增強氯化血紅素催化活性用于水胺硫磷比色檢測研究

陳華云 吳遠根 楊文平 趙靜

摘要建立了一種基于增強氯化血紅素（Hemin）過氧化物酶催化活性比色檢測水胺硫磷的方法。在H2O2存在下，Hemin催化氧化底物3，3′，5，5′四甲基聯(lián)苯胺（TMB），使其失去1個電子，導致反應(yīng)體系由無色變?yōu)樗{綠色。水胺硫磷的加入可提高Hemin對底物親和力，進一步增強其催化活性，使底物氧化失去2個電子，反應(yīng)體系由藍綠色變?yōu)辄S色，且顏色變化程度與水胺硫磷濃度成正比。在最優(yōu)條件下，本方法的動態(tài)檢測范圍為2～100μg/L，檢出限為1.2μg/L（3σ）。其它有機磷農(nóng)藥對水胺硫磷檢測無明顯干擾，實際樣品中水胺硫磷的加標回收率為93.0%～113.0%。本方法可應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中水胺硫磷殘留的檢測。

關(guān)鍵詞氯化血紅素；水胺硫磷；過氧化物酶；有機磷農(nóng)藥

1引言

水胺硫磷作為一種高毒有機磷農(nóng)藥，在蔬菜種植等方面仍被經(jīng)常非法使用，引發(fā)一系列安全問題[1]。目前，有機磷農(nóng)藥檢測的方法有色譜法[2]，酶抑制法[3]，免疫學[4，5]方法等。色譜法分析時間長且需要昂貴儀器和專業(yè)操作人員；酶抑制法等靈敏度相對較差，且易產(chǎn)生假陽/陰性現(xiàn)象。近年來，熒光法[6，7]、納米材料如納米金[8]、二氧化鈰[9]、磁性四氧化三鐵[10]、氧化石墨烯[11]、分子印跡技術(shù)[12]、離子遷移率譜儀預富集進樣技術(shù)[13]等被廣泛用于有機磷農(nóng)藥的檢測，但這些技能易受外部環(huán)境的干擾。因此需要開發(fā)更可靠，便捷的有機磷農(nóng)藥檢測方法。

氯化血紅素（Hemin）作為辣根過氧化物酶（HRP）的輔基，對HRP的催化活性至關(guān)重要。HRP化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)，在應(yīng)用過程中易受到外界環(huán)境的影響，成本較高，且反應(yīng)條件比較嚴格[14]。相對于HRP，Hemin的獲取成本較低、易儲存、不易變性，且在生物降解中更加穩(wěn)定。近年來，研究者采用少量Hemin與G四聯(lián)體構(gòu)建類辣根過氧化物酶生物傳感器，并成功用于赭曲霉毒素A[15]、癌癥標志物[16]、蛋白質(zhì)[17]等的檢測。本研究組也發(fā)現(xiàn)高濃度的Hemin本身也具有過氧化物酶的活性，且核酸適配體對Hemin催化活性有一定抑制作用，在此基礎(chǔ)上建立了基于Hemin催化活性比色檢測As的方法[18]。迄今為止，利用Hemin進行有機磷農(nóng)藥的比色檢測還鮮有報道。本研究建立了基于增強Hemin催化活性進行比色檢測水胺硫磷的方法，考察了Hemin的酶促反應(yīng)動力學，發(fā)現(xiàn)水胺硫磷的加入會進一步提高Hemin對底物3，3′，5，5′四甲基聯(lián)苯胺（TMB）的親和力，增強其催化活性，加快了底物TMB的氧化速度，使得反應(yīng)體系顏色發(fā)生顯著變化，從而實現(xiàn)水胺硫磷的比色檢測。本方法具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性好且裸眼可辨等優(yōu)點，可應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中水胺硫磷殘留的檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

吸收光譜用全波長讀數(shù)儀（ThermoScientificMultiskanGOMicroplateSpectrophotomer，USA）記錄。

Hemin（美國SigmaAldrich公司）；NaH2PO4、TMB、H2O2（30%）、水胺硫磷及其它有機磷的競爭性農(nóng)藥（阿拉丁股份有限公司（上海））；其它試劑均為市售分析純試劑。實驗所用水均為三次蒸餾水。

2.2水胺硫磷檢測

將3.5μL2mmol/LHemin溶液與不同濃度的水胺硫磷標準液（總體積≤5μL）充分混勻后，30℃孵育30min，然后加入一定體積20mmol/LNaH2PO4溶液（pH3.0），最后加入10μL2mol/LH2O2和10μL5mmol/LTMB混合液，補加蒸餾水至500μL，充分混勻，檢測其吸收光譜并計算ΔA（450nm），其中ΔA=A（水胺硫磷，450nm）-A（空白，450nm）。在空白對照實驗中，用5μL水替代不同濃度的水胺硫磷溶液。

2.3實際樣品分析

分別對兩個不同地點的廢水和西紅柿汁等樣品進行檢測。廢水分別從貴州大學附近的河流和農(nóng)田采集，并分別命名為廢水1和廢水2，用0.22μm膜過濾，待測。西紅柿購自當?shù)厥袌?，先榨成汁，并?000r/min條件下離心20min，上清液用0.22μm膜過濾，待測[19]。在實際樣品中，分別加入2和10mg/L水胺硫磷標準溶液，測定回收率。

3結(jié)果與討論

3.1實驗原理

前期研究發(fā)現(xiàn)，當TMB被催化氧化后，其二苯胺基上的N原子會失去一個電子，使得TMB分子帶一個正電荷，此時溶液的顏色為藍色。當Hemin與底物的濃度比增加后，則反應(yīng)體系的催化活性會進一步增強，導致所有TMB分子中的2個N原子均失去電子，此時溶液的顏色為黃色[18]。圖1展示了本方法檢測水胺硫磷的基本過程。在H2O2存在下，Hemin催化氧化底物TMB，使其失去1個電子，導致反應(yīng)體系由無色透明變?yōu)樗{綠色。水胺硫磷中的氨基、芳香環(huán)或硫基與Hemin的亞鐵卟啉環(huán)之間，可以通過ππ堆積或配位鍵[19]提高Hemin對底物的親和力，增強其催化功能，能進一步使TMB分子再失去1個電子，反應(yīng)體系由藍綠色變?yōu)辄S色，且顏色變化程度與水胺硫磷濃度成正比，基于此建立裸眼可辨水胺硫磷的檢測方法。

3.2反應(yīng)條件的優(yōu)化

為了提高水胺硫磷的檢測靈敏度，本研究對Hemin、TMB的濃度及pH值等因素進行了考察。實驗選擇450nm作為特征吸收峰。

3.2.1Hemin和TMB濃度對水胺硫磷的檢測影響在不同濃度Hemin和TMB條件下，反應(yīng)體系中加入50μg/L水胺硫磷后的吸光值變化見圖2A，當Hemin、TMB濃度分別為14μmol/L、0.10mmol/L時，其ΔA（450nm）達到最大，因此選擇該濃度作為實驗的最佳條件。

3.2.2不同pH對Hemin催化活性的影響Hemin、TMB濃度分別為14μmol/L、0.10mmol/L的條件下，考察了溶液的pH值對Hemin催化活性的影響。用HCl和NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值，并測定其吸收光譜及在450nm處的吸光值，結(jié)果如圖2B和2C所示。在pH5～7范圍內(nèi)，TMB被催化氧化后，其二苯胺基上的N原子會失去1個電子，溶液呈現(xiàn)藍色。但在pH2～4范圍內(nèi)，反應(yīng)體系的催化活性會進一步增強，導致所有TMB分子中的2個N原子均失去電子，此時溶液的顏色為黃色。然而，當溶液的pH=3.0時，更有利于Hemin催化底物TMB，因此本實驗選擇pH3.0進行測定。

3.3反應(yīng)動力學

根據(jù)酶動力學理論，進一步分析Hemin的催化機理。以H2O2、TMB為底物，研究水胺硫磷加入前后對Hemin催化活性的影響，并得出相應(yīng)的動力學參數(shù)。在圖3A和3B中，通過改變TMB和H2O2濃度得到MichaelisMenten曲線。進一步分析，得其Doublereciprocal曲線（圖3C和3D），由Doublereciprocal方程1/V=Km/（Vm＼[s＼]）+1/Vm得出的MichaelisMenten常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vm）見表1。通過比較不同種類催化劑的動力學參數(shù)，Hemin對TMB和H2O2的Km都高于HRP及Fe3O4，說明其對底物的親和力低于HRP及Fe3O4[21]。從圖3C和3D可見，這些平行線揭示了“乒乓機理”，說明Hemin先催化H2O2產(chǎn)生自由基，后者再與底物TMB反應(yīng)產(chǎn)生顏色信號[20，21]。體系中加入50μg/L水胺硫磷后，Hemin催化TMB的MichaelisMenten曲線見圖3E和3F，作出其Doublereciprocal曲線（圖3G和3H），計算得出的MichaelisMenten常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vm）見表1。

Km值均降低，且Vm也在提高，說明其對底物〖ZH（的親和力都在增加，并加快了反應(yīng)速度，這些結(jié)果表明水胺硫磷能增強Hemin的催化活性。一般酶類物質(zhì)的催化功能與其尺寸效應(yīng)、形貌及表面微環(huán)境等密切有關(guān)[20]。本研究組曾發(fā)現(xiàn)，水胺硫磷中的氨基、芳香環(huán)或硫基與Hemin的亞鐵卟啉環(huán)之間可以通過ππ堆積或配位鍵實現(xiàn)Hemin分子的可控聚集[19]。在本研究中，一定程度聚集的Hemin可能會提供底物更大的接觸面積，增強對底物的親和力，有利于提高其催化活性。根據(jù)〖ZH）Hemin反應(yīng)動力學，進一步證實了本方法的工作原理。

3.4分析應(yīng)用

在優(yōu)化的條件下，加入不同濃度的水胺硫磷（2～100μg/L），并記錄其ΔA（450nm）值隨時間的變化、特定時間下的吸收光譜及ΔA（450nm）值。從圖4A可見，在第4min，當水胺硫磷濃度達到60μg/L時，其ΔA（450nm）值達到最大，且隨著水胺硫磷濃度的增大，ΔA（450nm）值幾乎不再變化，因此本方法選擇反應(yīng)時間為4min。從圖4B和4C可見，隨著水胺硫磷濃度增加，溶液由藍綠色變成黃色，ΔA（450nm）逐漸升高，當水胺硫磷超過60μg/L時，ΔA（450nm）值趨于穩(wěn)定。本方法通過裸眼可辨的檢出限為30μg/L，在低濃度水胺硫磷條件下，ΔA（450nm）與其濃度在2～30μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（圖4C插圖），檢出限（3σ[22，23]）為1.2μg/L，遠低于美國環(huán)保局（US.EPA）和中國農(nóng)業(yè)部制定的農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留最大限量標準（100μg/L）。當水胺硫磷濃度為100μg/L時，反應(yīng)體系顏色變化非常顯著，可通過裸眼快速辨別農(nóng)產(chǎn)品中水胺硫磷農(nóng)藥是否超標。

將本方法用于水胺硫磷的特異性檢測及實際樣品分析，結(jié)果如圖5及表2所示。在圖5中，除含水胺硫磷反應(yīng)體系顏色變成黃色外，其余如辛硫磷、樂果等競爭性有機磷農(nóng)藥的反應(yīng)體系顏色均為藍綠色，且其它有機磷農(nóng)藥的測定值遠低于水胺硫磷，表明本方法可以特異性檢測水胺硫磷。在其它有〖CM（44機磷農(nóng)藥存在時，對應(yīng)的ΔA（450nm）值和同濃度的水胺硫磷幾乎相同，表明其它有機磷農(nóng)藥對水胺〖CM）

4結(jié)論

建立了一種基于增強Hemin催化活性比色檢測水胺硫磷的方法。結(jié)果表明，水胺硫磷能提高Hemin對底物的親和力，增強Hemin的催化活性，加快氧化底物TMB，使得反應(yīng)體系顏色發(fā)生顯著變化，從而實現(xiàn)裸眼可辨水胺硫磷的檢測。本方法裸眼可辨水胺硫磷的檢出限為30μg/L，方法檢出限為1.2μg/L，在實際樣品中對水胺硫磷檢測的加標回收率為93.0%～113.0%，且特異性好，操作便捷，不需要依賴大型儀器，因而可廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中水胺硫磷殘留的檢測。Hemin具有穩(wěn)定性高且價格低廉等優(yōu)勢，有良好的應(yīng)用潛能。

References

1DarkoG，AkotoO.FoodChem.Toxicol.，2008，46：3703-3706

2KumarV，UpadhyayN，KumarV，SharmaS.ArabJ.Chem.，2015，8：624-631

3ZHANGCan，ZHANGJinXing，WANGKun，DAIZhiHui.ActaChim.Sinica，2012，70（8）：1008-1012

張燦，張金星，王坤，戴志暉.化學學報，2012，70（8）：1008-1012

4SunJ，DongT，ZhangY，WangS.Anal.Chim.Acta，2010，666：76-82

5WatanabeE，BabaK，EunH，MiyakeS.FoodChem.，2007，102：745-750

6ZhangC，WangL，TuZ，SunX，HeQ，LeiZ，XuC，LiuY，ZhangX，YangJ，LiuX，XuY.Biosens.Bioelectron.，2014，55：216-219

7WANGLi，YEHua，SANGHongQing，WANGDanDan.ChineseJ.Anal.Chem.，2016，44（5）：799-803

王麗，葉華，桑宏慶，王丹丹.分析化學，2016，44（5）：799-803

8BalaR，KumarM，BansalK，SharmaRK，WangooN.Biosens.Bioelectron.，2016，85：445-449

9ZhangSX，XueSF，DengJ，ZhangM，ShiG，ZhouT.Biosens.Bioelectron.，2016，85：457-463

10ZhengL，PiF，WangY，XuH，ZhangY，SunXJ.Hazard.Mater.，2016，315：11-22

11FuJ，TanXH，LiYH，SongXJ.Chin.Chem.Lett.，2016，27：1541-1546

12SHEnJingCan，WUFengQi，XIAoChenGui，ZHANGYi，HANRuiYANG，HONGXiaoLiu.ChineseJ.Appl.Chem.，2014，31（1）：84-88

沈金燦，吳鳳琪，肖陳貴，張毅，韓瑞陽，洪小柳.應(yīng)用化學，2014，31（1）：84-88

132CHENGHao，GAOXiaoGuang，JIAJian，LIJianPing，HEXiuLi.ChineseJ.Anal.Chem.，2010，38（11）：1683-1686

程浩，高曉光，賈建，李建平，何秀麗.分析化學，2010，38（11）：1683-1686

14MachadoMF，SaraivaJ.J.Mol.Catal.B，2002，19：451-457

15JoEJ，MunH，KimSJ，ShimWB，KimMG.FoodChem.，2016，194：1102-1107

16ChengFF，JiangN，LiX，ZhangL，HuL，ChenX，JiangLP，AbdelHalimES，ZhuJJ.Biosens.Bioelectron.，2016，85：891-896

17ZouP，LiuY，WangH，WuJ，ZhuF，WuH.Biosens.Bioelectron.，2016，79：29-33

18WuY，WangF，ZhanS，LiuL，LuoY，ZhouP.RSCAdv.，2013，3：25614-25619

19ChenH，WuY，YangW，ZhanS，QiuS，ZhouP.Sens.ActuatorB，2017，243：445-453

20GAOLiZeng，YANXiYun.Prog.Biochem.Biophys.，2013，40（10）：892-902

高利增，閻錫蘊.生物化學與生物物理進展，2013，40（10）：892-902

21GaoL，ZhuangJ，NieL，ZhangJ，ZhangY，GuN，WangT，F(xiàn)engJ，YangD，PerrettS，YanX.Nat.Nanotechnol.，2007，2：577-583

22WuY，ZhanS，WangF，HeL，ZhiW，ZhouP.Chem.Commun.，2012，48：4459-4461

23WuY，ZhanS，XuL，ShiW，XiT，ZhanX，ZhouP.Chem.Commun.，2011，47：6027-6029〖KH

AbstractAsimplecolorimetricmethodfordetectionofisocarbophoswasdevelopedbasedontheenhancedperoxidaselikeactivityofhemin.Hemincouldcatalyzetheoxidationofperoxidasesubstrate3，3′，5，5′tetramethylbenzidine（TMB）byH2O2，whichmadeTMBtoloseoneelectronandcausedreactionsolutioncolorchangingfrominitialtransparenttobluegreen.Addingisocarbophosimprovedheminaffinitytosubstrates，whichfurtherenhancedperoxidaselikeactivityofheminandmadeTMBtolosetwoelectrons.ThecolorofTMBsolutionwasfurtherchangedfrombluegreentoyellow，andthedegreeofcolorchangewasproportionaltotheconcentrationofisocarbophos.Undertheoptimalconditions，thepresentanalyticalmethodforisocarbophosdetectionhadadynamicrangefrom2μg/Lto100μg/Lwithadetectionlimitof1.2μg/L（3σ）.Theselectivityassaydemonstratedthatotherorganophosphoruspesticidesexhibitednegligibleinterferencesforisocarbophosdetection.Theapplicationoftheproposedmethodinthepracticalsamplesshowedthatthemeanrecoveryofisocarbophoswasintherangeof94.4%-113.0%，thusitcouldbewidelyappliedtorapidlyandsensitivelydetectisocarbophosintheagriculturalproducts.

KeywordsHemin；Isocarbophos；Peroxidase；Organophosphoruspesticides

（Received30November2016；accepted3January2017）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（Nos.21565009，21205020）.