于FID對礦物油中所有烴類化合物的響應都一致，因而任意烴類化合物均可作為參考標準對MOSH進行定量分析[18]。然而，由于實際樣品的MOSH碳數(shù)范圍差異較大，采用外標定量法會引起分析誤差，內(nèi)標法則可以消除MOSH不同碳數(shù)范圍、操作方法和分析條件的影響，因而成為礦物油分析的常用定量方法。同樣，由于MOSH通常具有一定的碳數(shù)范圍，其GC譜圖中呈寬峰形式，即占據(jù)的色譜圖范圍較寬，內(nèi)標只能選擇在此寬峰的前后區(qū)域出現(xiàn)的化合物，即低沸點或高沸點的烷烴化合物。一般高沸點烷烴的熔點高，分流歧視效應明顯，不適合作內(nèi)標。因此，處于譜圖前面的低沸點烷烴常是內(nèi)標的選擇對象，如食用油中礦物油分析即選擇C18作內(nèi)標[6]。巧克力樣品在C18處存在樣品基質(zhì)干擾，無法用于定量分析。因此，本方法根據(jù)樣品譜圖選取Cycy作為內(nèi)標。

3.4揮發(fā)損失實驗

MOSH由不同碳數(shù)的烷烴組成，碳數(shù)越小，沸點越低。因此，含有不同沸程的MOSH在濃縮和GC進樣過程中均可能發(fā)生低沸點物質(zhì)的揮發(fā)損失，即分別在氮吹濃縮過程中和程序升溫進樣條件下低沸點化合物的揮發(fā)損失。本研究模擬MOSH餾分的濃縮步驟，對混合正構(gòu)烷烴溶液進行氮吹濃縮，結(jié)果表明，氮吹濃縮過程C11～C40的揮發(fā)損失很小，可以忽略（圖2B）。進樣過程的揮發(fā)損失則采用正構(gòu)烷烴溶液直接注入GC進行考察。由于程序升溫進樣口溫度的高低是揮發(fā)損失的關(guān)鍵，本研究設定了不同的進樣口初始溫度（45℃和75℃）。由圖2可見，當初始溫度為75℃時，C7～C10幾乎全部損失，C11損失75%，C18損失了10%以上，原因是進樣口溫度較高時，低沸點正構(gòu)烷烴在分流閥打開時直接氣化，

〖HK〖TS）并隨溶劑分流逸出。當進樣口溫度為45℃時，C11～C40峰面積基本相同，說明低溫可以抑制低沸點物質(zhì)的分流逸出，從而有效減少了低碳數(shù)烷烴的揮發(fā)損失。此時，可以選擇C11及其之后的烷烴作為MOSH的定量內(nèi)標。

3.5定量限

MOSH的GC譜圖是一個類似“駝峰”的寬峰，MOSH的含量通過計算GC譜圖的基線與駝峰之間的“空白”面積得到[18]。MOSH寬峰上方的尖峰為食品中的天然正構(gòu)烷烴，定量計算時需要扣除。定量限（LOQ）根據(jù)注入GCFID的MOSH質(zhì)量確定。一般經(jīng)驗認為進入FID的MOSH超過50ng時，GC譜圖的寬峰面積才能正確積分計算[18]。原因是MOSH是眾多烷烴化合物的集合（寬峰），其FID的檢測靈敏度僅是單個化合物（尖峰）的1%，因此，通常要求進入FID的MOSH總量至少達到50ng才能準確定量分析。本方法采用5g巧克力樣品，以10mL正己烷提取，離心分離后取1mL提取液過SPE柱凈化，隨后收集5mLMOSH流出液，濃縮至0.2mL，取40μL注入GCFID進行定量分析。整個過程相當于有0.1g巧克力樣品進入FID檢測，對應的LOQMOSH值為0.5mg/kg，即只有當巧克力中MOSH的含量高于0.5mg/kg才能檢出。

3.6加標回收率

以巧克力作為樣品基質(zhì)，分別〖ZH（添加液體石蠟標準溶液進行加標回收實驗，添加水平分別為10.0，20.0和30.0mg/kg。每個樣品及空白平行測定6次，計算平均加標回收率和相對標準偏差（表1）。結(jié)果表明，加標回收率在84.9%～〖ZH）108.6%之間，RSD在0.2%～1.5%之間，可以滿足分析檢測要求。

3.7樣品檢測

采用本法對市售的25個不同品牌及包裝的巧克力樣品中的MOSH含量進行檢測（表2）。結(jié)果表明，3個樣品中的MOSH含量低于檢出限，其余22個樣品中MOSH含量為1.09～8.15mg/kg，其中容易被人體吸收的C16～C35為0.56～4.43mg/kg。這些樣品中，3個樣品的礦物油含量低于2.00mg/kg，16個樣品的MOSH含量為2.00～5.00mg/kg，其中3#、17#和24#中的MOSH含量高于5.00mg/kg。一般認為，MOSH含量≤2mg/kg為低度污染，2～5mg/kg為中度污染，超過5mg/kg為嚴重污染。因此，市售巧克力中大多含有MOSH，且個別樣品存在嚴重污染。對比國外的研究結(jié)果，Moret等[19]研究的巧克力中礦物油含量為200～700mg/kg，其中一個樣品的可可豆原料受到嚴重污染，MOSH高達1300mg/kg。因此，巧克力的礦物油污染不容忽視。

食品中礦物油污染來源也是人們關(guān)注的熱點，德國聯(lián)邦風險評估所（BundesinstitutfürRisikobewertung，BfR）認為食品中礦物油主要來自食品包裝（如包裝上的印刷油墨及粘合劑）。巧克力的包裝材料有紙、鋁箔、錫箔、塑料等。本研究中的17#樣品是礦物油含量最高的塑料包裝巧克力醬，其污染原因可能是液體巧克力醬與包裝接觸面積較大。通常，通過分析MOSH譜圖可以推測礦物油污染來源。圖3A、3B、3C的MOSH譜圖范圍均由兩部分寬峰組成，其中低沸點寬峰的覆蓋范圍為C14～C25，中心位置位于C16和C18附近。根據(jù)文獻報道，這類MOSH屬于典型的包裝油墨遷移引起的礦物油污染[20]；圖3中MOSH的高沸點部分位于C25～C39（中心位置為C35）范圍的駝峰，這類MOSH通常認為源于潤滑油和塑料包裝粘合劑[21]。此外，聚α烯烴類（PAO）粘合劑的典型色譜峰的中心也位于C35附近[22]。由此可見，巧克力中的礦物油污染來源于生產(chǎn)加工與包裝遷移。

4結(jié)論

本研究建立了離線AgSPE凈化、PTVGCFID測定巧克力中MOSH的方法，并對部分市售的巧克力產(chǎn)品進行了檢測。結(jié)果表明，本方法的定量限為0.5mg/kg，加標回收率為84.9%～108.6%，可以用于巧克力中MOSH含量的測定。本方法檢測了25個市售巧克力樣品中礦物油污染情況，結(jié)果表明，22個樣品中檢出含有MOSH，含量為1.09～8.15mg/kg，其中容易被人體吸收的C16～C35含量為0.56～4.43mg/kg；且有3個樣品中礦物油含量超過了5.00mg/kg，屬于嚴重污染。因此，建立巧克力中礦物油的標準檢測方法并實施相應監(jiān)管十分必要。此外，根據(jù)GC的MOSH譜圖的碳數(shù)范圍分析了礦物油污染源，包括潤滑油、油墨和粘合劑等，可能來自巧克力原料采集、運輸、生產(chǎn)加工與包裝過程，建議生產(chǎn)企業(yè)與相關(guān)部門加強監(jiān)控，采取有效措施，保證食品安全。

References

1WUYanWen，WANGYing，LIBingNing，WANGXinXin，WANGYu，ZUWenChuan.J.FoodSafeQual.，2015，6（6）：2145-2150

武彥文，王穎，李冰寧，王欣欣，汪雨，祖文川.食品安全質(zhì)量檢測學報，2015，6（6）：2145-2150

2EuropeanFoodSafetyAuthority（EFSA）（2012）ScientificOpiniononMineralOilHydrocarbonsinFood.EFSAJ，2012，10（6）：2704，1-185

3BarpL，KornauthC，WuergerT，RudasM，BiedermannM，ReinerA，ConcinN，GrobK.FoodChem.Toxicol.，2014，72：312-321

4GrobK.J.Verbr.Lebensm.，2014，9：231-219

5GB27602014，ChineseStandardsforFoodAdditives.NationalStandardsofthePeople′sRepublicofChina

食品添加劑使用標準.中華人民共和國國家標準.GB27602014

6LIULingLing，WUYanWen，LIBingNing，WANGYu，YANGYiFan，ZUWenChuan，WANGXinXin.ChineseJ.Anal.Chem.，2016，44（9）：1419-1424

劉玲玲，武彥文，李冰寧，汪雨，楊一帆，祖文川，王欣欣.分析化學，2016，44（9）：1419-1424

7MondelloL，ZoccaliM，PurcaroG，F(xiàn)ranchinaFA，SciarroneD，MoretS，ConteL，TranchidaPQ.J.Chromatogr.A，2012，1259：221-226

8VollmerA，BiedermannM，GrundbckF，IngenhoffJE，BiedermannBremS，AltkoferW，GrobK.Eur.Food.Res.Technol.，2011，232：175-182

9ConcinN，HofstetterG，PlattnerB，TomovskiC，F(xiàn)iselierK，GerritzenK，F(xiàn)esslerS，WindbichlerG，ZeimetA，UlmerH，SieglH，RiegerK，ConcinH，GrobK.FoodChem.Toxicol.，2008，46：544-552

10FiselierK，GrobK.Eur.FoodRes.Technol.，2009，229：679-688

11TranchidaPQ，ZoccaliM，PurcaroG，MoretS，ConteL，BeccariaM，DugoP，MondelloL.J.Chromatogr.A，2011，1218：7476-7480

12BiedermannM，F(xiàn)iselierK，GrobK.J.Agri.FoodChem.，2009，57：8711-8721

13FioriniD，PaciaroniA，GigliF，BalliniR.FoodControl，2010，21：1155-1160

14MoretS，BarpL，GrobK，ConteLS.FoodChem.，2011，129：1898-1903

15FiselierK，GrundbckF，SchnK，KappensteinO，PfaffK.HutzlerC，LuchA，GrobK.J.Chromatogr.A，2013，1271（1）：192-200

16ANHongMei，KERunHui，LIUXiu，TIANFeiFei，WANGLiJuan，HUANGXinWang，YINJianJun.FoodFerment.Industr.，2016，42（1）：152-156

安紅梅，柯潤輝，劉秀，田菲菲，王麗娟，黃新望，尹建軍.食品與發(fā)酵工業(yè)，2016，42（1）：152-156

17LIKeYa，ZHONGHuaiNing，HUChangYing，CHENYanFen，LIUZhuoQin，WANGZhiWei.Sci.Technol.FoodIndus.，2015，19：280-285

李克亞，鐘懷寧，胡長鷹，陳燕芬，劉卓欽，王志偉.食品工業(yè)科技，2015，19：280-285

18BiedermannM，GrobK.J.Chromatogr.A，2012，1255：56-75

19MoretS，GrobK，ConteLS.Z.Lebensm.Unters.Forsch.A，1997，204：241-246

20DrozC，GrobKZ.LebensmUntersForsch.A，1997，205：239241

21BiedermannM，GrobK.J.ChromatogrA，2012，1255：76-99

22NotiA，GrobK，BiedermannM，DeissU，BrüschweilerBJ.Regul.Toxicol.Pharm.，2003，38：317-325

AbstractAnofflinesilverimpregnatedsilicagelsolidphaseextraction（AgSPE）approachcombinedwithaprogrammedtemperaturevaporizationgaschromatographyflameionizationdetector（PTVGCFID）wasproposedforroutineanalysisofmineraloilsaturatedhydrocarbons（MOSH）inchocolates.TheMOSHinchocolateswereextractedbynhexaneand1mLofextractwaspurifiedbyofflineAgSPEcolumn.TheSPEcolumnspackedwith0.3%AgactivatedsilicagelwereusedtoseparateMOSHfromtriglyceridesandolefinsinchocolates.TheeluentofMOSHfractionwasonly5mLandthenconcentratedto0.2mLthroughnitrogenblowingwithlittleevaporationloss.ThePTVparameterswereasfollows：theinitialtemperaturewassetat45℃andheldfor1min（splitratiowas200〖KG-3∶〖KG-51），thenwarmedupto360℃atlineargradientof250℃min 1andheldfor27min（splitvalvewasclosedfor2minfollowedbysplitratioof100〖KG-3∶〖KG-51）.TheGCinjectionvolumewas40μL.TheGCcolumnwasheatedfrom35℃（3min）to350℃at25℃/min，andthenraisedto370℃（10min）at5℃/min.Theflowrateofthecarriergaswas1.3mL/min（andpressurewas60kPa），F(xiàn)IDtemperaturewassetat380℃.Thelimitofquantification（LOQ）andtherecoveriesofthemethodwere0.5mg/kgand84.9%-108.6%，respectively，withtherelativestandarddeviations（RSD）of0.2%-1.5%.Twentyfivecommercialchocolatesampleswereanalyzedwiththeproposedmethod，anditwasfoundthattheMOSHinthreesampleswerenotdetected，andtheconcentrationsofMOSHinother22sampleswere1.09-8.15mg/kg（theconcentrationsofMOSHwithC16-C35componentwere0.56-4.43mg/kg）.Theresultssuggestedthatitwasnecessarytoroutinelydetectmineraloilcontaminationinchocolatesforfoodsafety.

KeywordsChocolate；Mineraloilcontamination；Saturatedhydrocarbons；Solidphaseextraction；Gaschromatography；Hydrogenflameionizationdetector

（Received14November2016；accepted12January2017）