多發(fā)性硬化動物模型研究進(jìn)展

彭 真，張禮標(biāo)，吳 潔，孫云霄*

(1.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微基因藥物實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210009；2.廣東省生物資源應(yīng)用研究所/廣東省動物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510260)

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多發(fā)性硬化動物模型研究進(jìn)展

彭 真1,2，張禮標(biāo)2，吳 潔1*，孫云霄2*

(1.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微基因藥物實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210009；2.廣東省生物資源應(yīng)用研究所/廣東省動物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510260)

多發(fā)性硬化(MS)是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，為臨床神經(jīng)系統(tǒng)的疑難重病，對其病理過程、發(fā)病機(jī)制的研究以及治療藥物的篩選和評價(jià)都需要合適的動物模型。論文從實(shí)驗(yàn)動物選擇、幾種重要的誘導(dǎo)方法及模型的行為學(xué)、影像學(xué)及病理評價(jià)等多方面對MS動物模型研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。

多發(fā)性硬化；中樞神經(jīng)系統(tǒng)；免疫；動物模型

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)自身免疫性疾病，表現(xiàn)為局灶性炎性浸潤(視神經(jīng)、腦、脊髓)、脫髓鞘以及軸突損傷、膠質(zhì)增生等，臨床癥狀和病理特征極其易變。在歐美，MS是造成青壯年非創(chuàng)傷性殘疾的主要原因，近年來發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢，我國北方患者多于南方，以20歲～40歲居多，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量，同時(shí)也帶來了巨大的社會經(jīng)濟(jì)影響，目前仍無法治愈。

MS涉及兩種最復(fù)雜的生物學(xué)系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)和CNS以及二者之間復(fù)雜的相互作用[1]，目前普遍認(rèn)為是一種由髓鞘特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性脫髓鞘疾病，雖然已經(jīng)提出了幾個(gè)發(fā)揮核心作用的遺傳和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素，特異性致病機(jī)制仍未確定。

由于MS患者神經(jīng)組織取樣的局限性，實(shí)驗(yàn)動物在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中常常作為人類的“替身”來完成各種試驗(yàn)，包括疾病的發(fā)病機(jī)制研究、藥物的安全性及藥效評價(jià)等。本文就不同MS動物模型的誘導(dǎo)及模型評估等研究進(jìn)展進(jìn)行介紹，不同動物及不同誘導(dǎo)方法制備的MS模型可以從不同角度增進(jìn)人們對MS致病機(jī)制的了解，通過動物模型可以探索MS的發(fā)生和發(fā)展，篩選新的治療藥物。

1 病毒模型

與遺傳因素相比，環(huán)境因素可能在MS的病因中扮演著更加重要的角色，流行病學(xué)研究表明，病毒是重要的MS外部致病因素[2]。人皰疹病毒6型(Human hgerpesvirus 6,HHV-6)[3]、EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)[4]和巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)[5]都與MS密切相關(guān)。

小鼠Theiler＇s腦脊髓炎病毒[6](Theiler＇s murine encephalomyelitis virus,TMEV)是無囊膜、正單鏈RNA病毒，與實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)相反，TMEV感染軸索損傷先于脫髓鞘(由內(nèi)向外)，誘發(fā)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)入CNS，導(dǎo)致髓鞘損傷，一般模擬慢性-漸進(jìn)型MS，通常首次接種數(shù)月后才表現(xiàn)出行為癥狀，且各項(xiàng)指標(biāo)與人類MS均十分相似，比EAE模型更接近臨床。此外，塞姆利基森林病毒[6]、鼠肝炎病毒[7]、犬瘟熱病毒[8]、維斯納病毒[9]等都能誘發(fā)MS模型，誘導(dǎo)CNS髓鞘損傷。病毒模型對實(shí)驗(yàn)室條件要求極高，目前尚只能在小鼠中誘導(dǎo)，國內(nèi)該模型使用較少。

2 化學(xué)毒素模型

化學(xué)毒素誘導(dǎo)模型與其他模型相比并沒有表現(xiàn)出MS臨床癥狀，主要適合髓鞘脫失和再生機(jī)制的研究。常用的有3種試劑，即雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone)、溴化乙錠(ethidium bromide,EB)和溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine,LPC)。雙環(huán)己酮草酰二腙是一種銅離子螯合劑，可導(dǎo)致線粒體復(fù)合物Ⅳ功能紊亂，對CNS少突膠質(zhì)細(xì)胞有選擇性毒性，喂食雙環(huán)己酮草酰二腙的小鼠發(fā)生慢性脫髓鞘，正常飲食后髓鞘恢復(fù)再生[10]。EB能破壞少突膠質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)構(gòu)，引發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞死亡最終導(dǎo)致脫髓鞘[11]。LPC是磷脂酶A2激活劑，在CNS中能誘導(dǎo)急性、可再生性脫髓鞘，對鄰近細(xì)胞和軸索沒有損傷[12]。

近年來，誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的遺傳手段也用于研究脫髓鞘和髓鞘再生[13-14]，使自殺基因在少突膠質(zhì)細(xì)胞中選擇性表達(dá)，注射誘導(dǎo)劑(如白喉毒素A)可誘導(dǎo)其凋亡。該方法雖處于初期階段，但如果可以啟動免疫系統(tǒng)識別髓鞘抗原，將是一次重大革新。

3 EAE模型

EAE模型是目前最常用的MS動物模型，髓鞘自身抗原特異性激活腦部輔助T細(xì)胞，使CNS發(fā)生炎性浸潤，髓鞘脫失。EAE動物可發(fā)生白質(zhì)和深灰質(zhì)脫髓鞘，生化、免疫及病理特征都與MS非常相似，因此被普遍用于MS的致病機(jī)制及臨床前研究[15-16]。國際上將EAE按臨床病程分為4種類型[15]，即急性單項(xiàng)型(acute monophasic,AM)、復(fù)發(fā)緩解型(relapsing remitting,RR)、慢性進(jìn)展型(chronic progressive,CP)、遷延復(fù)發(fā)型(progressive relapsing,PR)。

3.1 自身抗原誘導(dǎo)的EAE模型-經(jīng)典MS模型

Rivers T M等[17]首次用兔腦提取液免疫猴子，致急性播散性腦脊髓炎，后來多用同源猴腦白質(zhì)勻漿，由于勻漿抗原成分復(fù)雜，限制了細(xì)胞分子水平的研究，目前常用的自身致敏物質(zhì)[18]包括髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(proteolipid protein,PLP)、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)以及一些合成的多肽序列如rhMOG1-125[19]和MOG35-55[20]肽段，新型免疫原如神經(jīng)束蛋白NF155、NF186[21]、暫時(shí)性軸索膜糖蛋TAG-1[22]和其他一些完全非髓鞘抗原成分也不斷被人們發(fā)現(xiàn)。

免疫誘導(dǎo)EAE模型涉及多種復(fù)雜因素，必須正確選擇實(shí)驗(yàn)動物和免疫原，合理選擇免疫劑量和方式，正確處理其他因素如佐劑、給藥間隔時(shí)間、實(shí)驗(yàn)操作等。

3.1.1 動物品系、年齡和性別 嚙齒類是臨床前研究的常用模型，研究背景清楚且價(jià)廉易得，以Lewis、SD大鼠、SJL/J、C57/BL6小鼠等應(yīng)用最為廣泛，大鼠較小鼠敏感性高，發(fā)病率高，穩(wěn)定性好，尤其Lewis大鼠最為敏感，但小鼠病理特征與人MS更相似[23]。

常用于EAE研究的非人靈長類動物(Non-huamn primate,NHP)有恒河猴(Macacamulatta)、食蟹猴(Macacafascicularis)和普通狨猴(Callithrixjacchus)[24]。普通絨猴是最小的新世界靈長類動物，繁殖率高，同人有相似的疾病易感度，且與人細(xì)胞因子或激素有交叉反應(yīng)性[25]，在自身免疫性疾病、神經(jīng)科學(xué)等研究領(lǐng)域都是理想的動物模型。目前國外多用普通狨猴做EAE模型，已開發(fā)了具有種系傳遞性的轉(zhuǎn)基因狨猴，但狨猴價(jià)格昂貴，對外界環(huán)境異常敏感。獼猴屬(Macaca)與人類基因同源性高達(dá)97%[26]，早在20世紀(jì)初國際研究工作者就將恒河猴作為MS模型[17]，印度等國禁止恒河猴出口后便難以滿足實(shí)驗(yàn)需求，同屬獼猴屬的食蟹猴由于個(gè)體小，繁殖周期短，性格溫順，飼養(yǎng)成本低，易操作，節(jié)約供試品等優(yōu)點(diǎn)，有望取代恒河猴成為更有前景的實(shí)驗(yàn)動物模型。我國在食蟹猴研究領(lǐng)域已處于國際領(lǐng)先地位，食蟹猴基因組測序已由華大基因主導(dǎo)完成[26]，各種MRI技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、胚胎干細(xì)胞技術(shù)和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞技術(shù)也取得了顯著進(jìn)展，黃行許等采用最先進(jìn)的TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)對食蟹猴基因組進(jìn)行精確編輯成功構(gòu)建出基因工程猴[27-28]。

幼齡動物比成年動物病程短，發(fā)病較快但病理檢測不明顯，因此多選用中青年動物。多數(shù)情況下，雌性動物較雄性敏感，臨床癥狀相對嚴(yán)重，有研究發(fā)現(xiàn)MOG免疫C57BL/6小鼠和食蟹猴時(shí)，雌雄無顯著差異[29,19]。

3.1.2 免疫原 不同抗原誘發(fā)不同的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，模擬不同的EAE動物模型亞型，用于研究不同的MS致病機(jī)制、臨床表現(xiàn)及治療效果。MBP免疫Lewis大鼠誘發(fā)AM-EAE，此模型病程短，炎癥反應(yīng)明顯，以急性腦脊髓炎病變?yōu)橹?，脫髓鞘不明顯，可完全恢復(fù)；PLP139-151致敏SJL/J小鼠建立RR-EAE模型；MOG或MOG35-55肽段免疫C57/BL6小鼠建立的不可逆CP-EAE模型是優(yōu)秀的MS模型，脫髓鞘和軸突損傷明顯，炎癥反應(yīng)輕；用同源猴腦白質(zhì)勻漿致敏的食蟹猴EAE模型包括AM型、RR型、CP型。

抗原劑量與發(fā)病率和病程密切相關(guān)，小劑量多次比單次大劑量免疫效果好，李康寧等[30]用不同劑量MOG35-55多肽皮下注射誘導(dǎo)C57BL/6小鼠EAE，發(fā)現(xiàn)小劑量組在神經(jīng)功能評分及病理學(xué)改變等方面均更明顯。

3.1.3 免疫方式和佐劑 皮下及肌肉注射不易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生耐受，注射部位有腳墊、尾部、背部、股腹溝、腋窩等。伴隨腹腔注射百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)破環(huán)血腦屏障促進(jìn)反應(yīng)性T細(xì)胞遷入CNS，并分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，已被廣泛用于EAE模型建立。佐劑是誘發(fā)EAE所必需的，抗原用PBS稀釋后與等體積弗氏佐劑混合，制成抗原乳劑，常用完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)增強(qiáng)免疫原性，由于CFA含細(xì)菌抗原，歪曲細(xì)胞免疫應(yīng)答，甚至導(dǎo)致皮膚局部壞死和肉芽腫，在科學(xué)界已引起廣泛爭議。Jagessar等證明用MOG34-56加不完全弗氏佐劑(incomplete Freund's adjuvant, IFA)免疫狨猴能像MOG34-56/CFA一樣，誘發(fā)臨床顯著的EAE[31]。佐劑與抗原乳化的過程也直接影響模型的建立，白色黏稠狀、高度分散的液體抗原易被吞噬和遞呈。

3.2 自發(fā)性EAE模型-自身免疫性觸發(fā)模型

臨床治療的高失敗率表明EAE動物模型與人仍存在差距，主要原因：人工誘導(dǎo)髓鞘特異性免疫應(yīng)答不能模擬MS的自發(fā)性，可能會錯(cuò)過MS的關(guān)鍵致病機(jī)制；大多數(shù)形式的EAE模型是通過免疫療法誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生，而在MS致病機(jī)制中CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞也發(fā)揮重要作用[32]。轉(zhuǎn)基因小鼠大多攜帶特異性T細(xì)胞受體過表達(dá)基因如HLA-DR2(DRB1*1501,DRB5*0101), DR4 (DRB1*0401), DQB1*0602, DRB1*1501等[33-34]，特異性肽段免疫即可發(fā)展為與人MS相似的疾病[18,35](表1)，B細(xì)胞在自發(fā)性EAE中扮演重要角色，研究表明早期誘導(dǎo)B細(xì)胞凋亡可保護(hù)這些轉(zhuǎn)基因小鼠遠(yuǎn)離自發(fā)性EAE[36]。

表1 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

4 MS模型臨床評估

神經(jīng)功能損傷的客觀科學(xué)評價(jià)是觀察模型制備成功與否的重要指標(biāo)，采用兩人雙盲法以半定量標(biāo)準(zhǔn)[37]進(jìn)行評分，NHP還需參照眼瞼反射、抓握力度、是否發(fā)生自傷行為等進(jìn)行更細(xì)致的評估。

MRI影像學(xué)在顯示MS特異性征象，確定腦部病變的大小及空間分布，病程監(jiān)測及判斷預(yù)后等方面發(fā)揮重要作用，采用自旋回波(SE)或快速自旋回波(FSE)序列，常規(guī)行橫軸位、矢狀位及冠狀位掃描。由于各研究團(tuán)隊(duì)所用設(shè)備、序列、參數(shù)等不同，使得文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論不盡一致，在研究中應(yīng)注意各檢測指標(biāo)的優(yōu)化。

組織病理學(xué)檢測、免疫學(xué)分析是研究模型病理特征、免疫機(jī)制和疾病標(biāo)志物的重要手段，HE染色法觀察炎性細(xì)胞浸潤，快藍(lán)( luxol fast blue,LFB) 染色觀察髓鞘脫失，改良Bielschowsky法觀察軸突病變，組織切片免疫組化檢測T細(xì)胞、NK細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞分布，ELISA分析各類細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-17、IFN-γ等)，流式細(xì)胞術(shù)鑒定各類免疫細(xì)胞(CD4+T、CD8+T、Th1、Th17、Treg、B細(xì)胞)。

5 結(jié)語

MS是一個(gè)復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，在遺傳基礎(chǔ)、環(huán)境因素、臨床病程、病理反應(yīng)等方面均表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性，不同的動物品系、免疫原和誘導(dǎo)手段可建立不同的動物模型，發(fā)病機(jī)制也有所不同。

本文總結(jié)歸納了幾種典型的MS動物模型，病毒模型比EAE模型更接近臨床，但對實(shí)驗(yàn)室條件要求極高；化學(xué)毒素模型側(cè)重于髓鞘脫失和再生研究；EAE模型常用自交、無特異性致病原菌株的嚙齒類動物，盡管嚙齒類EAE模型闡明了免疫致病機(jī)制，但是否將它們作為治療型動物模型一直以來備受爭議，很多治療手段用于嚙齒類EAE模型時(shí)效果顯著，但臨床評估卻效果不佳甚至產(chǎn)生不利影響，如抗CD40單克隆抗體[38]和抗IL-12/23p40單克隆抗體[39-40]。

非人靈長類動物比嚙齒類更接近人遺傳背景，病理特征、免疫機(jī)制和疾病標(biāo)志物等方面都和人類最為接近，有助于剖析潛在致病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的MS治療靶標(biāo)?！叭嗽椿毙∈筮M(jìn)一步拉近了小鼠模型與人的距離，小鼠攜帶人的功能基因、細(xì)胞或組織，盡管很難將人免疫系統(tǒng)分子引入小鼠蛋白質(zhì)組學(xué)中，但該模型在闡明MS病理和治療特異性方面有很大的前景。此外，神經(jīng)-眼科學(xué)的深入研究使視覺系統(tǒng)有望成為量化軸突完整性和髓鞘修復(fù)有效模型[41]。理想的動物模型應(yīng)該能模擬人MS的所有特征，目前的模型仍不是非常準(zhǔn)確，需要進(jìn)一步改進(jìn)，更好的反映疾病的致病機(jī)制和異質(zhì)性。

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Progress on Animal Model for Multiple Sclerosis

PENG Zhen1,2,ZHANG Li-biao2,WU Jie1,SUN Yun-xiao2

(1.MinigenePharmacyLab,SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,Jiangsu,210009,China; 2.GuangdongKeyLaboratoryofAnimalConservationandResourceUtilization/GuangdongPublicLaboratoryofWildAnimalConservationandUtilization/GuangdongInstituteofAppliedBiologicalResources,Guangzhou,Guangdong,510260,China)

Multiple sclerosis(MS) is a chronic autoimmune disease in the central nervous system,and a difficult case in clinical nervous system. Appropriate animal models play a key role for the research of the pathological process and mechanisms,drug screening and evaluation.In this review,we reviewed the progress on MS models from animal selection, induction methods and the evaluation of the behavior, imaging and pathological aspects.

Multiple sclerosis;central nervous system;immunity;animal model

2016-09-22

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B060300026，2016A030303037)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102358)

彭 真(1991-)，女，河南駐馬店人，碩士研究生，主要從事微生物與生化藥學(xué)研究。

S852.34

A

1007-5038(2017)04-0108-05

*通訊作者