錦州某奶牛養(yǎng)殖場乳房炎大腸埃希菌藥敏試驗及耐藥基因檢測

于長泳

(遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110164)

錦州某奶牛養(yǎng)殖場乳房炎大腸埃希菌藥敏試驗及耐藥基因檢測

于長泳

(遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110164)

為了解錦州某奶牛養(yǎng)殖場臨床型乳房炎病原菌耐藥情況。對該場進(jìn)行患病乳樣采集、主要病原菌分離鑒定、藥物敏感性試驗和耐藥基因篩選。結(jié)果表明，該場乳房炎主要病原菌為大腸埃希菌，共得到乳房炎大腸埃希菌分離株36株；藥物敏感性試驗結(jié)果表明，分離株對磺胺類藥物高度耐藥、對頭孢噻呋和頭孢唑啉敏感；對分離株進(jìn)行磺胺類藥物耐藥基因篩查結(jié)果表明，sul1、sul2、sul3基因的陽性率分別為76.0%、17.1%和0%，說明sul1基因為該場大腸埃希菌磺胺類藥物主要耐藥基因。

奶牛；乳房炎；大腸埃希菌；藥敏試驗；耐藥基因

乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)常發(fā)疾病之一，其主要臨床表現(xiàn)為患病牛乳房紅、腫、熱、痛、泌乳機能障礙等，并同時伴有凝乳、乳汁結(jié)塊、血乳及絮狀物沉淀等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[1-3]。據(jù)報道，奶牛乳房炎在世界范圍內(nèi)發(fā)病率高達(dá)50%左右，我國每年約有10%～15%的奶牛因乳房炎而被淘汰[4]。

飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)水平、遺傳因素等均與奶牛乳房炎相關(guān)，但病原微生物感染仍是其最主要的致病因素之一[5]。已知超過150種病原微生物能夠引起奶牛乳房炎，其中金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸埃希菌為最主要的3種病原菌[6-7]。目前，抗菌藥物治療仍是奶牛乳房炎的首選治療方案，但隨著抗菌藥物特別是廣譜抗菌藥物的長期使用，病原菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，給乳房炎治療帶來新的挑戰(zhàn)[8]。

本試驗對遼寧錦州某規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場進(jìn)行乳房炎大腸埃希菌的分離鑒定，測試分離株對臨床常用抗菌藥物的敏感性，并對分離株產(chǎn)生耐藥的分子機制進(jìn)行研究，為該場奶牛乳房炎綜合防控提供依據(jù)，并為乳房炎病原菌分子耐藥機制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試病牛 經(jīng)駐場獸醫(yī)確診的乳房炎病牛43頭，病牛伴有不同程度的乳房腫脹、觸診堅實、乳區(qū)疼痛感明顯、泌水樣乳、血乳、結(jié)塊乳等乳房炎典型臨床癥狀。其中33頭為1乳區(qū)感染，其余10頭為2乳區(qū)感染。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為博邁德生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收純化試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；營養(yǎng)肉湯(NB)、麥康凱營養(yǎng)瓊脂粉為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；腸桿菌科生化常規(guī)鑒定管為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；MH-B培養(yǎng)基為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000 、2×TaqPCR master mix、TE buffer(×50)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HEQ-D1C)，廣州天泉精密儀器設(shè)備公司；電熱培養(yǎng)箱(長春立升，CDX-141)和立式高壓蒸汽滅菌器(LDC-XX-03)，浙江永靖醫(yī)療設(shè)備有限公司；梯度PCR擴增儀(T100 Thermal Cycler)和凝膠成像系統(tǒng)(Gel Dox XR+)為Bio-Rad公司產(chǎn)品；還有電動移液器(FIN-1330)，微量可調(diào)單道、多道加樣器。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)品 氨芐西林(87.9%)、阿莫西林(88.1%)、頭孢唑啉(99.6%)、頭孢噻呋(85.1%)、多西環(huán)素(79.3%)、氟苯尼考(99.0%)、磺胺間甲氧嘧啶(85.1%)、磺胺甲基異惡唑(90.0%)標(biāo)準(zhǔn)品購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922由遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心提供；磺胺類藥物耐藥基因sul1、sul2、sul3陽性質(zhì)粒由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.1.5 磺胺類藥物耐藥基因檢測引物 根據(jù)文獻(xiàn)報道及NCBI中已公布的磺胺類藥物耐藥基因序列，利用prime 9.0設(shè)計特異性檢測引物，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 PCR擴增引物

1.2 方法

1.2.1 病料采集 采樣前用溫水和軟布將乳區(qū)洗凈，之后用750 mL/L乙醇棉球和碘酊進(jìn)行消毒。棄去頭3把奶后，將乳樣采集于50 mL滅菌離心管中。蓋緊試管并做好標(biāo)記，于4℃保溫箱中保存并盡快送至實驗室。

1.2.2 大腸埃希菌初步分離 按照麥康凱瓊脂培養(yǎng)基粉說明書要求，制作麥康凱瓊脂平皿培養(yǎng)基。將平皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)18 h，觀察無菌落生長的平皿為檢菌合格，可用于病原菌分離試驗。在潔凈工作臺中，用微量移液器向檢菌合格的麥康凱瓊脂平皿中移取乳房炎乳樣200 μL，并用無菌的三角玻璃棒將乳樣涂抹均勻，正置待乳樣完全吸收后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

1.2.3 大腸埃希菌生化反應(yīng)鑒定 將初步分離的疑似大腸埃希菌分離株接種于檢菌合格的5 mL營養(yǎng)肉湯中，于37℃振蕩培養(yǎng)12 h。測定其吸光光度值，當(dāng)OD600=0.4～0.6時為細(xì)菌到達(dá)對數(shù)生長期。將到達(dá)對數(shù)生長期的疑似大腸埃希菌分離株，按生化鑒定管說明書要求，分別接種于11個生化反應(yīng)管內(nèi)，密封并于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后根據(jù)反應(yīng)結(jié)果，參照編碼手冊，對疑似分離株進(jìn)行編碼鑒定。并將確定的大腸埃希菌分離株于終濃度為30%的無菌甘油中，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 大腸埃希菌分離株藥物敏感性試驗 使用CLSI(2015版)推薦的微量肉湯稀釋法，測定8種受試抗菌藥物對乳房炎大腸埃希菌分離株的最小抑菌濃度(MIC)。將保存于甘油中的乳房炎大腸埃希菌分離株，在無菌營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至菌液濃度為1×108CFU/mL。用倍比稀釋法，將受試藥物稀釋成濃度范圍在0.125 μg/mL～256 μg/mL的12個濃度梯度。將菌液和藥液加入96孔U底細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。觀察抑制分離株生長的最小藥物濃度為該藥物的MIC[9]。每個分離株重復(fù)3個平行，以大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922為質(zhì)控菌。

1.2.5 乳房炎大腸埃希菌基因組DNA提取 大腸埃希菌甘油菌復(fù)蘇培養(yǎng)方法同1.2.4。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明說操作要求，提取奶牛乳房炎大腸埃希菌分離株基因組DNA，并于10 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳檢驗提取效果。

1.2.6 大腸埃希菌分離株磺胺類藥物耐藥基因PCR檢測 PCR擴增體系：100 μL反應(yīng)體系中加入上、下游引物2.0 μL，滅菌雙蒸去離子水44.0 μL，2×TaqPCR Master Mix 50.0 μL，模板DNA 2.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 4 min；94℃ 30 s，(sul1 65 ℃、sul2 70 ℃、sul3 60 ℃)退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個重復(fù)循環(huán)；72℃最終延伸7 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳房炎大腸埃希菌分離鑒定結(jié)果

經(jīng)麥康凱鑒別培養(yǎng)基初篩，腸桿菌科生化鑒定反應(yīng)管生化鑒定，從53份乳房炎病料分離到到疑似大腸埃希菌分離株50株，經(jīng)生化反應(yīng)管鑒定后，最終確定大腸埃希菌分離株36株。

2.2 大腸埃希菌分離株藥物敏感性測試結(jié)果

36株乳房炎大腸埃希菌分離株對受試的8種抗菌藥物已產(chǎn)生不同程度的耐藥性。其中，分離株對磺胺甲基異惡唑耐藥率最高，為61.1%(22/36)、磺胺間甲氧嘧啶次之，為55.6%(20/36)；分離株對頭孢唑啉和頭孢噻呋較為敏感，耐藥率分別為11.1%(4/36)和13.9%(5/36)(表2)。

2.3 大腸埃希菌分離株多藥耐藥分析

36株奶牛乳房炎大腸埃希菌分離株，僅1株對受試的8種抗菌藥物均敏感。其余35株分離株，最少耐受1種抗菌藥物，最多耐受5種抗菌藥物。耐受0～5種抗菌藥物的菌株占比分別為2.8%(1/3)、16.7%(6/36)、41.7%(15/36)、27.8%(10/36)、8.3%(3/36)及2.7%(1/36)。其中同時耐受2種抗菌藥物的菌株最多，共15株，占比41.7%(圖1)。

2.4 大腸埃希菌基因組DNA提取結(jié)果

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取36株奶牛乳房炎大腸埃希菌分離株基因組DNA。并經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為電壓110V，電泳30 min(圖2)。

表2 36株奶牛乳房炎大腸埃希菌分離株藥物敏感性測試結(jié)果

2.5 磺胺類耐藥基因PCR篩查結(jié)果

使用特異性引物PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳及測序比對，在36株乳房炎大腸埃希菌分離株中共篩查到sul1基因陽性菌株19株、sul2基因陽性菌株6株，未檢出sul3基因。sul1分離率為76.0%(19/35)、sul2分離率為17.1%(6/35)。其中有4株分離株同時檢出sul1和sul2基因(圖3～圖5)。

3 討論

奶牛乳房炎為奶牛養(yǎng)殖業(yè)多發(fā)疾病，嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展，病原微生物感染是其最主要的致病原因 之一。目前抗菌藥物仍是奶牛乳房炎的主要治療手段，但病原菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性而導(dǎo)致的治療失敗現(xiàn)象日益嚴(yán)峻。同時多種奶牛乳房炎病原菌均為人獸共患病原菌，易對食品安全及人類健康造成威脅[10]。本試驗結(jié)果表明，受試飼養(yǎng)場奶牛乳房炎大腸埃希菌分離株對磺胺類藥物高度耐藥(磺胺甲基異惡唑61.1%、磺胺間甲氧嘧啶55.6%)，對頭孢唑林、頭孢噻呋、阿莫西林及多西環(huán)素敏感性較高。與國內(nèi)其他地區(qū)報道有所差異，如張寶金等報道[2]，寧夏地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌對氨芐西林耐藥率較高，對多西環(huán)素及四環(huán)素中度耐藥，對氟苯尼考、頭孢噻肟、頭孢唑林較為敏感；王禮偉等報道[1]，新疆地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌對青霉素、磺胺類藥物高度耐藥，對四環(huán)素、氟苯尼考、頭孢類藥物高度敏感；劉耀川等報道[9]，遼寧阜新地區(qū)奶牛隱性乳房炎大腸埃希菌分離株對磺胺類藥物高度耐藥；姚偉等報道[3]，遼寧某大型奶牛養(yǎng)殖場乳房炎大腸埃希菌分離株對環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、氧氟沙星高度敏感，對磺胺類藥物高度耐藥。比較本試驗數(shù)據(jù)與報道數(shù)據(jù)，多地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌均對磺胺類藥物高度耐藥，可能是由于磺胺類藥物作為乳房炎治療的常用藥物，使用頻率及使用量均較大，病原菌在藥物的選擇壓力作用下，對其耐藥性也逐漸增高所致。大部分報道表明，分離株多對頭孢類藥物特別是頭孢噻呋敏感性較高，可能是因為頭孢噻呋為較新的頭孢菌素類抗菌藥物，抗菌效果較好。

圖1 大腸埃希菌分離株多藥耐藥情況

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000 ；1～10.部分大腸埃希菌基因組DNA

M.DNA Marker DL 15 000 ; 1-10.Portion genomic DNA ofE.coliisolates

圖2部分大腸埃希菌基因組DNA電泳圖片

Fig.2 Electrophoresis of portion genomic DNA ofE.coliisolates

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽性對照；2.陰性對照；3～6.部分陽性結(jié)果

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Positive control; 2.Negative control; 3-6.Portion positive results

圖3部分sul1基因電泳圖

Fig.3 Electrophoresis of portionsul1 gene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽性對照；2.陰性對照；3～6.部分陽性結(jié)果

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Positive control; 2.Negative control; 3-6.Portion positive results

圖4部分sul2基因電泳圖

Fig.4 Electrophoresis of portionsul2 gene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ；1.陽性對照；2～6.篩查結(jié)果

M.DNA Marker DL 2 000 ; 1.Positive control; 2.Negative control; 3-6.Screening results

圖5sul3基因篩查電泳結(jié)果

Fig.5 Electrophoresis of portionsul3 gene

sul基因家族作為磺胺類藥物耐藥的主要分子機制，能夠介導(dǎo)病原微生物對磺胺類藥物產(chǎn)生不同水平的耐藥[11-14]。本試驗結(jié)果表明，錦州受試飼養(yǎng)場大腸埃希菌sul1、sul2、sul3基因檢出率分別為76.0%、17.1%和0.0%，sul1基因檢出率最高。陳紹輝等報道[11]，吉林地區(qū)大腸埃希菌sul2基因檢出率為100%；趙曉麗等報道[15]，昆明地區(qū)大腸埃希菌sul1基因檢出率為66.74%；劉開成等報道[10]，青島地區(qū)大腸埃希菌sul1、sul2、sul3基因的檢出率為43.6%、25.53%和32.73%；呂文發(fā)等報道[7]，吉林地區(qū)大腸埃希菌上述3種基因的檢出率分別為37.4%、39.2%和0%；韋慶蘭等報道[17]，廣東地區(qū)大腸埃希菌sul1、sul2及sul3基因的檢出率分別為73.8%、74.6%及44.7%。地區(qū)間大腸埃希菌雖對磺胺類藥物均表現(xiàn)較高水平的耐藥性，但耐藥基因的篩查結(jié)果有所不同，可能是由地區(qū)間耐藥性傳遞差異導(dǎo)致。在部分磺胺類藥物耐藥的大腸埃希菌分離株中，并未檢測到sul基因家族，提示可能存在其他耐藥機制介導(dǎo)耐藥，需進(jìn)一步進(jìn)行研究。建議該場根據(jù)藥物敏感性試驗結(jié)果，選用敏感藥物進(jìn)行乳房炎治療，在保證治療結(jié)果的同時降低病原菌耐藥性產(chǎn)生速度。

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PreventiveEffectofPanaxatriSetSaponinsonExpressionofRelatedProteininRatswithAcuteSciaticNerveInjury

SONG Xin-tian1,WANG Lin2,ZHANG Jing-ying1,MENG Ling-yi1,GAO Feng1,ZHANG Kun3

(1.JilinProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Changchun,Jilin,130062,China; 2.JilinCertificationTrainingCenterforFoodandDrug,Changchun,Jilin,130061,China; 3.TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun,Jilin,130000,China)

To investigate the effect of protein expression changes of acute injury of sciatic nerve in rats induced by PTS,the rat sciatic nerve crush injury model was established and were divided into PTS group,model control group and blank control group randomly,10 rats in each group,each group was administered by intraperitoneal injection,than PTS group was injected with PTS after injury,model control group was injected with same dose normal saline,blank control group was injected with same dose normal saline without sciatic nerve injury.30 days after sciatic nerve injury,the effects of PTS on the expressions of NF-M,MAP-2 and GAP-43 in the sciatic nerve of the injured side were observed by immunofluorescence chemical staining,and the effects of PTS on the injured lateral nerve were observed.The expressions of NF-M,MAP-2 and GAP-43 in the sciatic nerve of injured rats were significantly higher than that in the control group (8.21±1.25,11.90±1.14,0.278±0.042),and the mean optical densities (9.66±0.99,12.43±1.44,0.344±0.040) were significantly different (P<0.01).PTS can promote the expressions of NF-M,MAP-2 and GAP-43 in sciatic nerve injury rats.

panaxtrol saponin; sciatic nerve; protein expression; immunohistochemistry; rat

DrugResistanceTestandResistanceGeneDetectionofE.coliIsolatedfromDairyCowMastitisinaDairyFarminJinzhou

YU Chang-yong

(LiaoningCenterforAnimalEpidemicDiseasePreventionandControl,Shenyang,Liaoning110164,China)

S857.26

A

1007-5038(2017)12-0081-05

2017-04-17

于長泳(1978-)，男，遼寧沈陽人，高級獸醫(yī)師，雙學(xué)士，主要從事動物疫病防控工作。*

Abstract:To investigate the drug resistance situation of pathogenic bacteria in clinical mastitis of dairy breeding farm in Jinzhou,the milk were sampled and the pathogenic bacteria were isolated,and drug sensitivity tests were carried out,and resistance genes were screened.The results showed that the main pathogen wasE.coli,36 strains were obtained.And drug sensitivity test showed that isolates were highly resistant to sulfanilamide and sensitive to ceftiofur and cefazolin.The isolation rate ofsul1,sul2 andsul3 resistance genes were 76.0%,17.1% and 0% respectively,suggesting thatsul1 gene was the main resistance gene of sulfonamides inE.coliisolates.

Keywords:dairy cow;mastitis;E.coli; drug sensitivity test; resistance gene