超高效液相色譜串聯質譜法同時測定茶葉中11種植物生長調節(jié)劑及吡蟲啉、啶蟲脒的殘留

諸力+王晨+陳紅平+張穎彬+周蘇娟+王國慶+劉新

摘要建立了超高效液相色譜串聯質譜法同時快速測定茶葉中11種植物生長調節(jié)劑（PGRs）及吡蟲啉、啶蟲脒的方法。樣品經乙腈甲酸溶液（99〖KG-3∶〖KG-51，V/V）均質提取，采用C18、強陰離子交換劑（SAX）、N丙基乙二胺（PSA）和無水MgSO4混合吸附劑分散萃取處理，以HSST3色譜柱分離，采用電噴霧（ESI）正負離子同時掃描和可編程多反應監(jiān)測模式（SMRM）檢測，基質匹配溶液外標法定量。6芐氨基嘌呤、多效唑、烯效唑、氯吡脲、甲哌啶、吡蟲啉、啶蟲脒在1～200μg/L和2，4二氯苯氧乙酸、對氯苯氧乙酸、赤霉素、吲哚乙酸、萘乙酸、吲哚丁酸在5～1000μg/L范圍內線性良好（R2>0.99）。13種化合物加標回收率在73.1%～108.9%之間，RSD（n=6）值在0.6%～8.0%之間，方法檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分別為0.18～9.68μg/kg和0.61～32.26μg/kg。本方法簡便、穩(wěn)定、靈敏，能夠滿足實際檢測需求。

關鍵詞茶葉；植物生長調節(jié)劑；吡蟲啉；啶蟲脒；超高效液相色譜串聯質譜；分散固相萃取

1引言

植物生長調節(jié)劑（Plantgrowthregulators，PGRs）是一類與植物激素具有相似生理和生物學效應的農藥（來源包括人工合成及生物中提?。?，自20世紀30年代以來，因其效用高、用量小、殘毒少等特點，廣泛應用于果蔬、茶葉等農業(yè)生產領域，如赤霉素[1]、吲哚丁酸[2]、奈乙酸[3]等可通過改變茶樹體內的生物合成、運轉和分布，調節(jié)新梢生理過程，并促進茶樹早發(fā)、多發(fā)，提高產量及品質。吡蟲啉和啶蟲脒屬于煙堿類新型廣譜殺蟲劑，在茶園中應用也十分普遍[4，5]。然而隨著植物生長調節(jié)劑和煙堿類農藥用量增多及使用范圍日益擴大，其安全性也備受關注。研究表明，2赤霉素可能增加腫瘤形成風險[6]，吲哚乙酸可影響心肌功能[7]，2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）具有生殖毒性[8]，多效唑存在致畸作用[9]。因此，歐盟、日本、中國等建立了PGRs和煙堿類農藥相關限量標準，如歐盟規(guī)定2，4D在藍莓、茶葉中的最高殘留限量值（MRL）為0.1mg/kg；日本規(guī)定赤霉素在檸檬等果蔬中的MRL為0.2mg/kg；我國GB27632014中規(guī)定氯吡脲在葡萄中的MRL為0.05mg/kg，吡蟲啉在茶葉中的MRL為0.5mg/kg[10]等。

目前，植物生長調節(jié)劑和煙堿類農藥主要檢測方法包括色譜法[11～13]、色譜質譜法[14～19]等，但絕大部分方法都需要經過傳統(tǒng)固相萃取、濃縮、衍生等前處理步驟，存在操作程序繁瑣、污染嚴重、抗干擾差等缺點。前處理作為關鍵技術，2會直接影響方法靈敏度和精密度。茶葉具有典型基質效應，一般方法很難直接適用，迄今尚未發(fā)現同時測定茶葉中多PGRs及煙堿類農藥殘留相關研究報道。本研究采用分散固相萃取前處理方法，省去濃縮、固相小柱萃取等步驟，建立了超高效液相色譜串聯質譜法同時快速測定茶葉中11種植物生長調節(jié)劑及吡蟲啉、啶蟲脒的方法，本法靈敏、簡便、高效，可滿足茶葉質量監(jiān)測需求。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

ABSciexTQ5500型串聯三重四極桿質譜儀（美國Sciex公司）；LC30A超高效液相色譜儀（日本島津公司）；MillQ去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）；T10高速均質儀（德國IKA公司）；高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

11種PGRs及2種煙堿類農藥標準樣品：6芐氨基嘌呤（6Benzylaminopurine，6BA）、多效唑（Paclobutrazol）、烯效唑（Uniconazole）、氯吡脲（Forchlorfenuron）、甲哌啶（Mepiquatchloride）、吡蟲啉（Imidacloprid）、啶蟲脒（Acetamiprid）、2，4二氯苯氧乙酸（2，4Dichlorophenoxyaceticacid，2，4D）、對氯苯氧乙酸（4Chlorophenoxyaceticacid，4CPA）、赤霉素（Gibberellicacid，GA3）、吲哚乙酸（Indole3aceticacid，IAA）、萘乙酸（1Naphthaleneaceticacid，1NAA）、吲哚丁酸（Indole3butyricacid，IBA）（純度≥95.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，TEDIA公司）；甲酸銨（99.9%）、甲酸（95%）（德國Sigma公司）；N丙基乙二胺（PSA）、強陰離子交換劑（SAX）、強陽離子交換劑（SCX，美國安捷倫科技有限公司）；C18、石墨化碳黑（GCB）、無水MgSO4、弗羅里硅土（天津博納艾爾杰公司）。

茶葉樣品購于浙江省各大茶葉市場。

2.2色譜和質譜條件

WatersHSST3色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；流動相A：1mmol/L甲酸銨水溶液，流動相B：1mmol/L甲酸銨甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～1min，10%B；1～2min，10%～70%B；2～6min，70%～98%B；6～8min，98%B；8～8.1min，98%～10%B；8.1～12min，10%B。流速：0.25mL/min；進樣量：1.0μL；柱溫：40℃；運行時間：12min。

離子源：電噴霧離子源（ESI），溫度500℃，電壓5500V（ESI+）/ 4500V（ESI ）；霧化氣（GS1）壓力：334.7kPa；輔助氣（GS2）壓力：334.7kPa；氣簾氣（CurtianGas）壓力：241.3kPa。定性與定量離子對、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數見表1。

2.3樣品制備

茶葉樣品粉碎后過200μm篩，稱取2.0g（精確至0.01g）試樣于50mL離心管中，加入乙腈甲酸溶液（99〖KG-3∶〖KG-51，V/V）10mL，渦旋振蕩1min，18000r/min均質提取2min，10000r/min低溫離心10min（5℃），取上清液1mL至裝有100mgC18，50mgSAX，25mgPSA和50mg無水MgSO4吸附劑的2mL離心管中，渦旋1min，10000r/min離心5min，上清液過0.22μm濾膜，待液相色譜串聯質譜分析。

2.4標準曲線制作

分別稱取13種化合物標準品各0.05g，用甲醇溶解并定容至50mL，分別配制成1000mg/L標準溶液，4℃保存，待用。

標準曲線的配制：茶葉空白樣品按2.3節(jié)處理后，得到空白提取液，分別配制8個不同濃度（ESI+：1，2，5，10，20，50，100和200μg/L，ESI-：5，10，25，50，100，250，500和1000μg/L）混合基質標準溶液，現配現用。

3結果與討論

3.1質譜和色譜條件優(yōu)化

分別配制0.5mg/L濃度13種化合物溶劑標樣進行質譜條件優(yōu)化。采用ESI+和ESI-掃描模式，分別選擇各準分子離子＼[M+H＼]+和＼[M-H＼]-為母離子，進行二級質譜優(yōu)化，參數包括碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）、電離溫度等，優(yōu)化結果詳見表1。采用可編程多反應監(jiān)測（Scheduledmultiplereactionmonitoring，SMRM），可以在不同時間段同時進行多種農藥殘留檢測，較傳統(tǒng)MRM相比，極大提高了單位檢測通量，可有效改善峰型，提高精密度和重現性[20]。

使用HSST3、BEHC18和BEHC8色譜柱進行色譜條件優(yōu)化，發(fā)現GA3、IAA等有機酸在HSST3柱上保留色譜峰型及分離度更佳。考察了包括甲醇水、乙腈水、甲醇水（0.1%甲酸和1mmol/L甲酸銨）、甲醇水（1mmol/L甲酸銨）在內的流動相。結果表明，采用甲醇水（0.1%甲酸和1mmol/L甲酸銨）作為流動相，雖然可提高＼[M+H＼]+化合物離子化效率，但甲酸中H+會降低＼[M-H＼]-化合物靈敏度。緩沖體系可進一步增加系統(tǒng)穩(wěn)定性，從而使13種化合物分離度和靈敏度達到最佳，故流動相采用甲醇〖CM（44水（1mmol/L甲酸銨）。圖1為空白茶樣和加標茶樣中13種化合物二級質譜總離子流色譜圖，可見其〖CM）

分離效果良好，目標化合物出峰段雜質干擾較小。

3.2前處理條件優(yōu)化

由于植物生長調劑種類繁多，化合物結構特性差異較大，通常采用乙腈、甲醇或其含甲酸[13，14，22]（乙酸）溶液等進行提取。本研究考察了純乙腈、乙腈水（80〖KG-3∶〖KG-520，V/V）、乙腈甲酸溶液（99〖KG-3∶〖KG-51，V/V）、乙腈/水/甲酸溶液（80〖KG-3∶〖KG-519〖KG-3∶〖KG-51，V/V）的提取效率。結果表明，采用乙腈水甲酸溶液（80〖KG-3∶〖KG-519〖KG-3∶〖KG-51，V/V）提取時，部分化合物回收率略優(yōu)于乙腈甲酸溶液（99〖KG-3∶〖KG-51，V/V），但同時會對絕大部分化合物，尤其是GA3和4CPA，產生較強基質效應（Matrixeffect，Me），導致質譜信號嚴重降低，信噪比減小，影響其檢出限。原因可能是使用含水的乙腈溶劑提取時，茶葉中強極性雜質共溶出，導致各化合物結構改變或離子化效率降低。在提取過程中添加適量甲酸可增加2，4D、4CPA等含羧基酸性PGRs提取效率，并且有效降低凈化過程中此類化合物被吸附率[21]，同時可防止GA3等在堿性環(huán)境中降解。因此本研究選擇乙腈甲酸溶液（99〖KG-3∶〖KG-51，V/V）作為提取劑。

對于凈化吸附劑選擇，分別稱取25、50、100和200mg的7種吸附劑（PSA、SAX、SCX、C18、GCB、無水MgSO4、弗羅里硅土），各加入1mL濃度為80μg/L（ESI+）、400（ESI-）μg/L基質混合標準溶液。凈化效果用R值表示，R=〖SX（S〖S0〖SX）×100%，其中S0為凈化前基質標樣峰面積，S為凈化后基質標樣峰面積。R值越高，表示經凈化后化合物信號越強，被吸附率越低，凈化效果越理想。實驗結果表明，C18和無水MgSO4吸附作用不明顯，其它5種吸附劑對目標化合物吸附作用隨用量增加而增強。其中SCX、GCB和弗羅里硅土對多種化合物有較強吸附作用，如25mgSCX吸附后，6BA和氯吡脲R值分別為0.7%和2.6%；50mgGCB吸附后6BA和4CPA的R值分別為18.6%和56.4%等。如圖2所示，PSA和SAX在低用量時R值較高，隨用量增加R值下降，25mgPSA和50mgSAX吸附后各化合物R值范圍分別為82.3%～171.2%和93.5%～194.8%，凈化效果良好。

SAX是一種以高純球形硅膠鍵合季胺基團的吸附劑，常用于去除強陰離子雜質（如有機酸，無機離子等），PSA（N丙基乙二胺）為弱陰離子交換劑，可有效去除茶葉中色素、脂肪酸等雜質，但當兩者用量提高時，對目標化合物吸附作用明顯，如200mgPSA吸附后，2，4D的R值僅為23.8%，與文獻＼[22＼]的結果相符。C18具有強疏水特性，對脂肪酸等弱極性化合物具有較強吸附作用。綜合比較，本研究選擇100mgC18、50mgSAX、25mgPSA和50mg無水MgSO4作為吸附劑，凈化效果最佳。

3.3方法的線性范圍、檢出限和定量限

采用2.4節(jié)制備的各濃度基質混合標準溶液，按優(yōu)化后參數測定，以各定量離子對峰面積對應濃度做標準曲線，得到13種化合物線性方程及其相關系數，如表2所示。6BA、多效唑、烯效唑、氯吡脲、甲哌啶、吡蟲啉、啶蟲脒在1～200μg/L和2，4D、4CPA、GA3、IAA、1NAA、IBA在5～1000μg/L范圍內線性關系良好（R2>0.99）。方法檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分別為0.18～9.68μg/kg和0.61～32.26μg/kg。

3.4基質效應

根據相應濃度甲醇溶劑標準樣品進行基質效應評價[23]，計算公式為Me=〖SX（kmethanol-kmatrix〖kmethanol〖SX）×100%（k為標準曲線斜率）。結果表明，13種化合物基質效應范圍在 49.5%～56.2%之間。為消除基質效應干擾，實驗采用相應基質匹配標樣進行校準。

3.5回收率和精密度

稱取茶葉2.0g，分別添加0.02，0.08和0.2mg/kg（ESI+）和0.1，0.4和1.0mg/kg（ESI-）度的混合標準溶液，按照前述方法處理，平行測定6次，回收率和精密度數據見表3。由表3可見，13種化合物加標回收率范圍在73.1%～108.9%之間，RSD（n=6）在0.6%～8.0%之間，表明本方法重復性良好。

虛線上方化合物添標濃度由（+）表示；虛線下方化合物添標濃度由（-）表示（Spikedlevelofcompoundsabovethedottedlinerepresentwith（+）andtheothersrepresentwith（-））。[BG）W][HT5][HJ]

3.6實際樣品分析

采用本方法分析了市售69份茶葉樣品，所有茶樣均未檢出PGRs，其中11份檢出吡蟲啉（0.023～0.612mg/kg，1份超過GB2763最大殘留限量0.5mg/kg），13份檢出啶蟲脒（0.014～0.831mg/kg）。原因可能是測試茶樣多為夏秋季采收，其經濟價值較低，且病蟲害嚴重，因此為降低成本，PGRs用量減少，而殺蟲劑用量增加。

4結論

本研究建立了適用于茶葉中11種PGRs及吡蟲啉、啶蟲脒測定的超高效液相色譜串聯質譜檢測方法。本方法簡便快捷，靈敏度高，重現性好，可滿足歐盟、日本等國對茶葉中PGRs等農藥的限量要求，為我國茶葉行業(yè)制定相關檢測標準提供了理論依據。

References

1ChenHP，LiuX，YangD，YinP.FoodChem.，2013，138（2）：976-981

2PaulA，LalL，AhujaPS，KumarS.Mol.Bio.Rep.，2012，39（11）：3485-3490

3JalaA，HankamolsiriW.ActaHortic.，2014，1023：233-240

4ZhangYY，LuHY，WangB，ZhangZ，LinXR，ChenZZ，LiB.Int.J.FoodSci.Tech.，2015，50（6）：1397-1404

5HouRY，JiaoWT，QianXS，WangXH，XiaoY，WanXC.J.Agr.FoodChem.，2013，61（51）：12565-12571

6ErinN，AfacanB，ErsoyY.Toxicology，2008，254（12）：75-81

7TuluceY，CelikI.AsianJ.Chem.，2006，18（1）：528-532

8LeeKJ，JohnsonV，BlakleyB.Toxicology，2001，165（1）：39-49

9WangKS，LuCY，ChangSH.J.Hazard.Mater.，2011，190：520-528

10GB27632014，NationalFoodSafetyStandardMaximumResidueLimitsforPesticidesinFood.NationalStandardsofthePeople′sRepublicofChina

食品中國家安全標準食品中農藥最大殘留限量.中華人民共和國國家標準.GB27632014

11VogelA.Bull.Environ.Contam.Toxicol.，1998，60（3）：371-378

12WangMY，ChangXC，WuXY，YanHY，QiaoFX.J.Chromatogr.A，2016，1458：9-17

13LiGL，LiuSC，SunZW，XiaL，ChenG，YouJM.FoodChem.，2015，170：123-130

14WUPingGu，TANYing，ZHANGJing，WANGLiYuan，TANGYun，JIANGWei，PANXiaoDong，MABingJie，NIZhuNan，WANGTianJiao.ChineseJ.AnalChem.，2014，42（6）：866-871

吳平谷，譚瑩，張晶，王立媛，湯鋆，姜維，潘曉東，馬冰潔，倪竹南，王天嬌.分析化學，2014，42（6）：866-871

15LIUJingJing，GONGPing，ZHANGXiaoMei，WANGJianHua，WANGJingTang.ChineseJournalofChromatography，2012，30（10）：1012-1016

劉靖靖，宮萍，張曉梅，王建華，王境堂.色譜，2012，30（10）：1012-1016

16MOUYanLi，GUODeHua，DINGZhuoPing，YIXiongHai.ChineseJ.Anal.Chem.，2013，41（11）：1640-1646

牟艷莉，郭德華，丁卓平，伊雄海.分析化學，2013，41（11）：1640-1646

17HauJ，RiedikerS，VargaN，StadlerRH.J.Chromatogr.A，2000，878（1）：77-86

18CAIYiPing，SUNZhiWei，WANGXiaoYan，SUOYouRui，YOUJinMao.ChineseJ.Anal.Chem.，2015，43（3）：419-423

蔡軼平，孫志偉，王小艷，索有瑞，尤進茂.分析化學，2015，43（3）：419-423

19KimKG，ParkDW，KangGR，KimTS，YangYS，MoonSJ，ChoiEA，HaDR，KimES，ChoBS.FoodChem.，2016，208：239-244

20HangK，WongJW，YangP，HaywardDG，SakumaT，ZouYY，SchreiberA，BortonC，NguyenTV，KaushikB，OulkarD.Anal.Chem.，2012，84（13）：5677-5684

21WiestL，BuleteA，GiroudB，FrattaC，AmicS，LambertO，PouliquenH，ArnaudguilhemC.J.Chromatogr.A，2011，1218（34）：5743-5756

22JIANGZhenHui，ZHAWuLa，YINGTieJin.J.Chin.Inst.FoodSci.Tech.，2015，15（11）：192-198

蔣振暉，扎烏拉，應鐵進.中國食品學報，2015，15（11）：192-198

23KittlausS，SchimankeJ，KempeG，SpeerK.J.Chromatogr.A，2011，1218（46）：8399～8410

AbstractAnefficientmethodfortheanalysisofmulticlassplantgrowthregulatorsandpesticide（imidacloprid，acetamiprid）residuesinteawasdevelopedbasedonultraperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry（UPLCMS/MS）.Thesampleswereextractedwithacetonitrile/formicacid（99〖KG-3∶〖KG-51，V/V）solution，cleanedupwithfoursorbentsincludingC18，stronganionexchanger（SAX），primarysecondaryamine（PSA）andanhydrousMgSO4.ThecompoundswereseparatedonaHSST3columnunderpositive/negativeelectrosprayionizationmode，detectedbyscheduledmultiplereactionmonitoring（SMRM），andquantifiedbymatrixmatchedexternalstandardcurves.Allpesticideresiduesshowedgoodlinearityintheconcentrationrangeof1-200μg/L（6benzylaminopurine，paclobutrazol，uniconazole，forchlorfenuron，mepiquatchloride，imidacloprid，acetamiprid）or5-1000μg/L（2，4dichlorophenoxyaceticacid，4chlorophenoxyaceticacid，indole3aceticacid，gibberellicacid，1naphthaleneaceticacid，indole3butyricacid），withcorrelationcoefficient（R2≥0.99）.Limitsofdetection（LOD，S/N=3）andlimitsofquantitation（LOQ，S/N=10）were0.18-9.68μg/kgand0.61-32.26μg/kg，respectively.Inaddition，thespikedrecoveriesofteasampleswere73.1%-108.9%，andRSDswere0.6%-8.0%.Thismethodwasappliedtocommercialsamples，andallthedetectionswereconfirmedbyacquiringtransitionsforeachpesticideinthesamples.

KeywordsTea；Plantgrowthregulator；Imidacloprid；Acetamiprid；Ultraperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry；Dispersivesolidphaseextraction

（Received4November2016；accepted20February2017）