剛地弓形蟲棒狀體蛋白18及其作為基因工程疫苗候選分子研究進(jìn)展

劉榮榮，張曉磊，張進(jìn)順

(河北北方學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)研究所，河北張家口 075000)

剛地弓形蟲棒狀體蛋白18及其作為基因工程疫苗候選分子研究進(jìn)展

劉榮榮，張曉磊，張進(jìn)順*

(河北北方學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)研究所，河北張家口 075000)

剛地弓形蟲棒狀體蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒狀體分泌的、屬于棒狀體蛋白2家族的一員，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，在蟲體入侵和毒力的發(fā)揮方面起著重要作用。論文就ROP18蛋白的結(jié)構(gòu)、毒力和作用機(jī)制及其作為基因疫苗候選分子的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

剛地弓形蟲；棒狀體蛋白18；毒力；作用機(jī)制；基因疫苗

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)屬于頂復(fù)門原蟲，是專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，是人類重要的機(jī)會(huì)致病性病原體，尤其對(duì)于與T細(xì)胞相關(guān)的先天或獲得性免疫缺陷的患者更具有危害性[1]。貓及其他貓科動(dòng)物是其終宿主，人類及豬、牛、羊等畜禽類動(dòng)物為其中間宿主。人類感染弓形蟲后在免疫功能良好的患者表現(xiàn)為無臨床癥狀的慢性持續(xù)性感染，蟲體可以包囊形式持續(xù)存在于感染者組織中，如大腦、骨骼肌、心臟等。但是在免疫功能受損的患者，比如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者、腫瘤患者和器官移植者等其他免疫功能受到抑制的個(gè)體，感染弓形蟲后會(huì)對(duì)身體健康造成嚴(yán)重?fù)p害[2],如果CD4+T細(xì)胞數(shù)小于200 μL蟲體將會(huì)處于有侵襲性的速殖子狀態(tài)[3],速殖子可感染任何類型細(xì)胞和組織并在其內(nèi)復(fù)制最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡，進(jìn)而侵襲臨近正常細(xì)胞和組織，可表現(xiàn)為視網(wǎng)膜脈絡(luò)炎和腦炎等，聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)已將弓形蟲列為食源性感染性寄生蟲[4]，弓形蟲感染引起了全球性的關(guān)注。弓形蟲感染的流行不僅對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害，而且對(duì)畜牧業(yè)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。Luo H等[6]運(yùn)用間接血凝試驗(yàn)對(duì)江西省動(dòng)物園內(nèi)的野生動(dòng)物進(jìn)行弓形蟲抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示長(zhǎng)頸鹿陽性率為27%，狼的陽性率為20%，河馬的陽性率為17%，凍原天鵝的陽性率為22%，同時(shí)用同樣的方法對(duì)江西省13個(gè)縣境內(nèi)的畜類進(jìn)行調(diào)查，山羊的陽性率為10%，水牛的陽性率為17%，牛的陽性率為11%。鑒于弓形蟲感染的危害和流行，弓形蟲致病機(jī)理的研究和預(yù)防弓形蟲感染的疫苗研制引起了廣大學(xué)者的重視，研究成果正在不斷刷新。本文就弓形蟲棒狀體ROP18及其作為基因疫苗候選分子的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ROP18的結(jié)構(gòu)、毒力和作用機(jī)制

弓形蟲在與宿主接觸并入侵過程中主要有3類細(xì)胞器發(fā)揮作用，包括微線體(microneme)、棒狀體(rhoptry)和致密顆粒(dense granule)。棒狀體蛋白在蟲體侵入宿主細(xì)胞的初期分泌至納蟲空泡或是插入在納蟲空泡膜上[7]，多數(shù)棒狀體蛋白與蟲株的毒力和蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖有關(guān)[8]。ROP18屬于棒狀體蛋白2家族的一員，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，被認(rèn)為是重要的毒力決定因子而被廣泛關(guān)注[9]。

1.1 ROP18的結(jié)構(gòu)

了解ROP18的結(jié)構(gòu)是探究其作用機(jī)制和研制疫苗的先決條件。生物信息學(xué)分析表明ROP18是含有554個(gè)氨基酸的親水性分泌蛋白，保守結(jié)構(gòu)區(qū)域有10個(gè)，其中含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化區(qū)域和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活化位點(diǎn)區(qū)域[10]，證明ROP18是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該蛋白序列C端是含絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的疏水區(qū)[11]，N端富含精氨酸，該區(qū)突變的ROP18突變體在蟲體入侵宿主細(xì)胞后ROP18不能與納蟲空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)結(jié)合[12]，表明N端富含精氨酸的區(qū)域介導(dǎo)ROP18與納蟲空泡膜的結(jié)合，對(duì)于ROP18發(fā)揮關(guān)鍵毒力因子的作用是至關(guān)重要的。ROP18的三維晶體結(jié)構(gòu)呈絲氨酸/蘇氨酸激酶折疊方式，激酶結(jié)構(gòu)域位于187-554位氨基酸之間，有兩個(gè)配體結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為N端223-347位氨基酸之間的蔗糖結(jié)合口袋，另一個(gè)為ATP結(jié)合口袋[13]，其中蔗糖結(jié)合口袋中的兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)ROP18Arg223和ROP18Met284與弓形蟲的毒力直接相關(guān)[14]。

1.2 ROP18的毒力

弓形蟲的基因型主要分為強(qiáng)毒力株Ⅰ型、中等毒力株Ⅱ型和弱毒力株Ⅲ型[15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，將Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型弓形蟲蟲株雜交，篩選出與弓形蟲毒力高度相關(guān)的棒狀體蛋白激酶基因ROP18，該基因位于弓形蟲第Ⅶ號(hào)染色體上。ROP18是Ⅰ型弓形蟲在鼠體內(nèi)的重要毒力決定因子[17]，是不同蟲株間毒力差異的原因之一。 將Ⅰ型蟲株的ROP18基因轉(zhuǎn)染Ⅲ型蟲株，結(jié)果使蟲株的增殖速率急劇增大，對(duì)小鼠模型的致死力提高4～5個(gè)數(shù)量級(jí)[18]，證明ROP18 在不同蟲株的毒力調(diào)節(jié)中是關(guān)鍵蛋白分子之一。

1.3 ROP18的作用機(jī)制

弓形蟲在侵入宿主細(xì)胞的過程中逐漸在其周圍形成PVM將蟲體包圍，以此來躲避宿主的殺傷機(jī)制。免疫相關(guān)GTP酶(IRGs)是GTP酶家族的一員，也稱p47，Irgb6、Irgb10、Irga6和Irgd是IRGs的四大成員。細(xì)胞在正常狀態(tài)下IRGs處于低表達(dá)水平，但在IFN-γ的誘導(dǎo)下可高度表達(dá)[19]。當(dāng)蟲體入侵后，宿主的抗弓形蟲適應(yīng)性免疫反應(yīng)被激活，T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種與抗弓形蟲感染相關(guān)的免疫上調(diào)因子如γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IL-12等，以及下調(diào)因子如IL-4、 IL-6、IL-10 等。在IFN-γ的誘導(dǎo)下，新合成的IRGs被轉(zhuǎn)運(yùn)至PVM上(轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制有待研究)[20]，最終使PVM破裂達(dá)到清除蟲體的目的。研究表明[21]，在感染弓形蟲90 min之內(nèi)IRGs完成在 PVM 上的積累，是宿主細(xì)胞抑制鼠弓形蟲的主要途徑。但Ⅰ型蟲株感染時(shí)，ROP18分泌并被運(yùn)送至PVM上，磷酸化IRGs的一個(gè)關(guān)鍵激酶結(jié)構(gòu)域，從而阻止IRGs在PVM的聚集，發(fā)揮毒力作用，打破宿主固有的抗感染機(jī)制。其中Irgb6被認(rèn)為是ROP18磷酸化的特定作用對(duì)象[22]。ROP18磷酸化IRGs是通過和ROP5形成復(fù)合物滅活I(lǐng)RGs的活性的[23]，ROP5是ROP18的輔助因子，可以將IRGs蛋白鎖定在無活性的GDP結(jié)合狀態(tài)，同時(shí)將IRGs上的蘇氨酸位點(diǎn)暴露給ROP18，被ROP18磷酸化，使IRGs上的GTP結(jié)合位點(diǎn)被破壞，IRGs不再被激活，IRGs堆積的級(jí)聯(lián)反應(yīng)不能發(fā)生。最近研究表明[22]，致密顆粒7(GRA7)為ROP18/ROP5復(fù)合物的輔助因子，對(duì)于ROP18激酶活性的實(shí)現(xiàn)和特異性地使Irga6失活是必需的。GRA7通過與ROP5直接結(jié)合而錨定在PVM上，三者共同發(fā)揮作用阻止PV被宿主免疫系統(tǒng)裂解。GRA7的缺失將導(dǎo)致PVM上磷酸化Irga6的IRGs蛋白數(shù)量增多，并且會(huì)使蟲株的毒力減弱。

Yamamoto M等[24]發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄因子6β(ATF6β)是ROP18的另一個(gè)作用靶點(diǎn)，ATF6β是定位于宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)錄因子，ROP18通過磷酸化ATF6β的至少一個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)使ATF6β經(jīng)蛋白酶體途徑降解，下調(diào)由CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅰ型獲得性免疫反應(yīng)，從而干擾宿主的獲得性免疫系統(tǒng)。

此外，ROP18還可以抑制NF-κB信號(hào)通路。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白家族包括p50 (NF-κB1)、p52 (NF-κB2)、p65 (RelA)、RelB和c-Rel等5個(gè)亞單位。ROP18N-末端部分與p65的二聚化結(jié)構(gòu)域相關(guān)，ROP18磷酸化p65蛋白的468位蘇氨酸并靶向泛素依賴性途徑將p65降解[25]。除上述作用機(jī)制外，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出7種人胎腦cDNA文庫中與ROP18相互作用的因子，包括DDB1、TOR1AIP1、integrin、SLC3A2、TPST2、DERL2和OCIAD1[26]，說明ROP18與宿主的作用機(jī)制復(fù)雜多樣。

2 ROP18作為基因疫苗候選分子的研究

免疫預(yù)防是控制弓形蟲病的有效途徑，基因疫苗是繼全蟲疫苗和亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗，已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛探究和運(yùn)用。ROP18在弓形蟲入侵和毒力的發(fā)揮方面扮演重要角色，具有較好免疫原性，因此作為抗弓形蟲疫苗的候選蛋白被高度重視和研究。

2.1 ROP18單基因疫苗

張穎等[27]構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30a(+)-TgROP18，經(jīng)Western blotting分析表明ROP18能被鼠抗弓形蟲多克隆抗體識(shí)別，驗(yàn)證了ROP18具有良好的抗原性，可以作為疫苗候選分子。Yuan Z G等[28]構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒PVAX1-ROP18免疫昆明小鼠，產(chǎn)生較高水平的抗弓形蟲IgG2a抗體,CD69表達(dá)增高，說明ROP18可以刺激小鼠產(chǎn)生CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，激發(fā)體液免疫和Th1型細(xì)胞免疫；小鼠存活時(shí)間(27.9±15.1 d)較對(duì)照組(7 d)明顯延長(zhǎng)，證明ROP18具有良好的免疫保護(hù)作用。

2.2 復(fù)合基因疫苗

復(fù)合基因疫苗是將多個(gè)不同抗原的編碼基因克隆到一個(gè)表達(dá)載體上，一次可表達(dá)多個(gè)抗原達(dá)到更多的靶向作用，以此來提高免疫效果。石娜等[29]用重組質(zhì)粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18免疫小鼠，結(jié)果顯示復(fù)合基因組的小鼠血清抗體OD值明顯高于單基因組(P<0.05)；對(duì)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明復(fù)合基因組的細(xì)胞因子濃度要高于單基因組(P<0.05)；用弓形蟲RH株速殖子攻擊小鼠后，復(fù)合基因組的生存率明顯高于單基因組(P<0.05)。陳琳等[30]成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)復(fù)合基因組的特異性抗體IgG1和IgG2值、細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4濃度都高于單基因組(P<0.05)；進(jìn)行弓形蟲速殖子攻擊后，復(fù)合基因組的小鼠生存率也明顯高于單基因組(P<0.05)。說明復(fù)合基因的免疫效果存在一定的優(yōu)勢(shì)，能產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫。目前商品化的抗弓形蟲疫苗只有用于免疫綿羊的疫苗，用于人的疫苗還未見報(bào)道，這是未來研制弓形蟲疫苗面臨的一大挑戰(zhàn)。

綜上所述，關(guān)于宿主和弓形蟲相互作用機(jī)制的研究取得了較大成果，但由于弓形蟲生活史和致病機(jī)理的復(fù)雜性，許多機(jī)制還沒有被完全闡明。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，相信弓形蟲的免疫機(jī)制和致病機(jī)理將會(huì)得到更深入了解，針對(duì)作用機(jī)制研制的基因疫苗也將會(huì)更加有效。

[1] Hunter C A,Sibley L D.Modulation of innate immunity byToxoplasmagondiivirulence effectors [J].Nat Rev Microbiol,2012,10(11):766-778.

[2] Grzybowski M M,Gatkowska J M,Dziadek B,et al.Human toxoplasmosis:a comparative evaluation of the diagnostic potential of recombinantToxoplasmagondiiROP5 and ROP18 antigens[J].J Med Microbiol,2015,64 (10):1201-1207.

[3] Basavaraju A.Toxoplasmosis in HIV infection:An overview[J].Trop Parasitol,2016,6(2):129-135.

[4] Robertson L J,van der Giessen J W,Batz M B,et al.Have foodborne parasites finally become a global concern?[J].Trends Parasitol,2013,9(3):101-103.

[5] Rahimi M T,Daryani A,Sarvi S,et al.Cats andToxoplasmagondii:A systematic review and meta-analysis in Iran[J].Onderstepoort J Vet Res,2015,82(1):e1-e10.

[6] Luo H,Li K,Zhang H,et al.Seroprevalence ofToxoplasmagondiiinfection in zoo and domestic animals in Jiangxi Province,China[J].Parasite,2017,24(7):887-892.

[7] Boothroyd J C,Dubremetz J F.Kiss and spit:the dual roles ofToxoplasmarhoptries[J].Nat Rev Microbiol,2008,6(1):79-88.

[8] 徐 穎,高 琦,徐前明,等.弓形蟲棒狀體頸部蛋白及棒狀體蛋白研究的新進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2013,29(12):1217-1221.

[9] 張 賢,甘小鳳,程正陽,等.弓形蟲棒狀體蛋白2家族成員研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2015,10(6):574-576.

[10] 郭玲玲,張曉磊,張進(jìn)順.剛地弓形蟲ROP18基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2015,10(5):414-419.

[11] 尹 昆,張佃波,閆 歌.弓形蟲毒力決定因子ROP18的研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2013,8(11):1051-1055.

[12] Khan A,Taylor S,Ajioka J W,et al.Selection at a single locus leads to widespread expansion ofToxoplasmagondiilineages that are virulent in mice[J].PLoS Genet,2009,5(3):e1000404.

[13] 尹 昆,寇景軒,王利磊,等.靶向弓形蟲毒力決定因子ROP18激酶抑制劑的虛擬篩選[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2015,10(6):525-530.

[14] Lim D,Gold D A,Julien L,et al.Structure of theToxoplasmagondiiROP18 kinase domain reveals a second ligand binding pocket required for acute virulence[J].J Biol Chem,2013,288(48):34968-34980.

[15] Dardé M L,Bouteille B,Pestre-Alexandre M.Isoenzyme analysis of 35Toxoplasmagondiiisolates and the biological and epidemiological implications[J].J Parasitol,1992,78(5):786-794.

[16] Taylor S,Barragan A,Su C,et al.A secreted serine-threonine kinase determines virulence in the eukaryotic pathogenToxoplasmagondii[J].Science,2006,314(5806):1776-1780.

[17] 劉苗苗,周 鵬,朱興全.弓形蟲棒狀體蛋白的研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2008,38(5):443-446.

[18] Khan A,Taylor S,Ajioka J W,et al.Selection at a single locus leads to widespread expansion ofToxoplasmagondiilineages that are virulent in mice[J].PLoS Genet,2009,5(3):e1000404.

[19] 鄭 斌,陸紹紅.剛地弓形蟲免疫逃避相關(guān)分子的研究進(jìn)展[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2012,30(5):396-400.

[20] 趙桂華,尹淑霞,尹 昆.弓形蟲棒狀體蛋白與宿主細(xì)胞互作的研究進(jìn)展[J].中國(guó)血吸蟲病防治雜志,2014,26(4):453-456.

[21] Taylor G A.IRG proteins:key mediators of interferon regulated host resistance to intracellular pathogens [J].Cell Microbiol,2007,9 (5): 1099-1107.

[22] Hermanns T,Müller U B,K?nen-Waisman S,et al.TheToxoplasmagondiirhoptry protein ROP18 is an Irga6-specific kinase and regulated by the dense granule protein GRA7[J].Cell Microbio,2016,18(2):244-259.

[23] Fleckenstein M C,Reese M L,K?nen-Waisman S,et al.AToxoplasmagondiipseudokinase inhibits host IRG resistance proteins[J].PLoS Biol,2012,10 (7):e1001358.

[24] Yamamoto M,Ma J S,Mueller C,et al.ATF6beta is a host cellular target of theToxoplasmagondiivirulence factor ROP18[J].J Exp Med,2011,208 (7):1533-1546.

[25] Du J,An R,Chen L,et al.Toxoplasmagondiivirulence factor ROP18 inhibits the host NF-κB pathway by promoting p65 degradation[J].J Biol Chem,2014,289(18):12578-12592.

[26] Cheng L,Chen Y,Chen L,et al.Interactions between the ROP18 kinase and host cell proteins that aid in the parasitism ofToxoplasmagondii[J].Acta Trop,2012,122(3):255-260.

[27] 張 穎.剛地弓形蟲強(qiáng)毒株棒狀蛋白R(shí)OP18 的克隆、表達(dá)和免疫反應(yīng)性分析[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2012,30(6):446-449.

[28] Yuan Z G,Zhang X X,Lin R Q,et al.Protective effect against toxoplasmosis in mice induced by DNA immunization with gene encodingToxoplasmagondiiROP18[J].Vaccine,2011,29(38):6614-6619.

[29] 石 娜.弓形蟲基因疫苗pBudCE4.1-AMA1-ROP18免疫小鼠的保護(hù)作用研究[D].山東大學(xué),2012.

[30] 陳 琳.弓形蟲ROP18-MIC2雙基因疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù)性研究[D].山東大學(xué),2012.

2017-04-17

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H2013405091)；河北北方學(xué)院校級(jí)重大課題(ZD201312)

劉榮榮(1990-)，女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事寄生蟲分子生物學(xué)研究。*

S852.4

A

1007-5038(2017)12-0104-04