禽白血病病毒感染對(duì)新城疫和禽流感疫苗免疫效果的影響

張桂枝，靳雙星*，黃炎坤，陳文萍

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450046;2.舞陽(yáng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南漯河 462400)

獸醫(yī)臨床

禽白血病病毒感染對(duì)新城疫和禽流感疫苗免疫效果的影響

張桂枝1，靳雙星1*，黃炎坤1，陳文萍2

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450046;2.舞陽(yáng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南漯河 462400)

為研究禽白血病病毒(ALV)感染對(duì)新城疫(ND)和禽流感(AI)疫苗免疫效果的影響，采用ELISA方法對(duì)河南省某地方品種雞場(chǎng)進(jìn)行ALV-p27抗原檢測(cè)，同時(shí)采集試驗(yàn)雞的血清樣品，檢測(cè)ND、AI(H9)和AI(H5)亞型的免疫抗體水平，并比較了ALV經(jīng)種蛋垂直傳播感染1日齡雛雞和后期感染對(duì)ND、AI疫苗免疫效果影響的差異。結(jié)果表明，ALV經(jīng)種蛋垂直傳播感染1日齡雛雞，能顯著降低ND、AI(H9)和AI(H5)疫苗免疫的抗體水平，陽(yáng)性試驗(yàn)組與陰性組相比血清中ND、H9、H5(Re-6)、H5(Re-7)和H5(Re-8)抗體效價(jià)分別降低1.71 log2、2.37 log2、1.59 log2、1.00 log2和1.79 log2；雞群后期感染ALV，對(duì)ND和AI疫苗的免疫沒(méi)有明顯的抑制作用，陽(yáng)性試驗(yàn)組與陰性組相比無(wú)顯著差異。

禽白血病病毒；新城疫疫苗；禽流感疫苗；免疫效果

禽白血病病毒(Avianleukemia virus，ALV)屬反轉(zhuǎn)錄病毒，是在雞群中普遍存在并常誘發(fā)腫瘤的三大類病毒之一[1]，幾乎波及所有的商品雞群[2-4]。有關(guān)研究表明，雞群感染ALV除引起腫瘤導(dǎo)致直接發(fā)病死亡外；還嚴(yán)重影響雞的生產(chǎn)性能，推遲性成熟、產(chǎn)蛋高峰維持時(shí)間縮短、產(chǎn)蛋率降低、受精率降低，尤其是祖代和父母代雞群暴發(fā)禽白血病后，ALV經(jīng)過(guò)垂直感染可嚴(yán)重影響種蛋孵化率和雛雞的質(zhì)量；另外，ALV還可導(dǎo)致 B淋巴細(xì)胞成熟受抑制，阻斷T淋巴細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致胸腺和法氏囊不同程度的萎縮，使感染雞產(chǎn)生免疫抑制，造成機(jī)體抵抗力明顯下降，增加其他疾病繼發(fā)感染的幾率。迄今為止，有關(guān)ALV感染對(duì)疫苗免疫效果的影響報(bào)道較少，尤其是ALV通過(guò)種蛋垂直傳播感染和后期水平傳播感染對(duì)疫苗免疫效果影響的差異未見報(bào)道。本課題組根據(jù)對(duì)河南省地方品種雞ALV感染情況調(diào)查結(jié)果，選擇某雞場(chǎng)開展了禽白血病的凈化工作，在凈化試驗(yàn)中重點(diǎn)考察了ALV感染對(duì)新城疫和禽流感兩大重要疫病疫苗免疫效果的影響，并比較了ALV垂直傳播感染1日齡雛雞和后期水平傳播感染對(duì)疫苗免疫效果影響的差異，為禽白血病的凈化及新城疫和禽流感的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑 酶標(biāo)儀為Thermo公司產(chǎn)品；微量加樣器、96孔微量反應(yīng)板、離心機(jī)、微量振蕩器、ALV- p27抗原檢測(cè)試劑盒均為BioChek公司產(chǎn)品；雞新城疫、禽流感H5和H9血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)抗原和陽(yáng)性血清為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)雞及免疫狀況 試驗(yàn)雞來(lái)源于河南省某地方品種雞場(chǎng)，按照本場(chǎng)免疫程序分別進(jìn)行了雞馬立克病疫苗、新支H120二聯(lián)凍干苗、法氏囊凍干苗、新支流三聯(lián)油苗、禽流感H5N1(Re-6+Re-7+Re-8)油苗、新支H52二聯(lián)凍干苗和新支流減四聯(lián)油苗等的免疫接種。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法

1.2.1.1 泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測(cè) 采樣前在樣品管中加入1 mL樣品稀釋液，用無(wú)菌棉簽采集試驗(yàn)雞泄殖腔棉拭子，與稀釋液混勻后冷凍。反復(fù)凍融2次，檢測(cè)前將樣品恢復(fù)至25℃，按照BioChek公司ELISA試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1.2 新城疫和禽流感抗體水平測(cè)定 采用微量血凝(HA)試驗(yàn)，在96孔微量凝集反應(yīng)板中，測(cè)定抗原的凝集滴度，然后配制4單位抗原；采用微量血凝抑制(HI)試驗(yàn)，測(cè)定血清樣品中新城疫、禽流感H9、禽流感H5抗體效價(jià)，用n log2來(lái)表示。

1.2.1.3 經(jīng)種蛋垂直傳播1日齡雛雞感染ALV對(duì)疫苗免疫效果的檢測(cè) 出雛當(dāng)天收集1日齡雛雞胎糞進(jìn)行ALV-p27抗原檢測(cè)。選取抗原陽(yáng)性雞50只，單獨(dú)隔離飼養(yǎng)作為試驗(yàn)組；選取抗原陰性雞50只作為陰性組。2組雞的飼養(yǎng)管理和免疫程序完全一致，分別在45日齡和65日齡2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組各隨機(jī)采集24只雞的血清，檢測(cè)新城疫(45日齡)、禽流感H9抗體效價(jià)(45日齡)和禽流感H5抗體效價(jià)(65日齡)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較其差異。

1.2.1.4 后期感染ALV對(duì)疫苗免疫效果的檢測(cè) 選取1日齡胎糞ALV-p27抗原陰性雞作為試驗(yàn)動(dòng)物，8周齡時(shí)檢測(cè)其ALV-p27抗原淘汰陽(yáng)性雞，陰性雞飼養(yǎng)至23周齡再次檢測(cè)泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將其分為兩組，抗原陽(yáng)性雞為試驗(yàn)組(40只)，由于經(jīng)過(guò)了1日齡和8周齡檢測(cè)淘汰陽(yáng)性雞，因此該試驗(yàn)組中的雞大部分是后期感染ALV所致；23周齡抗原陰性雞作為陰性組(40只)。2組雞的飼養(yǎng)管理和免疫程序完全一致，在 180日齡每組各隨機(jī)采集24只雞的血清，檢測(cè)新城疫、禽流感H5、禽流感H9抗體效價(jià)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較其差異。

1.2.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)所得的所有數(shù)據(jù)，

采用 Microsoft Excel 軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，抗體效價(jià)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)種蛋垂直傳播1日齡雛雞感染ALV對(duì)ND和AI疫苗免疫效果的影響

2.1.1 對(duì)ND抗體效價(jià)的影響 雛雞飼養(yǎng)至45日齡時(shí)，分別采集陽(yáng)性試驗(yàn)組和陰性組各24只雞的血清，利用微量HA-HI試驗(yàn)，測(cè)定樣品中ND抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，陽(yáng)性試驗(yàn)組ND抗體效價(jià)平均值為8.29 log2，陰性組為10.00 log2，陽(yáng)性試驗(yàn)組的抗體水平顯著低于陰性組(P<0.05)(表1)。

2.1.2 對(duì)禽流感H9抗體效價(jià)的影響 檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性試驗(yàn)組禽流感H9抗體效價(jià)平均值為7.13 log2，陰性組為9.50 log2，陽(yáng)性試驗(yàn)組的抗體水平顯著低于陰性組(P<0.05)(表1)。

2.1.3 對(duì)禽流感H5抗體效價(jià)的影響 雛雞飼養(yǎng)至65日齡時(shí)，分別采集陽(yáng)性試驗(yàn)組和陰性組各24只雞的血清，利用微量HA-HI試驗(yàn)，測(cè)定樣品中禽流感H5(Re-6)、H5(Re-7)和H5(Re-8) 抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，陽(yáng)性試驗(yàn)組禽流感H5(Re-6)抗體效價(jià)平均值為8.58 log2，陰性組為10.17log2，陽(yáng)性組顯著低于陰性組(P<0.05)；陽(yáng)性試驗(yàn)組禽流感H5(Re-7)抗體效價(jià)平均值為5.71 log2，陰性組為6.71 log2，兩組間差異極顯著(P<0.01)；陽(yáng)性試驗(yàn)組禽流感H5(Re-8)抗體效價(jià)平均值為8.17 log2，陰性組為9.96 log2，兩組間差異極顯著(P<0.01)(表2)。

表1 45日齡雞血清中ND、AI-H9抗體水平(n log2)

注：*表示差異顯著(P<0.05)。

Note:*Mean significant difference(P<0.05).

表2 65日齡雞血清中AI-H5抗體水平(n log2)

注：*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:*Mean significant difference(P<0.05);**Mean extremely significant difference(P<0.01).

2.2 后期感染ALV對(duì)ND和AI疫苗免疫效果的影響

2.2.1 對(duì)ND抗體效價(jià)的影響 180日齡時(shí)，分別采集陽(yáng)性試驗(yàn)組和陰性組各24只雞的血清，測(cè)定樣品中ND 抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，陽(yáng)性試驗(yàn)組ND抗體效價(jià)平均值為10.63 log2，陰性組平均值為10.88 log2，陽(yáng)性組略低于陰性組，但兩組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

2.2.2 對(duì)禽流感H9抗體效價(jià)的影響 檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性試驗(yàn)組禽流感H9抗體效價(jià)平均值為10.00 log2，陰性組平均值為10.25 log2，陽(yáng)性組略低于陰性組，但兩組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

2.2.3 對(duì)禽流感H5抗體效價(jià)的影響 檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性試驗(yàn)組禽流感H5(Re-6)抗體效價(jià)平均值為8.33 log2，陰性組為8.29 log2，陽(yáng)性組略高于陰性組，但兩組間差異不顯著(P>0.05)。陽(yáng)性試驗(yàn)組禽流感H5(Re-7)抗體效價(jià)平均值為7.79 log2，陰性組為8.33log2，陽(yáng)性組低于陰性組，但兩組間差異不顯著(P>0.05)；陽(yáng)性試驗(yàn)組禽流感H5(Re-8)抗體效價(jià)平均值為8.25 log2，陰性組為8.46 log2，陽(yáng)性組略低于陰性組，兩組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 180日齡雞血清中ND與AI-H9、H5抗體水平( log2)

2.3 垂直傳播感染ALV和后期感染ALV對(duì)ND和AI疫苗免疫效果影響的差異性比較

由表1、表2、表3檢測(cè)結(jié)果可知，經(jīng)種蛋垂直傳播1日齡雛雞感染ALV能顯著降低ND、禽流感H9和H5疫苗免疫的抗體水平，陽(yáng)性組血清中ND、禽流感H9和H5抗體效價(jià)顯著低于陰性組，兩組間差異均極顯著(P<0.01)；而后期感染ALV，對(duì)ND和AI疫苗的免疫沒(méi)有明顯的抑制作用，陽(yáng)性組血清中ND、禽流感H9和H5抗體效價(jià)與陰性組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討論

由于ELISA方法檢測(cè)ALV-p27抗原，無(wú)法檢測(cè)出所有的外源性ALV[5-6]，因此，盡管雞群在1日齡和8周齡兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)ALV- p27抗原淘汰陽(yáng)性雞，雞群中仍然存在少數(shù)抗原陰性帶毒雞，這部分雞生長(zhǎng)到一定日齡后仍可向外排毒，導(dǎo)致與其接觸雞群感染ALV，這是雞群后期水平感染ALV的重要原因。根據(jù)本試驗(yàn)23周齡ALV- p27抗原檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性率達(dá)4.73%。因此在開展禽白血病凈化工作時(shí)，一個(gè)世代需經(jīng)多次檢測(cè)淘汰抗原陽(yáng)性雞并結(jié)合病毒的分離，同時(shí)要健全生物安全制度和孵化管理，經(jīng)過(guò)4～5世代凈化才能達(dá)到徹底根除目的。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，ALV經(jīng)種蛋垂直傳播感染1日齡雛雞能顯著降低感染雞群ND和AI疫苗的免疫效果，陽(yáng)性組血清中ND、禽流感H9和H5抗體效價(jià)顯著低于陰性組，兩組間差異均極顯著(P<0.01)；而后期水平傳播感染ALV，對(duì)ND和AI疫苗的免疫沒(méi)有明顯抑制作用，陽(yáng)性組血清中ND、禽流感H9和H5抗體效價(jià)與陰性組相比無(wú)顯著差異。王建新等[7]報(bào)道，1日齡肉雞人工感染ALV-J能顯著降低新城疫的抗體效價(jià)，與本試驗(yàn)研究結(jié)果ALV經(jīng)種蛋垂直傳播感染1日齡雛雞能顯著抑制ND、禽流感H9和H5免疫效果相一致。司興奎等研究報(bào)道ALV感染程度與新城疫、禽流感的免疫抗體水平具有明顯的負(fù)相關(guān)性[8]。張丹俊等研究報(bào)道五華雞群感染ALV-J對(duì)247、278和337日齡雞血清中ND、禽流感H9和H5抗體效價(jià)沒(méi)有明顯影響[9]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果后期水平傳播感染ALV對(duì)疫苗的免疫效果沒(méi)有顯著影響也相符合。

研究表明ALV可以通過(guò)干擾功能性白細(xì)胞介素2(IL-2)的合成，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞成熟受抑制和阻斷T淋巴細(xì)胞的發(fā)育。商營(yíng)利等研究表明，ALV-J可引起雞胸腺、法氏囊及脾臟中淋巴細(xì)胞的凋亡，凋亡現(xiàn)象主要在早期，隨日齡的增加凋亡細(xì)胞逐漸減少[10]。這可以部分解釋本試驗(yàn)中ALV經(jīng)種蛋垂直傳播感染1日齡雛雞能顯著降低ND、禽流感H9和H5疫苗免疫的抗體水平，而后期水平傳播感染對(duì)ND和AI疫苗的免疫沒(méi)有明顯抑制作用。ALV感染越早對(duì)雞群的危害越嚴(yán)重[11]，因此，做好種雞AL凈化，降低雛雞ALV感染率是充分發(fā)揮ND、AI等疫苗免疫效果，有效預(yù)防新城疫和禽流感的重要措施之一。

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EffectofAvianLeukosisVirusInfectiononImmunizedEfficacyofNewcastleDiseaseandAvianInfluenzaVaccine

ZHANG Gui-zhi1,JIN Shuang-xing1,HUANG Yan-kun1,CHEN Wen-ping2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou,Henan,450046,China; 2.WuyangCountryAnimalDiseasePreventionandCountrolCenter，Luohe,Henan,462400,China)

To investigate the effect of Avian Leukosis virus (ALV) infection on immunized efficacy of newcastle disease (ND) and Avian Influenza (AI) vaccine,ALV-p27 antigen was detected in a Henan local strains chicken farm by ELISA method,and the antibody levels of ND,AI(H5)and AI(H9) in infected and non-infected groups were detected，and the different immune effects between 1-day-old vertical transmission and late infection were compared.The results showed that the antibody levels of ND,AI(H5)and AI(H9)were significantly reduced by vertical transmission.In the comparison between the positive test group and the negative control group,the antibody titers for ND,H9,H5(Re-6),H5(Re-7) and H5(Re-8) were decreased by 1.71 log2,2.37 log2,1.59 log2,1.00 log2 and 1.79 log2 respectively.Moreover,antibody titers for ND and AI didn’t show obviously drop in late ALV infection,and there was no significant difference between the positive test group and the negative control group.

ALV; ND vaccine; AI vaccine; immunized efficacy

2017-04-08

河南省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(161100510200)；?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(HUAHE2015003)

張桂枝(1970-)，女，河南原陽(yáng)人，副教授，碩士，主要從事畜禽疫病防治的教學(xué)與科研工作。*

S813.7

B

1007-5038(2017)12-0119-04