He-Ne激光結(jié)合丹參對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫指標(biāo)的影響

郝金奇，陳 霞，陸改玲，計(jì)晶晶，余艷琴，周 澐

(內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

He-Ne激光結(jié)合丹參對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫指標(biāo)的影響

郝金奇，陳 霞*，陸改玲，計(jì)晶晶，余艷琴，周 澐

(內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

旨在研究激光結(jié)合丹參對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的類(lèi)風(fēng)濕性因子、免疫指標(biāo)、臟器系數(shù)及炎癥因子的變化情況，為治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供參考依據(jù)。用雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)健康雄性Wistar大鼠為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠，造模成功后，隨機(jī)分為5組，于第35天處死大鼠，取大鼠各臟器，稱取其濕重并計(jì)算臟器系數(shù)，檢測(cè)并比較各處理組大鼠血清中類(lèi)風(fēng)濕性因子(RF)、IL-6、IL-1水平及免疫球蛋白水平等。處理組大鼠血清中的免疫指標(biāo)IgA水平丹參結(jié)合激光組高于模型組及其他治療組(P<0.05)，免疫指標(biāo)IgG和IgM水平丹參結(jié)合激光組低于模型組及其他治療組(P<0.05)。與模型組、空白對(duì)照組比較，各處理組大鼠臟器系數(shù)含量降低(P<0.05)。各處理組大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均低于模型組且高于對(duì)照組(P<0.05)?？梢?jiàn)激光結(jié)合丹參對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型具有一定程度的治療效果。

He-Ne激光穴位照射；丹參；類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；免疫學(xué)指標(biāo)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rhenmatoid arthritis,RA)是一種慢性、以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥病變?yōu)橹鞯南到y(tǒng)性、異質(zhì)性疾病。在風(fēng)濕病中危害最大且最難治愈[1-3]。認(rèn)為RA的發(fā)病可能與遺傳、感染以及免疫紊亂等因素有關(guān)，尤其是與白細(xì)胞介素-l(IL-l)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎癥因子有關(guān)。目前治療風(fēng)濕病的常用西藥有免疫抑制劑、非甾抗炎藥、激素等[4]，對(duì)胃、肝腎損傷很大，且不能治本。而常用中藥如雷公藤，青風(fēng)藤也有副作用[5-7]。因此，尋找安全、高效的創(chuàng)新療法成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。風(fēng)濕病屬中醫(yī)“痹癥”，正如清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》中所說(shuō)“痹證有瘀血”。明·李中梓《醫(yī)宗必讀卷十·痹》書(shū)中提到“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”。丹參具有涼血消癰、活血祛瘀、通經(jīng)止痛等功效，研究表明丹參可參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)以及減輕炎癥反應(yīng)，尤其是對(duì)IgA具有活化作用并且可以減少I(mǎi)L-6的分泌[8]。激光對(duì)組織有生物效應(yīng)，能增強(qiáng)新陳代謝、消除腫脹和炎癥、以及鎮(zhèn)痛、改善血液流變學(xué)和微循環(huán)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[9-13]，在治療風(fēng)濕病方面也有報(bào)道[14-18]。通過(guò)He-Ne激光血管內(nèi)照射可以提高T淋巴細(xì)胞數(shù)目和淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，能使免疫球蛋白、補(bǔ)體正?；?，循環(huán)免疫復(fù)合物的水平下降，對(duì)RA有較好治療效果[19]。本文通過(guò)對(duì)健康大鼠注射雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)建立大鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，并觀察丹參及激光照射對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性因子、免疫指標(biāo)、臟器系數(shù)及炎癥因子的影響，以便為臨床治療風(fēng)濕病提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠40只，編號(hào)為Scxk(蒙)2016-0001，8周齡～10周齡，體重180 g～200 g。所有大鼠飼養(yǎng)環(huán)境條件均一，溫度是25℃，自然光線，環(huán)境清潔，標(biāo)準(zhǔn)顆粒鼠糧喂養(yǎng)，水分充足，隨機(jī)分籠，自由活動(dòng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，所有Wistar大鼠試驗(yàn)的方法、檢測(cè)均得到倫理委員會(huì)的認(rèn)可。隨機(jī)分為: A空白對(duì)照組， B模型組，C激光治療組，D丹參治療組，E丹參結(jié)合激光治療組。

1.1.2 主要試劑和儀器 注射用青霉素鈉、丹參注射液、生理鹽水和戊巴比妥鈉粉劑，哈藥集團(tuán)制藥總廠生產(chǎn)；冰醋酸，臺(tái)山市新寧制藥有限公司生產(chǎn)；100 mL/L多聚甲醛，天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠生產(chǎn)；完全弗氏佐劑(CFA)、雞Ⅱ型膠原(CⅡ)、大鼠類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)ELISA檢測(cè)試劑盒，大鼠IL-1ELISA，IL-6ELISA試劑盒，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品； FSH-2型高速勻漿機(jī)，江蘇省環(huán)宇科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；HJ-1B型氦氖激光照射儀，南京激光儀器廠產(chǎn)品；酶標(biāo)分析儀，荷蘭PHILIPS公司產(chǎn)品。

1.2 方法

所有大鼠都通過(guò)腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉按照40 mg/kg體重。將冰醋酸0.05 mL加入到100 mL去離子水中，形成混合溶液a；取一定體積的a溶液加入一定質(zhì)量的雞Ⅱ型膠原得到2 mg/mL的混合溶液b；取一定體積的b溶液再加入相同體積的完全弗氏佐劑在冰浴條件下用高速勻漿機(jī)充分混合，制成混合乳劑c，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ诿恐淮笫笃つw、腳掌、尾部，分點(diǎn)皮內(nèi)注射混合乳劑c(0.3 mL)進(jìn)行類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎造模，并用雙氧水、無(wú)菌生理鹽水沖洗注射針口處，再用碘伏消毒，空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水。每只大鼠腹腔每日注射1次青霉素鈉(每只每次30萬(wàn)單位)預(yù)防感染，連續(xù)注射3 d。在試驗(yàn)第7天進(jìn)行第2次類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎造模，操作同上。

1.2.1 試驗(yàn)分組及藥物治療方案 把40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組(各8只)。A空白對(duì)照組：腹腔注射生理鹽水來(lái)代替造模的誘導(dǎo)乳劑，不給予治療。B模型組：造模成功后，不給予治療；C激光治療組：造模成功后，采用He-Ne激光隔日足三里穴位照射1次，照射時(shí)間為30 min；D丹參治療組：造模成功后，給予0.8 mg/kg丹參腹腔注射治療，隔天1次；E丹參結(jié)合激光治療組：造模成功后，給予0.8 mg/kg丹參腹腔注射治療，隔天1次，并且采用He-Ne激光隔日足三里穴位照射1次，照射時(shí)間為30 min。

1.2.2 He-Ne激光穴位照射 采用He-Ne激光(波長(zhǎng)是632.8 nm)隔日進(jìn)行穴位照射，光斑直徑約4 mm，輸出功率為1.2 mw～1.5 mw，用大鼠固定器固定大鼠，每次照射足三里30 min。足三里在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處[20-21]。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.3.1 大鼠血清中免疫指標(biāo)的測(cè)定 于試驗(yàn)第35天處死大鼠，通過(guò)腹主動(dòng)脈取血5 mL/只，離心、吸取上層血清，分裝，標(biāo)本隨即封凍于-80℃冰柜中待檢，檢測(cè)得各組大鼠血清中IgG、IgA、IgM的含量。

1.2.3.2 臟器系數(shù)測(cè)定 處死大鼠后，取出脾、肝臟、腎臟、心臟和肺臟，以濾紙吸干表面血污，分別于電子天平上稱取濕重，并計(jì)算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=本只大鼠器官濕重/本只大鼠體重)。

1.2.3.3 大鼠血清中炎癥因子及類(lèi)風(fēng)濕性因子的測(cè)量 處死大鼠腹主動(dòng)脈取血5 mL/只，離心、吸取上層血清，分裝，標(biāo)本隨即封凍于-80℃冰柜中待檢。用ELISA法檢測(cè)不同處理組大鼠血清中炎癥因子(IL-1、IL-6)及類(lèi)風(fēng)濕性因子(AF)含量比較，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.1 不同處理對(duì)免疫指標(biāo)的影響

處理組大鼠血清中的免疫指標(biāo) IgA水平丹參結(jié)合激光組高于模型組及其他治療組(P<0.05)，免疫指標(biāo) IgG和 IgM水平丹參結(jié)合激光組低于模型組及其他治療組(P<0.05)，樣本間多重比較LSD結(jié)果顯示IgA模型組低于其他治療組,與模型組大鼠比較，各治療組大鼠血清中IgM、IgG水平均降低(P<0.05)，而激光結(jié)合丹參治療組降低比較明顯，IgA僅丹參結(jié)合激光治療組升高(P<0.05)(表1)。

表1 不同處理組免疫指標(biāo)比較

注：※與空白組比較，*與模型組比較，#與激光組比較(P<0.05)。

Note:※Compared with the blank control group；*compared with the model group；#compared with the laser group(P<0.05).

2.2 不同處理對(duì)臟器系數(shù)的影響

方差分析結(jié)果證實(shí)各處理組大鼠臟器系數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而LSD比較結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，各處理組大鼠臟器系數(shù)含量降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組大鼠比較，各處理組臟器系數(shù)均顯著降低(P<0.05)，而丹參結(jié)合激光治療組降低比較明顯(表2)。

表2 不同處理組臟器系數(shù)比較

注：※與空白組比較，*與模型組比較，#與激光組比較(P<0.05)。

Note:※compared with the blank control group,*compared with the model group,#compared with the laser group(P<0.05).

2.3 不同處理對(duì)大鼠血清中炎癥因子及類(lèi)風(fēng)濕性因子含量的影響

方差分析結(jié)果顯示，各處理組大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，LSD比較結(jié)果顯示與空白對(duì)照組大鼠比較，各處理組血清中IL-1、IL-6及RF含量顯著升高(P<0.05)，與模型組大鼠比較，丹參治療組、激光治療組以及激光結(jié)合丹參治療組大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均顯著降低(P<0.05)，而激光結(jié)合丹參治療組降低比較明顯(表3)。

表3 不同處理組(IL-1、IL-6)及類(lèi)風(fēng)濕性因子(RF)水平比較

注：※與空白組比較，*與模型組比較，#激光組比較(P<0.05)。

Note:※compared with the blank control group,*compared with the model group,#compared with the laser group(P<0.05).

3 討論

3.1 不同處理對(duì)免疫指標(biāo)的影響的分析

IgG是細(xì)細(xì)胞外液和血液中再次免疫應(yīng)答的主要抗體，也是機(jī)體再次免疫應(yīng)答的主要抗體。IgA是參與黏膜局部免疫的主要抗體。IgM是抗原刺激誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體[22]。本試驗(yàn)顯示，處理組大鼠血清中的免疫指標(biāo)IgA水平丹參結(jié)合激光組高于模型組及其他治療組(P<0.05)，免疫指標(biāo) IgG和 IgM水平丹參結(jié)合激光組低于模型組及其他治療組(P<0.05)與研究報(bào)道一致，說(shuō)明體液免疫參與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程[22]。而丹參可以通過(guò)降低ox-LDL、IgG、IgA、IgM的水平恢復(fù)免疫功能[23]。各處理組比較中IgM、IgG水平降低空白對(duì)照組(P<0.05)，丹參治療組、激光治療組以及丹參結(jié)合激光治療組大鼠血清中IgM、IgG水平均低于模型組(P<0.05)，而丹參結(jié)合激光治療組降低比較明顯，而IgA無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可以導(dǎo)致模型組大鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)而出現(xiàn)特異的臨床癥狀與體癥，而丹參在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中具有很好的治療效果，并且He-Ne激光血管內(nèi)照射可以降低血清免疫球蛋白水平[24]。這說(shuō)明激光結(jié)合丹參可以有效的恢復(fù)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的各項(xiàng)免疫指標(biāo)。在本研究中IgA模型組低于丹參結(jié)合激光治療組(P<0.05)，可能與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可以導(dǎo)致模型組大鼠出現(xiàn)比較嚴(yán)重的局部反應(yīng)，經(jīng)過(guò)激光穴位照射治療、丹參治療以及丹參結(jié)合激光治療恢復(fù)到一定程度，其中丹參結(jié)合激光恢復(fù)程度最快。

3.2 不同處理對(duì)臟器系數(shù)影響的分析

動(dòng)物的臟器系數(shù)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[25]。動(dòng)物染毒后受損臟器臟器系數(shù)隨之改變。臟器充血、水腫或增生肥大等會(huì)增大臟器系數(shù)，反之臟器萎縮及其他退行性改變減小臟器系數(shù)。本研究結(jié)果顯示，各處理組大鼠臟器系數(shù)均低于空白對(duì)照組(P<0.05)，模型組大鼠臟器系數(shù)均高于丹參治療組、激光治療組以及丹參結(jié)合激光治療組(P<0.05)，而丹參結(jié)合激光治療組降低比較明顯。說(shuō)明類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎對(duì)肝臟、脾、腎臟、心臟和肺臟都有不同程度的損害，與其他報(bào)道的結(jié)果一致[26]，可能與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎對(duì)某些靶器官損害所導(dǎo)致的，而各治療組的臟器系數(shù)又有所上升，可以證明丹參結(jié)合激光對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有較好的治療作用。

3.3 不同處理對(duì)大鼠血清中炎癥因子及類(lèi)風(fēng)濕性因子含量的影響

類(lèi)風(fēng)濕性因子(RF)主要存在于患者的血清和關(guān)節(jié)液中，是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床診斷的標(biāo)準(zhǔn)。研究認(rèn)為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,在RA 的發(fā)病機(jī)制的研究中,T 淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子IL-1和IL-6在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及對(duì)組織損傷起著重要的作用。目前認(rèn)為IL-1是參與RA 進(jìn)展期關(guān)節(jié)破壞的典型前炎癥細(xì)胞因子，IL-6可增強(qiáng)IL-1的某些生物效應(yīng)。在臨床上，RA患者體內(nèi)促炎細(xì)胞因子IL-1水平升高。本實(shí)驗(yàn)大鼠造模后，IL-1和IL-6水平明顯升高，說(shuō)明該模型與臨床表現(xiàn)的一致性。其他各處理組大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均低于模型組(P<0.05)，各處理組血清中IL-1、IL-6及RF含量高于空白對(duì)照組(P<0.05)，丹參治療組、激光治療組以及激光結(jié)合丹參治療組大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均低于模型組(P<0.05)，而激光結(jié)合丹參治療組降低比較明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與研究報(bào)道一致[23]，分析可能在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可以導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)比較嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，而經(jīng)過(guò)激光結(jié)合丹參治療可以有效降低IL-1、IL-6及RF含量，并且可以有效抑制各炎癥因子的形成，對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有較好的保護(hù)和治療作用。

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EffectsofHe-NeLaserCombinedwithSalviaMiltiorrhizaonImmuneIndicesofRheumatoidArthritisRats

HAO Jin-qi，CHEN Xia，LU Gai-ling，JI Jing-jing，YU Yan-qin，ZHOU Yun

(BaotouMedicalCollege,Baotou，InnerMongolia，014060,China)

To study the changes of organ coefficient，immune indices and inflammatory factors in the model of collagen induced rheumatoid arthritis in rats by Salvia miltiorrhiza combined with laser for providing a new therapy for the treatment of rheumatoid arthritis,the rats were injected with the chicken collagen of typeⅡ for inducing rats rheumatoid arthritis model,and then divided randomly into 5 groups.The changes of organ coefficients，immune indices，rheumatoid factor and inflammatory factors (IL-6,IL-1)were measured.IgA level in serum of rat group with Salvia miltiorrhiza plus laser was higher than that in the model group and other treatment groups (P<0.05),IgG and IgM levels of Salvia miltiorrhiza combined with laser group was lower than that of model group and other treatment groups (P<0.05).Compared with the model group and the blank control group,the organ coefficients of the rats in each treatment group decreased (P<0.05).The contents of IL-1,IL-6 and RF in serum of treatment group were lower than that in model group,and higher than that in control group (P<0.05).It can be seen that Salvia miltiorrhiza combined with laser has a certain degree of therapeutic effect on type II collagen induced rheumatoid arthritis rat model.

He-Ne laser acupoint irradiation; Salvia miltiorrhiza; Rheumatoid arthritis; immunology index

2017-04-26

包頭市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(Wsjj2014014)

郝金奇(1980-)，男，山東菏澤人，講師，碩士，主要從事預(yù)防醫(yī)學(xué)研究。*

S852.4

A

1007-5038(2017)12-0054-05