多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展

李森，王源升，余紅偉，李瑜

1.海軍工程大學(xué) 艦船工程系，湖北 武漢 430033；2.海軍工程大學(xué) 理學(xué)院，湖北 武漢 430033

多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展

李森1，王源升2，余紅偉2，李瑜2

1.海軍工程大學(xué) 艦船工程系，湖北 武漢 430033；2.海軍工程大學(xué) 理學(xué)院，湖北 武漢 430033

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種新型的核酸放大擴(kuò)增技術(shù)。但是，當(dāng)前的LAMP技術(shù)多是在同一個(gè)體系中對(duì)單一目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，限制了其工作效率的發(fā)揮。多重LAMP技術(shù)就是在同一反應(yīng)體系中加入多組針對(duì)不同靶基因的特異性引物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種目標(biāo)基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。我們針對(duì)多重LAMP的優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)其在病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)以及性別篩選等領(lǐng)域的應(yīng)用做簡(jiǎn)要綜述。

多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；快速檢測(cè)；致病微生物

1 LAMP技術(shù)的基本原理及局限性

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸放大擴(kuò)增技術(shù)，由日本榮研公司研究人員所發(fā)明[1]。和傳統(tǒng)的PCR方法相比，LAMP引物可以識(shí)別靶基因序列上的6個(gè)特異性區(qū)域。內(nèi)引物FIP由F1c和F2區(qū)域構(gòu)成，F(xiàn)2區(qū)域和靶基因序列的F2c區(qū)域完美互補(bǔ)；BIP由B1c和B2組成，B2區(qū)域與靶基因的B2c區(qū)域完美互補(bǔ)；內(nèi)引物與靶基因的響應(yīng)區(qū)域雜交結(jié)合后，在Bst聚合酶的作用下開(kāi)始鏈的合成，由此觸發(fā)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；接下來(lái)，外引物F3/B3分別與F3c和B3c結(jié)合，各自合成出1條單鏈進(jìn)而置換出內(nèi)引物合成的2條單鏈，由于這2條鏈的5′端各自有互補(bǔ)的區(qū)域，因此各自會(huì)形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)；隨后在另一條外引物的作用下，另一端也形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由此形成了LAMP反應(yīng)的初始啞鈴結(jié)構(gòu)[2]。

通過(guò)以自身結(jié)構(gòu)為模板，以3′端的F1區(qū)域?yàn)槠瘘c(diǎn)，內(nèi)引物的F1c區(qū)域與啞鈴結(jié)構(gòu)的F1區(qū)域結(jié)合，F(xiàn)2區(qū)域和F2c區(qū)域結(jié)合，由此觸發(fā)循環(huán)鏈置換放大擴(kuò)增反應(yīng)，同樣BIP與啞鈴結(jié)構(gòu)的另一端莖環(huán)結(jié)構(gòu)的B2c區(qū)域互補(bǔ)，啟動(dòng)下一輪擴(kuò)增放大。由此周而復(fù)始，至LAMP反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增體系里產(chǎn)生了大量由相同特異性序列的反向重復(fù)片段組成的DNA片段混合物。除了4條內(nèi)引物之外，環(huán)引物的加入可以加快反應(yīng)的擴(kuò)增速率，但并不是LAMP反應(yīng)所必需的[3]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的擴(kuò)增效率使得擴(kuò)增產(chǎn)物在15～60 min就可以達(dá)到初始模板量的109～1010倍[4]。

LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，由于LAMP產(chǎn)物是大小長(zhǎng)短不一的重復(fù)序列，因此可以觀察到大小不同的階梯條帶。產(chǎn)物的終點(diǎn)檢測(cè)還可以通過(guò)加入Sybr GreenⅠ、HNB等核酸染料來(lái)進(jìn)行觀察。由于LAMP的擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量焦磷酸根，加上反應(yīng)體系中存在的鎂離子，可以形成肉眼可見(jiàn)的白色沉淀[5]，據(jù)此榮研公司發(fā)明了基于此原理的濁度儀，從而實(shí)現(xiàn)了LAMP反應(yīng)的實(shí)時(shí)觀察檢測(cè)。除此之外，基于生物發(fā)光技術(shù)、雙鏈嵌入式熒光染料和熒光修飾探針等技術(shù)都可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)LAMP檢測(cè)[6]。

LAMP技術(shù)具有快速準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便高效、特異性強(qiáng)及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方便的特點(diǎn)，可廣泛用于細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)的篩選識(shí)別等領(lǐng)域[7-10]。但是，LAMP技術(shù)多在同一個(gè)體系中對(duì)一個(gè)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，限制了其工作效率的發(fā)揮和檢測(cè)范圍的擴(kuò)展。多重LAMP技術(shù)就是在同一反應(yīng)體系中加入多組針對(duì)不同目標(biāo)基因的特異性引物，克服了LAMP一次反應(yīng)只能檢測(cè)一種目標(biāo)物的局限，從而對(duì)多種目標(biāo)基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，有效提高了檢測(cè)效率，擴(kuò)展了檢測(cè)范圍，節(jié)約了檢測(cè)成本。

2 多重LAMP（m-LAMP）技術(shù)的應(yīng)用

2.1 多重LAMP技術(shù)在病毒鑒定中的應(yīng)用

LAMP技術(shù)發(fā)明之后就廣泛應(yīng)用于病毒的篩選鑒定。流感病毒每年冬春季節(jié)會(huì)引起3～8周的大面積傳播，傳染性強(qiáng)，傳播迅速，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，具有很高的發(fā)病率和死亡率。由于各種流感病毒的發(fā)病癥狀都很類似，發(fā)病程度從溫和的上呼吸道感染到全身性肺炎癥狀不等，因此難以區(qū)分不同的毒株，須借助于實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)來(lái)進(jìn)行病原分析，所以很有必要發(fā)展一種快捷有效地區(qū)分不同流感病毒的檢測(cè)技術(shù)。Mahony[11]提出了一種m-LAPM技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)A型流感H1、H3和B型流感病毒的快速診斷。此研究設(shè)計(jì)了3套引物分別針對(duì)A型流感的2個(gè)亞型H1、H3和B型流感病毒的保守序列，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光和熔解曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)這幾種流感病毒的區(qū)分。

小麥黃花葉病毒、土傳小麥花葉病毒和中國(guó)小麥花葉病毒是常見(jiàn)的小麥病害，為了檢測(cè)這3種小麥病毒害，需要一種精確有效的檢測(cè)方法。一些傳統(tǒng)方法已被應(yīng)用，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）和RT-PCR。雖然ELISA經(jīng)濟(jì)有效，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測(cè)限較低。RT-PCR靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但需要純化和從樣品中提取RNA，在一定程度上限制了其應(yīng)用推廣。Fukuta[12]等發(fā)展了一種新穎的RT-LAMP技術(shù)，通過(guò)監(jiān)控核酸擴(kuò)增和退火過(guò)程的實(shí)時(shí)熒光變化來(lái)同時(shí)檢測(cè)這3種病毒。病毒RNA的提取純化在RT-PCR的分析中是很重要的一步，費(fèi)事費(fèi)力且步驟繁瑣。由于LAMP擴(kuò)增所需的Bst聚合酶不易受植物組織提取物的抑制，因此樣品的初步RNA提取物即可用于RT-LAMP。多重RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果表明，不同病毒的熔解曲線呈現(xiàn)不同的熔解溫度峰值，由此可以分析鑒定這幾種不同的病毒。

口蹄疫病毒是一種急性傳染性病毒，可以感染家養(yǎng)反芻動(dòng)物、豬和超過(guò)70種野生動(dòng)植物。Yamazaki[13]建立了一種典型的實(shí)時(shí)熒光多重RTLAMP分析方法用于檢測(cè)口蹄疫病毒，第一次報(bào)道了RT-LAMP方法可用于高序列變異性的RNA病毒的檢測(cè)。為了克服遺傳多樣性，該體系將新設(shè)計(jì)的4套引物與之前報(bào)道的2套引物結(jié)合起來(lái)檢測(cè)口蹄疫病毒。通過(guò)實(shí)時(shí)濁度儀，將300個(gè)樣本的擴(kuò)增結(jié)果與RT-PCR結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，RTLAMP的靈敏度明顯優(yōu)于RT-PCR方法。

呼吸道合胞病毒（RSV）是年輕人和老年人上下呼吸道感染的主要誘因，也是未滿2歲的嬰兒罹患毛細(xì)支氣管炎和下呼吸道感染的最重要的一個(gè)原因。成人感染RSV的癥狀通常是溫和的，但老年人和免疫功能嚴(yán)重低下的患者感染之后會(huì)導(dǎo)致病情惡化。Mahony[14]建立了m-LAPM方法快速檢測(cè)A、B亞型RSV。分別針對(duì)RSV的矩陣基因和B亞型RSV的聚合酶基因設(shè)計(jì)了6條引物，觀察實(shí)時(shí)熒光曲線和熔解溫度曲線來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分析鑒定。通過(guò)對(duì)275個(gè)鼻咽組織樣本的測(cè)試，將m-LAMP技術(shù)與PCR進(jìn)行了對(duì)比。優(yōu)化后的m-LAMP方法平均擴(kuò)增時(shí)間僅為14.2 min，而PCR需要90～120 min。通過(guò)樣本處理制備，大概30 min即可完成RSV的檢測(cè)。本方法快速便捷，是目前已知最快的針對(duì)RSV的檢測(cè)方法。今后通過(guò)與微流控技術(shù)相結(jié)合，可以快速應(yīng)用于臨床檢測(cè)等領(lǐng)域。

Liu[15]建立了一種m-LAPM方法，可同時(shí)檢測(cè)2種菊花致病病毒CVB和CSVd，檢測(cè)限只有傳統(tǒng)PCR方法的1/1000。此方法不僅可以對(duì)致病病毒的感染情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，也可以快速啟動(dòng)控制流行病毒傳播的應(yīng)急措施。

2.2 多重LAMP技術(shù)在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用

細(xì)菌的篩選鑒定在臨床檢驗(yàn)中具有重要意義，約78%的上呼吸道感染者在送診后受到不恰當(dāng)?shù)目股刂委?，相信抗生素可以預(yù)防繼發(fā)性細(xì)菌感染，但80%的上呼吸道感染卻是由病毒引起的，而抗生素對(duì)于病毒引起的上呼吸道感染并沒(méi)有什么用。更重要的是，抗生素的濫用提高了細(xì)菌的耐藥性，導(dǎo)致越來(lái)越多耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)。因此，通過(guò)有效方法實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌引起的上呼吸道感染的定性和定量分析是至關(guān)重要的。Luo[16]創(chuàng)造性地結(jié)合LAMP和微流控芯片技術(shù)，以特異保守基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，建立了單重、多重、定性、定量和集成LAMP微流控芯片，并應(yīng)用于肺炎桿菌、甲型流感病毒和肺結(jié)核桿菌等重大傳染性病原體的快速診斷和分型。該系統(tǒng)將來(lái)有望應(yīng)用于上呼吸道感染的快速診斷鑒別，從而有效減少抗生素的濫用。

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌是一種引發(fā)胃腸道疾病的致病菌，感染后可能會(huì)導(dǎo)致危及生命的后遺癥，因此，志賀毒素基因stx1和stx2一直是檢測(cè)的重點(diǎn)。Yoshihiro[17]發(fā)展了一種雙重LAMP檢測(cè)策略用于檢測(cè)產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的stx1和stx2基因。stx1基因的一條引物標(biāo)記了熒光基團(tuán)，另一個(gè)基因stx2的引物未標(biāo)記?；贔RET的原理，如果stx1基因序列被大量擴(kuò)增，熒光標(biāo)記的引物與嵌入型染料溴化乙錠結(jié)合，導(dǎo)致熒光降低，而stx2基因序列擴(kuò)增時(shí)游離溴化乙錠大量減少，體系中的熒光增強(qiáng)，由此可用于stx1和stx2基因的檢測(cè)。

引起腹瀉的食源性胃腸疾病是一個(gè)世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題，而其中大部分都是由沙門菌和志賀菌引起的。Shao等[18]建立了一種m-LAMP方法，用于對(duì)牛奶中的沙門菌和志賀菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。在此實(shí)驗(yàn)體系中，分別針對(duì)沙門菌的invA基因和志賀菌的ipaH基因設(shè)計(jì)了2套引物。與傳統(tǒng)的PCR方法1 pg DNA/反應(yīng)的檢測(cè)限相比，此方法對(duì)沙門菌和志賀菌基因組DNA的檢測(cè)限低至100 fg DNA/反應(yīng)。

酵母菌常用于食品和飲料的發(fā)酵，但它們也可能導(dǎo)致食物腐壞。食品腐壞是食品行業(yè)的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，為了避免潛在的健康危害，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)致病菌是食品工業(yè)對(duì)消費(fèi)者的一項(xiàng)重要責(zé)任。Kasahara[19]開(kāi)發(fā)了同時(shí)檢測(cè)3種致病性酵母菌的m-LAPM反應(yīng)體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了在同一反應(yīng)體系中，在相同的引物濃度條件下，多重引物的擴(kuò)增速率一般情況明顯慢于單重LAMP條件下的擴(kuò)增速率，由此發(fā)現(xiàn)引物之間的相互干擾在一定程度上影響了等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。在m-LAPM反應(yīng)體系中，對(duì)單一菌株目標(biāo)DNA的檢測(cè)靈敏度與單重LAMP體系相當(dāng)。

2.3 多重LAMP技術(shù)在寄生蟲(chóng)檢測(cè)中的應(yīng)用

蟲(chóng)媒傳染病，如瘧疾和絲蟲(chóng)病，在世界上大部分地區(qū)廣泛流行并威脅人類的健康。蚊子是寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和病毒等各種致病性病原體的重要載體，會(huì)感染包括人類在內(nèi)的多種宿主。但一只蚊子體內(nèi)可以攜帶多種致病性病原體，需要快速高效地得到同時(shí)檢測(cè)。Aonuma[20]通過(guò)設(shè)計(jì)熒光標(biāo)記引物，利用m-LAMP方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)波格鼠瘧原蟲(chóng)和犬惡絲蟲(chóng)的同時(shí)檢測(cè)。

牛貝巴蟲(chóng)病是在一種在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛傳播的重要蜱傳類疾病，主要由2種牛紅細(xì)胞內(nèi)的原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)牛貝巴蟲(chóng)和牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)引起。雖然這2種寄生蟲(chóng)引起的臨床癥狀相似，表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血和黃疸，但牛貝巴蟲(chóng)引發(fā)的癥狀遠(yuǎn)比牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)的更嚴(yán)重。急性感染寄生蟲(chóng)病通常通過(guò)血涂片鏡檢確診，而亞臨床感染應(yīng)通過(guò)血清學(xué)進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)PCR方法也顯示了較高的效率和靈敏度，但需要昂貴的儀器和專業(yè)技術(shù)人員。Iseki[21]開(kāi)發(fā)了2套針對(duì)牛貝巴蟲(chóng)和牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)的引物，并加入了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在擴(kuò)增完成之后進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)這2種寄生蟲(chóng)的區(qū)分。

2.4 多重LAMP技術(shù)在性別鑒定中的應(yīng)用

在畜牧業(yè)中，胚胎移植前的性別鑒定有利于增加所需性別的動(dòng)物數(shù)量。Khamlor[22]分別針對(duì)2塊不同的染色體區(qū)域設(shè)計(jì)了2套引物，S4區(qū)域是雄性胚胎Y染色體所特有的，另一塊區(qū)域是雌雄胚胎所共有的，被用來(lái)作為內(nèi)部控制，以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。S4區(qū)域的環(huán)引物特別修飾了熒光染料ROX，而共有基因區(qū)域的2條環(huán)引物都修飾了FITC染料。此研究在反應(yīng)管的蓋子上放置了陽(yáng)離子聚合物，反應(yīng)后搖勻即可顯色，綠色沉淀表明只有控制DNA存在，沒(méi)有Y染色體，而橙色沉淀表示這2個(gè)目標(biāo)基因都存在。本方法不需要復(fù)雜的儀器，通過(guò)顯色反應(yīng)即實(shí)現(xiàn)了對(duì)雌雄胚胎的肉眼檢測(cè)。

對(duì)植物的育種與產(chǎn)果，性別決定是最重要的因素之一。番木瓜的性別類型可分為雌雄同體、雄性和雌性。雄花不結(jié)果實(shí)，與雌雄同體相比，雌花的果實(shí)比較少肉，而且包含更多的種子。為了確保作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，就需要產(chǎn)出更多的雌雄同體植株。但由于顯性純合致死，全部雌雄同體的番木瓜種子也不可能存在。因此，Hsu[23]針對(duì)6個(gè)雄性-雌雄同體的特異標(biāo)記物開(kāi)發(fā)了m-LAMP技術(shù)，可以有效精確地篩選在幼苗期或生長(zhǎng)前期的雌雄同體個(gè)體。

3 結(jié)語(yǔ)

LAMP技術(shù)以其方便快捷、簡(jiǎn)便高效、特異性強(qiáng)及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方便的特點(diǎn)，近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用。m-LAPM技術(shù)在傳統(tǒng)LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了在同一體系中對(duì)多個(gè)目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)。但是，m-LAPM由于反應(yīng)體系存在多種特異性引物，不可避免地產(chǎn)生了引物間互相干擾等問(wèn)題。同時(shí)，由于敏感度極高，假陽(yáng)性問(wèn)題也極其容易出現(xiàn)。

隨著與微流控技術(shù)、芯片實(shí)驗(yàn)室和毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)室等微型實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的結(jié)合，m-LAPM的反應(yīng)體系也越來(lái)越微型化和自動(dòng)化[24-25]。微型實(shí)驗(yàn)室技術(shù)在加樣、樣本提取、反應(yīng)體系構(gòu)建等方面的優(yōu)良特性，為m-LAPM技術(shù)提供了技術(shù)支撐，未來(lái)m-LAPM技術(shù)也將朝著更少試劑消耗、更多樣本加載和更低檢測(cè)下限的方向發(fā)展，在一定程度上也將大大降低非特異性擴(kuò)增和核酸污染的幾率。以LAMP技術(shù)為基礎(chǔ)的新型核酸放大檢測(cè)將有更高的可靠性及更廣闊的應(yīng)用前景。

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Development of the Multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification Technology

LI Sen1,WANG Yuan-Sheng2*,YU Hong-Wei2,LI Yu2
1.Department of Naval Architecture Engineering,Naval University of Engineering,Wuhan 430033;2.College of Science,Naval University of Engineering,Wuhan 430033;China

Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）is a novel nucleic acid amplification technique.The present LAMP method employed a set of primers which recognize a total of six regions of the target DNA.In the multiplex LAMP reaction system,many sets of LAMP primers were designed to specifically detect target genes. This paper focused on the application of multiplex LAMP in the detection of virus,bacteria,parasites and sex se?lection.

multiplex LAMP;rapid detection;pathogenic microorganisms

Q81

A

1009-0002（2017）02-0217-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.030

2016-09-01

李森（1989-），男，博士研究生

王源升，（E-mail）qianxun8965@163.com

*Correspinding author,E-mail:qianxun8965@163.com